專利名稱：用于檢測腫瘤的量子點試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域，涉及一種用于檢測腫瘤的量子點試劑盒，尤其涉及一 種檢測腫瘤細胞和腫瘤組織的量子點試劑盒。
背景技術(shù)：
檢測腫瘤細胞需要一個能特異性識別腫瘤標志物的抗體或配體，以及連接在抗體 或配體上的標記物(如熒光染料或同位素示蹤劑)，連接熒光或同位素示蹤劑的抗體或配 體，謂之“檢測探針”。對于可識別多種腫瘤細胞的廣譜檢測探針，探針上的抗體或配體的選 擇尤為重要。為此，本發(fā)明選擇了針對表皮生長因子受體的單克隆抗體作為檢測探針的一 部分。表皮生長因子受體(印i dermal growth factor receptor, EGFR)是由原癌基因 c2erbB21編碼的I型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體。EGFR在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、 腦癌、膀胱癌、頭頸部腫瘤、卵巢癌、腎癌和前列腺癌等多種腫瘤中均存在突變或高表達， 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。迄今已發(fā)現(xiàn)至少有8種EGFR突變體，其中EGFRvIII (EGFR variant III)是EGFR最常見的突變類型，鑒于EGFRvIII在某些腫瘤中的表達及其在正常 組織中的表達缺乏，EGFRvIII常被作為腫瘤治療的理想靶點。本發(fā)明的申請人之一在其在先公開文件中國公開號CN101602808A中公開了一種 特異性結(jié)合蛋白及其使用，具體提供了一種特異性與EGRFvIII或細胞過量表達的EGFR結(jié) 合的單克隆抗體(12H23抗體)及其制備方法，提供了該單克隆抗體乂11鏈重鏈的互補決定 區(qū)CDR的氨基酸序列和單克隆抗體\鏈重鏈的互補決定區(qū)CDR的氨基酸序列。本發(fā)明在該已公開的特異性結(jié)合EGRFvIII或細胞表面過量表達的EGFR的單克隆 抗體的基礎(chǔ)上進行進一步的探索，以求提供一種更便于臨床上識別腫瘤細胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種檢測腫瘤細胞和腫瘤組織的量子點試劑盒。本發(fā)明所要解決的再一技術(shù)問題在于提供上述量子點試劑盒的用途。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是一種用于檢測腫瘤的量子點試劑 盒，在盒子中裝有插片，插片上設(shè)有多個供試劑管插入的孔，其中，所述的試劑盒中包括12 管裝有不同材料的試劑管，包括(1)單克隆抗體1邪23粉末，5 10mg ；(2)經(jīng)表面修飾的量子點水溶液，1 2mL ；(3)量子點納米球粉末，20 200mg ；(4)正硅酸乙酯溶液，1 3mL ；(5)戊二醛溶液，1 3mL ；(6)硅烷化試劑溶液，1 3mL ；(7)帶羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂粉末，5 10mg ；
(8)1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽粉末，0.5 lg;(9)聚丙烯酸，10 200mg ；(10)無水乙醇，1 3mL ；(11)磷酸鹽緩沖液，20 40mL ；(12)滅菌雙蒸水，10 20ml。本發(fā)明中連接在量子點熒光染料上的12H23是特異性靶向EGFRvIII和過量表達 的EGFR的單克隆抗體，與其它針對EGFR的靶向性藥物類似，單抗12H23特異性與EGFRvIII 陽性表達或過量表達EGFR的腫瘤細胞結(jié)合后，將阻斷細胞的信號轉(zhuǎn)導，在識別腫瘤細胞的 同時，抑制腫瘤細胞的生長。而本發(fā)明中的熒光染料選用量子點，量子點是一種直徑在1 10納米之間的半導 體納米微晶，是一種近年來研究較多的新型熒光染料。與傳統(tǒng)有機熒光染料相比，量子點的 熒光更穩(wěn)定持久，熒光強度更高，激發(fā)光譜更寬，熒光發(fā)射光譜更窄。前已述及，單抗12H23能特異性地識別腫瘤細胞，而對正常細胞不識別或親和力 非常弱，因此，當連接量子點的單抗12H23與未知細胞(或未知組織)作用后，可通過細胞 (或組織)中是否結(jié)合熒光量子點來判斷是腫瘤細胞(或腫瘤組織)還是正常細胞(或正 常組織)?？梢?，單抗12H23與量子點連接，可作為檢測多種腫瘤的生物探針，可以組成試劑 盒為研究者提供方便。在上述方案的基礎(chǔ)上，所述的12H23單克隆抗體，為特異性靶向表皮生長因子受 體中EGFRvIII型突變體或細胞表面過量表達的EGFR的單克隆抗體。即為中國公開號 CN101602808A所公開的單克隆抗體。在上述方案的基礎(chǔ)上，在第(2)試劑管內(nèi)，所述量子點的表面修飾有巰基乙酸、巰 基丙酸、二巰基丁二酸、巰基乙胺、白蛋白、纖維素、聚苯乙烯、聚乙二醇、磷脂、二氧化硅中 的一種或幾種。在上述方案的基礎(chǔ)上，在第(2)和第(3)試劑管內(nèi)，所述的量子點為CdSe、CdTe、 CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdSe、InP、InAs、InGaAs、InGaP、InGaP/ZnS 中的一種納米粒子 或任意幾種納米粒子的組合。在上述方案的基礎(chǔ)上，在第(3)試劑管內(nèi)，所述納米球粉末，是指量子點包埋在白 蛋白、乙基纖維素、聚苯乙烯任一聚合物中所形成的粉末，納米球粒度為50 lOOOnm。在上述方案的基礎(chǔ)上，在第(6)試劑管內(nèi)，所述的硅烷化試劑為CH2 = CHSi(0C2H5)3，CH2 = CHSi(0CH3)2, CH2 = CHSi (0C2H40CH3) 3，CH2 = C(CH3) C00C3H6Si (0CH3) 3, HSC3H6Si (0CH3) 3，H2NC3H6Si (0C2H5) 3, H2NC2H4NHC3H6Si (0CH3) 3, H2NC0NHC3H6Si (0C2H5) 3, CH3Si (0C2H5) 3，(CH3) 3SiNHSi (CH3) 3 中的一種。在上述方案的基礎(chǔ)上，在第(7)試劑管內(nèi)，所述的帶羧基的聚乙二醇衍生化的磷 脂中，聚乙二醇的分子量在1800 6000。優(yōu)選聚乙二醇的分子量在2000左右。針對上述的量子點試劑盒的用途，用于檢測腫瘤細胞和腫瘤組織。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明將特異性靶向EGFRvIII/過量表達的EGFR的單克隆抗體12H23與熒光染 料量子點及連接試劑組成試劑盒，在應(yīng)用中將12H23單克隆抗體與熒光染料量子點相連 接，連接量子點的12H23單克隆抗體與未知細胞或未知組織作用后，可通過細胞或組織中是否結(jié)合熒光量子點來判斷是腫瘤細胞或腫瘤組織還是正常細胞或正常組織，該試劑盒在 臨床上具有實用價值。
具體實施例方式實施例一種用于檢測腫瘤的量子點試劑盒，在盒子中裝有插片，插片上設(shè)有多個供試劑 管插入的孔，所述的試劑盒中包括12管裝有不同材料的試劑管，為(1) 10mg單克隆抗體12H23粉末；(2)2mL濃度約為1. 2 y moL/L表面修飾有巰基丙酸的紅色熒光CdTe/ZnS量子點水 溶液，在水溶液中該量子點表面電位為-35 -40meV ；(3) 50mg平均粒度為500nm的包埋CdTe/ZnS量子點的牛血清白蛋白(BSA)納米球 粉末(CdTe/ZnS/BSA nanospheres)；(4) lml的正硅酸乙酯溶液；(5) lml的戊二醛溶液；(6) lml的硅烷化試劑溶液(KH550)；(7) 10mg帶羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂(PE-PEG2_-C00H)粉末，其中聚乙烯醇 的分子量約為2000 ；(8) lg 1-乙基-3 (3- 二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)粉末；(9) 50mg聚丙烯酸粉末；(10) lml 無水乙醇；(11) 20ml磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 4 ；(12) 10ml滅菌雙蒸水。應(yīng)用例1針對實施例中的試劑盒，量取CdTe/ZnS量子點(QDs)水溶液400 u L，向其中加入 無水乙醇與正硅酸乙酯的混合溶液40 y L (無水乙醇占混合溶液總量的25 % )，室溫下振蕩 48h后停止振蕩，置于4°C冰箱中備用。向上述包硅量子點(QDs/Si02)水溶液中加入硅烷化試劑溶液(KH550)和 戊二醛(glutaraldehyde)的磷酸鹽緩沖溶液，于室溫下振蕩2h后，獲得(QDs/ Si02)-KH550_glutaraldehydeo將單克隆抗體12H23溶解于磷酸鹽緩沖液中，向(QDs/ Si02) -KH550-glutaraldehyde水溶液(200 u L)中加入單克隆抗體12H23的磷酸鹽緩沖液， 其中，QDs/Si02與12H23的摩爾比約為1 5，于4°C條件下振蕩過夜后，即獲得(QDs/Si02 )-KH550-glutaraldehyde-12H23，然后與200 u L的不含血清的細胞培養(yǎng)液(RPMI-1640)混 合，置于4°C冰箱中備用。將貼壁培養(yǎng)的肝癌細胞SMMC-7721 (內(nèi)源性表達EGFRvIII，參見文獻HuamaoWang， Hua Jiang, Min Zhou, Zhibing Xu,Shiguo Liu,Bizhi Shi, Xiao Yao, Ming Yao, JianRen Gu,Zonghai Li,Epidermal Growth Factor Receptor vlllenhances tumorigenicity and resistance to 5—Fluorouracil in HumanHepatocellular Carcinoma. Cancer letter 2009,279(1) 30-8)中的培養(yǎng)基移去，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，然后向細胞中加入200 y L分散在不含血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中的(QDs/Si02)-KH550-glutaraldehyde-12H23，于 37°C的C02培養(yǎng)箱中培育lh，移去細胞中的溶液，并用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞8次以上。然 后與熒光顯微鏡下觀察。對照實驗按上述相同的方法將(QDs/Si02)-KH550-glutaraldehyde_12H23與白血病細胞 K562共培育和熒光顯微鏡下觀察。此外，按上述相同的方法將未連接抗體12H23的量子點 ((QDs/Si02) -KH550-glutaraldehyde)與肝癌細胞SMMC-7721共培育和熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與(QDs/Si02)-KH550-glutaraldehyde_12H23共培育后的每個肝癌細 胞 SMMC-7721 均有大量的量子點紅色熒光，而與(QDs/Si02)-KH550-glutaraldehyde-12H23 共培育后的白血病細胞K562 (K562是不表達EGFR的細胞)以及與(QDs/ Si02) -KH550-glutaraldehyde共培育的肝癌細胞SMMC-7721卻只有非常少的量子點紅色熒 光，大部分沒有量子點紅色熒光。可見，本發(fā)明提供的量子點試劑盒能很好地特異性識別表 達EGFRvIII的腫瘤細胞。應(yīng)用例2針對實施例中的試劑盒，將5mg的帶羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂 (PE-PEG2_-C00H)溶解于5ml三氯甲烷溶液中(考慮到三氯甲烷為常用溶劑，因此不作為 試劑盒的一部分)，取該溶液1ml (剩余4ml于4°C冰箱中保存?zhèn)溆?置于梨形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)揮去三氯甲烷成薄膜，進一步用氮氣吹干薄膜。向該薄膜中加入CdTe/ZnS量子點(QDs)水溶液1ml，超聲波振蕩45min，獲 得QDs- (PE-PEG2_-C00H)。加入1_乙基_3 (3- 二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)的磷酸鹽緩沖液，30min后，加入單克隆抗體12H23，其中，三者間的摩爾比為 QDs-(PE-PEG2_-C00H) EDC 12H23 = 1 3. 6 3，在 4°C反應(yīng)過夜。將獲得的連接單克隆抗體12H23的量子點與不含血清的培養(yǎng)基RPMI-1640混合， 加入到貼壁培養(yǎng)的乳腺導管癌細胞MDA-MB-435S(過表達EGFR的細胞)中共培育lh。作為 對照，將未連接單克隆抗體12H23的量子點(QDs-(PE-PEG2_-C00H)與MDA-MB-435S細胞按 上述相同方法共培育。結(jié)果為，連接單克隆抗體12H23的量子點幾乎與所有MDA_MB_435S細胞結(jié)合，細胞 有明亮的紅色熒光。而對照實驗中，只有少量的紅色熒光。這些結(jié)果表明12H23連接的量 子點能有效識別過表達EGFR的腫瘤細胞。應(yīng)用例3針對實施例中的試劑盒，稱取包埋CdTe/ZnS量子點(QDs)的牛血清白蛋白(BSA) 納米球粉末(QDs-BSA) 10mg，分散于1ml滅菌雙蒸水中，超聲波分散約15min后，向其中加入 聚丙烯酸(PAA)粉末，繼續(xù)超聲波分散，約30min后，靜置約lOmin，然后離心，用滅菌雙蒸水 洗滌沉淀，獲得(QDs-BSA) /PAA納米球，再分散于磷酸鹽緩沖液中。向(QDs-BSA) /PAA溶液中加入1_乙基_3 (3_ 二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)的磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)30min后，加入單克隆抗體12H23，其中，(QDs-BSA)/PAA納米 球與單克隆抗體12H23的摩爾比約為1 1000，4°C反應(yīng)過夜。然后進行與應(yīng)用例2相同的 細胞實驗。熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，連接抗體的納米球與SMMC-7721腫瘤細胞共培育后，細胞表面有大量的顆粒較大的熒光粒子。未連接抗體的納米球與SMMC-7721腫瘤細胞共培育后， 細胞表面僅有少量的熒光顆粒，很多細胞的表面則未發(fā)現(xiàn)有量子點的熒光?？梢姡景l(fā)明 提供的量子點試劑盒中的納米球，在連接抗體后，可以很好地識別表達EGFRvIII或過表達 EGFR的腫瘤細胞，而不與不表達EGFR的腫瘤細胞結(jié)合。
權(quán)利要求
一種用于檢測腫瘤的量子點試劑盒，在盒子中裝有插片，插片上設(shè)有多個供試劑管插入的孔，其特征在于所述的試劑盒中包括12管裝有不同材料的試劑管，為(1)單克隆抗體12H23粉末，5～10mg；(2)經(jīng)表面修飾的量子點水溶液，1～2mL；(3)量子點納米球粉末，20～200mg；(4)正硅酸乙酯溶液，1～3mL；(5)戊二醛溶液，1～3mL；(6)硅烷化試劑溶液，1～3mL；(7)帶羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂粉末，5～10mg；(8)1-乙基-3(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽粉末，0.5～1g；(9)聚丙烯酸，10～200mg；(10)無水乙醇，1～3mL；(11)磷酸鹽緩沖液，20～40mL；(12)滅菌雙蒸水，10～20ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測腫瘤細胞的量子點試劑盒，其特征在于所述的 12H23單克隆抗體，為特異性識別表皮生長因子受體中EGFRvIII型突變體或過量表達的表 皮生長因子受體的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測腫瘤細胞的量子點試劑盒，其特征在于在第 (2)試劑管內(nèi)，所述量子點的表面修飾有巰基乙酸、巰基丙酸、二巰基丁二酸、巰基乙胺、白 蛋白、纖維素、聚苯乙烯、聚乙二醇、磷脂、二氧化硅中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測腫瘤細胞的量子點試劑盒，其特征在于在第(2)和第(3)試劑管內(nèi)，所述的量子點為CdSe、CdTe、CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdSe、InP、 InAs、InGaAs、InGaP、InGaP/ZnS中的一種納米粒子或任意幾種納米粒子的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測腫瘤細胞的量子點試劑盒，其特征在于在第(3)試劑管內(nèi)，所述納米球粉末，是指量子點包埋在白蛋白、乙基纖維素、聚苯乙烯任一聚合 物中所形成的粉末，納米球粒度為50 lOOOnm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測腫瘤細胞的量子點試劑盒，其特征在于在 第(6)試劑管內(nèi)，所述的硅烷化試劑為CH2 = CHSi(0C2H5)3，CH2 = CHSi(0CH3)2，CH2 = CHSi (0C2H40CH3)3，CH2 = C (CH3) C00C3H6Si (0CH3)3, HSC3H6Si (0CH3)3, H2NC3H6Si (0C2H5)3, H2NC2H4NHC3H6Si(0CH3)3，H2NC0NHC3H6Si (0C2H5) 3, CH3Si (0C2H5) 3, (CH3) 3SiNHSi (CH3) 3 中的一 種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測腫瘤細胞的量子點試劑盒，其特征在于在 第(7)試劑管內(nèi)，所述的帶羧基的聚乙二醇衍生化的磷脂中，聚乙二醇的分子量在1800 6000。
8.針對權(quán)利要求1至7之一所述的量子點試劑盒的用途，其特征在于用于檢測腫瘤 細胞和腫瘤組織。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測腫瘤細胞或腫瘤組織的量子點試劑盒。試劑盒中的主要成分包括多種表面修飾的量子點和量子點納米球，能特異性識別表皮生長因子受體中EGFRvIII型突變體或過量表達的表皮生長因子受體的單克隆抗體12H23，以及連接試劑等。在表面修飾的量子點及量子點納米球表面連接單克隆抗體12H23之后，可以很好地識別表達EGFRvIII或過表達EGFR的腫瘤細胞，而不與不表達EGFR的腫瘤細胞結(jié)合。未連接抗體12H23的量子點及量子點納米球與腫瘤細胞不結(jié)合或結(jié)合很少。本發(fā)明提供的這種試劑盒，在腫瘤診斷中有應(yīng)用前景。
文檔編號G01N21/64GK101876659SQ201010212388
公開日2010年11月3日 申請日期2010年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者儲茂泉, 李宗海, 石必枝 申請人:同濟大學;上海市腫瘤研究所