專利名稱:中華鱘實時熒光pcr檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及中華鱘(Acipenser Sinensis)的核酸檢測試劑盒及其檢測方法,屬于 生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
中華鱘(Acipenser Sinensis)是中國特有的古老珍稀魚類和世界現(xiàn)存魚類中 最原始的種類之一,距今有一億四千萬年的歷史,被譽為“水中的大熊貓”、“活化石”,現(xiàn)為 國家一級保護動物,國際自然保護聯(lián)盟(IUCN)紅色名錄瀕危種,世界野生生物貿(mào)易公約 (CITES)附錄 II ·鑒于國家對中華鱘捕撈行為的明令禁止,目前,在水產(chǎn)市場上已難見到正宗的中 華鱘,某些餐館肆意出售所謂的“中華鱘”,相當部分是一些其他鱘類,這會造成對民眾的動 物保護意識的嚴重誤導,也是對消費者的惡意欺騙。為了保護中華鱘這一魚類珍稀品種,防 止不法分子非法捕殺、攜帶和銷售中華鱘,以及對銷售假冒中華鱘行為的懲治,必須對中華 鱘有一種快速、準確的鑒定手段或方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠快速準確地進行中華鱘的檢測的中華鱘實時熒光 PCR基因檢測試劑盒及用其檢測中華鱘的方法。本發(fā)明用于中華鱘實時熒光PCR基因檢測的試劑盒包括如下試劑(I)PCRMIX反應(yīng)液由5XFQ PCR buffer、濃度為10 μ M的DL基因引物混合物、濃 度為10 μ M的熒光探針、濃度為IOmM的dNTPS及ddH20 ;其中DL基因引物混合物含有上游 引物和下游引物,所述上游引物DL-F序列為5’ -GATCAAGGTATGTCGATGACA-3’ ;所述下游引物DL-R序列為5, -CAAGAACACAAGATTAATGAG-3,;所述熒光探針DL-P序列為5,-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-3 ’,其5 ’端標記熒光報告基團,3,端標記熒光 淬滅基團;(2) Taq 酶;(3)陽性對照濃度為lX107COpieS/mL的中華鱘的DL基因擴增片段重組質(zhì)粒。上述5XFQ PCR buffer、濃度為10 μ M的DL基因引物混合物、濃度為10 μ M的熒 光探針、濃度為IOmM的dNTPS及ddH20按體積比為10 1 0. 5 1 30. 5。本發(fā)明還提供檢測中華鱘的方法,包括如下步驟(1)按常規(guī)方法提取樣品的DNA ;(2)對提取的DNA進行擴增反應(yīng);反應(yīng)體系中含有PCR MIX反應(yīng)液24 μ L、Taq酶2 μ L,樣品DNA提取液4 μ L,陽性模板為重組質(zhì)粒,陰性模板為ddH20 ;反應(yīng)程序為93°C反 應(yīng)2min,93°C反應(yīng)30s,58°C反應(yīng)45s,45個循環(huán);(3)結(jié)果分析如果Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線的為陽性,即樣品鑒定 為中華鱘。本發(fā)明試劑盒由于引入了針對中華鱘的DL基因序列的特異引物和熒光探針,用 于中華鱘實時熒光PCR檢測,使中華鱘檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的提高,具有 較好的重復性和穩(wěn)定性,實現(xiàn)了快速、高效、準確地檢測中華鱘的目的。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明試劑盒的組成基礎(chǔ)試劑盒的構(gòu)成及配制(或制備)如下(I)PCR MIX 反應(yīng)液包含5XFQ PCR buffer、濃度為10 μ M的中華鱘DL基因引物混合物、濃度為10 μ M 的熒光探針、濃度為IOmM的dNTPS和ddH20,依次按體積比10 1 0. 5 1 30. 5混 合;上述5XFQ PCR buffer 如下配制按 250mM 的 Tris-HCl (ρΗ8· 0)、35mM 的 MgCl2、 250mM的KCl以及體積濃度為10%的DMSO混合;上述中華鱘DL基因引物混合物包含上游引物和下游引物,該上、下游引物及熒光 探針序列如下上游引物DL-F 5,-GATCAAGGTATGTCGATGACA-3,;下游引物DL-R 5,-CAAGAACACAAGATTAATGAG-3,;熒光探針DL-P :5,-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-3,,5,端標記熒光報告基團, 3’端標記熒光淬滅基團。dNTPS和ddH20按照常規(guī)方法制備。(2) Taq酶購自大連寶生物有限公司。(3)陽性對照以中華鱘的DL基因為模板,以DL-F與DL-R為引物進行擴增反應(yīng);將擴增反應(yīng) 獲得的特異性擴增片段連接到T克隆載體上,構(gòu)成的重組質(zhì)粒,經(jīng)過濃度測定,調(diào)整濃度為 107copies/mL。實施例2本發(fā)明試劑盒檢測中華鱘的方法及其驗證反應(yīng)體系設(shè)置為30 μ L,包括PCR ΜΙΧ24 μ L、Taq酶2 μ L以及樣品核酸提取液或 者陽性標準品或者陰性標準品分別為4 μ L。(1)依照動物組織的核酸提取方法或商品化的核酸提取試劑盒提取不同樣品的核酸。(2)按照如下反應(yīng)體系進行配置PCR MIX反應(yīng)液24 μ L、Taq酶2 μ L,樣品核酸提 取液4μ L,陽性模板為重組質(zhì)粒,陰性模板為ddH20。反應(yīng)程序為93°C反應(yīng)2min,93°C反應(yīng) 30s,58°C反應(yīng)45s,45個循環(huán)。(3)結(jié)果分析如果Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線的樣品為陽性,即樣品 鑒定為中華鱘。
采用本試劑盒檢測中華鱘,不同操作人員采用不同型號的熒光PCR儀器進行反 應(yīng),反應(yīng)結(jié)果穩(wěn)定,重復性較好。實施例3用本發(fā)明試劑盒檢測中華鱘的靈敏度以中華鱘核酸為模板,以DL-F與DL-R為引物進行擴增反應(yīng)。將擴增反應(yīng)獲得的 特異性擴增片段,連接到T克隆載體上,構(gòu)成的重組質(zhì)粒,經(jīng)過濃度測定與調(diào)整,然后按10 倍進行倍比稀釋,分別得到濃度為 IolclCopiesAlLuo9CopiesAlLuo8CopiesAlLuo7Copies/ mL、106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL,將各稀釋液 作為陽性模板進行PCR擴增檢測,結(jié)果顯示當重組質(zhì)粒模板總量大于1000個拷貝時擴增良 好。實驗證明該實時熒光PCR方法的檢測靈敏度為1000個重組質(zhì)??截愐陨稀嵤├?用本發(fā)明試劑盒檢測中華鱘的特異性將各對照物種(史氏鱘、達氏鱘、俄羅斯鱘、河蝦、對蝦、鯽魚、螃蟹、黃鱔、帶魚、 昂刺魚、鱸魚、魷魚、豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、雞肉、叉尾鮰魚、河豚、甲魚、支魚、牛蛙、桂魚、 鯧邊魚、黑魚、黃魚、鳊魚、青魚、海蟹、香螺、蛘仔、毛蛤、文蛤、斑節(jié)蝦、小青龍蝦、海腸、海瓜 子、大間蟹、蝦爬、青蟹、江白蝦、花蟹、梭子蟹、淡水小龍蝦),用海洋動物組織的核酸提取試 劑盒提取核酸,取4 μ 1核酸提取溶液,用于實時熒光PCR反應(yīng),進行特異性試驗。結(jié)果表明, 只有中華鱘有典型的擴增曲線,而用于實驗中的對照物種均沒有任何擴增曲線。本發(fā)明的試劑盒經(jīng)過多次的重復實驗,證實具有較好的重復性和穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
中華鱘實時熒光PCR檢測試劑盒,其特征是包含如下試劑(1)PCR MIX反應(yīng)液含有5×FQ PCR buffer、濃度為10μM的DL基因引物混合物、濃度為10μM的熒光探針、濃度為10mM的dNTPS及ddH2O;其中DL基因引物混合物含有上游引物和下游引物,所述上游引物DL-F序列為5’-GATCAAGGTATGTCGATGACA-3’;所述下游引物DL-R序列為5’-CAAGAACACAAGATTAATGAG-3’;所述熒光探針DL-P序列為5’-CAGTCCTGCTTTTGGGGTTCGGCAAG-3’,其5’端標記熒光報告基團,3’端標記熒光淬滅基團;(2)Taq酶;(3)陽性對照濃度為1×107copies/mL的中華鱘的DL基因擴增片段重組質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征是所說的5XFQPCR buffer、濃度為10 μ M 的DL基因引物混合物、濃度為10 μ M的熒光探針、濃度為IOmM的dNTPS及ddH20的體積混 合比為 10 1 0. 5 1 30. 5。
3.一種用權(quán)利要求1的試劑盒檢測中華鱘的方法,包括如下步驟(1)提取樣品的核酸;(2)對提取的DNA進行擴增反應(yīng);反應(yīng)體系中含有PCRMIX反應(yīng)液24μ L、Taq酶2μ L, 樣品DNA提取液4 μ L,陽性模板為重組質(zhì)粒,陰性模板為ddH20 ;反應(yīng)程序為93°C反應(yīng) 2min,93°C反應(yīng) 30s,58°C反應(yīng) 45s,45 個循環(huán);(3)結(jié)果分析Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線的樣品為陽性,即樣品鑒定為中華鱘。
全文摘要
本發(fā)明涉及中華鱘實時熒光PCR檢測試劑盒,包括含有5×FQ PCR buffer、濃度為10μM的DL基因引物混合物、濃度為10μM的熒光探針、濃度為10mM的dNTPS及ddH2O的PCRMIX反應(yīng)液、Taq酶和陽性對照中華鱘DL基因擴增片段重組質(zhì)粒。DL基因引物混合物含有上游引物和下游引物。用PCR MIX反應(yīng)液24μL、Taq酶2μL,樣品DNA提取液4μL,陽性模板為重組質(zhì)粒,陰性模板為ddH2O,進行擴增反應(yīng);反應(yīng)程序為93℃反應(yīng)2min,93℃反應(yīng)30s,58℃反應(yīng)45s,45個循環(huán);Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線的鑒定為中華鱘,檢測快速、高效、準確。
文檔編號G01N21/64GK101886128SQ201010216438
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者吳斌, 張曉武, 張睿, 沈崇鈺, 祝長青, 蔣原, 邵景東, 黃文勝 申請人:江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心