專利名稱：一種油菜葉片亮氨酸含量快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及油菜檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種油菜葉片亮氨酸含量快速檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
油菜是我國(guó)主要的油料作物和蜜源作物之一，油菜的種植面積占全國(guó)油料作物總 面積的40%以上，產(chǎn)量占全國(guó)食用植物油總產(chǎn)量的60%以上，居世界首位。油菜不同時(shí)期 的生長(zhǎng)狀況關(guān)系到油菜籽的產(chǎn)量和質(zhì)量。油菜葉片中的氨基酸含量是油菜生長(zhǎng)過程中一項(xiàng) 非常重要的生理指標(biāo)，對(duì)油菜葉片生理和有機(jī)物積累等生理過程有重要意義。因此可以通 過檢測(cè)油菜葉片中的氨基酸含量，得到油菜的生長(zhǎng)狀況。近年來，由于農(nóng)村勞動(dòng)力的減少， 油菜種植中使用了大量的除草劑。有些除草劑是一種生長(zhǎng)抑制劑，例如丙酯草醚，可以阻止 直鏈氨基酸的生物合成，具有對(duì)油菜安全、殺草譜較廣、除草活性高、持效期長(zhǎng)，且低毒、低 殘留，與環(huán)境相容等特點(diǎn)。對(duì)油菜葉片中亮氨酸含量的檢測(cè)，可以反映出某些除草劑對(duì)油菜 生理和有機(jī)物積累的影響，對(duì)實(shí)現(xiàn)油菜生長(zhǎng)狀況的大田檢測(cè)和連續(xù)監(jiān)測(cè)，提高油菜籽的產(chǎn) 量和質(zhì)量有重要意義。傳統(tǒng)的油菜葉片亮氨酸含量檢測(cè)方法是根據(jù)GB/T5009. 124-2003，采用萬分之一 天平準(zhǔn)確稱取粉樣0. 05g置于IOml體積的安培瓶中，加入5ml6M HCL，用循環(huán)真空泵抽真空 并在酒精噴燈上封口后置于110°C烘箱中消解24h ；將冷卻后的消解液完全轉(zhuǎn)移到50ml容 量瓶中定容、搖勻；吸取5ml上清液置于圓底磨口錐形瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上(60 70°C ) 抽真空15min左右蒸干鹽酸；重新加入0.02M HCl (pH 2. 2) 10ml，超聲波充分溶解后用一次 性針筒吸出，經(jīng)0. 22 μ m的一次性濾頭過濾至氨基酸分析專用樣品瓶中，4°C黑暗保存，用 日立L-8900自動(dòng)氨基酸分析儀(日本)分析測(cè)定亮氨酸含量。該方法樣本預(yù)處理過程和測(cè) 量過程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、化學(xué)消耗品昂貴，且對(duì)環(huán)境造成了一定污染。因此，急需研究一種簡(jiǎn)單、 快速、無損的油菜葉片亮氨酸含量檢測(cè)方法和技術(shù)。可見/近紅外光譜可以反映物質(zhì)內(nèi)部的有機(jī)成分，特別是C-H、0-H、N-H等基團(tuán)的 倍頻和合頻吸收，可用于定量測(cè)定物質(zhì)有機(jī)物質(zhì)的含量。光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食 品、石油化工、制藥、飼料等行業(yè)。在植物生命信息快速檢測(cè)研究中具有廣泛的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種油菜葉片亮氨酸含量快速檢測(cè)方法，解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法費(fèi) 時(shí)、費(fèi)力、操作復(fù)雜、成本高、污染環(huán)境等問題。一種油菜葉片亮氨酸含量快速檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)將油菜葉片殺青、烘干后粉碎，得到葉片粉末；(2)分別采集波長(zhǎng) 2360nm、2386nm、2306nm、2314nm、2330nm、1194nm、2198nm、 1420nm、1462nm、2106nm、1602nm、1878nm、2426nm、1814nm、2274nm、1676nm、1910nm 禾P 2052nm光波所對(duì)應(yīng)的油菜葉片的反射率；(3)將各反射率分別代入多元線性回歸方程y = 199. 490 λ「205. 134 λ 2-157. 08
32 λ 3+158. 636 λ 4-98. 514 λ 5-40. 158 λ 6+74. 919 λ 7+79. 434 λ 8-79. 398 λ 9-76. 208 λ 10+142. 368 λ η+45. 322 λ 12+47. 134 λ 13-45. 866 λ 14+27. 124 λ 15-99. 757 λ 16-19. 316 λ 17+44. 704 λ 18 +2. 5554，計(jì)算油菜葉片中亮氨酸含量；方程中y為油菜葉片亮氨酸含量，單位為mg/100mg Dff, λ i λ 18分別為波長(zhǎng) 2360nm、2386nm、2306nm、2314nm、2330nm、1194nm、2198nm、1420nm、1462nm、2106nm、1602nm、 1878nm、2426nm、1814nm、2274nm、1676nm、1910nm 和 2052nm 光波所對(duì)應(yīng)的油菜葉片粉末樣
本的反射率。步驟(1)中，葉片粉末為40 80目，殺青溫度為95 115°C，殺青時(shí)間為20 40min。該殺青溫度和殺青時(shí)間適宜，有利于油菜葉片中主成分的保留，特別是亮氨酸。步 驟(1)中，烘干溫度為70 90°C，將葉片烘干至恒重，該烘干溫度適宜，不會(huì)烤焦葉片。因?yàn)橛筒巳~片粉末樣本是非透明介質(zhì)，當(dāng)光波照射在其表面時(shí)，除部分被吸收外， 其余均發(fā)生反射，而光波吸收的多少(或者反射率)是跟油菜葉片內(nèi)部化學(xué)物質(zhì)含量是相 關(guān)的，而針對(duì)亮氨酸含量這類具體物質(zhì)僅僅跟少數(shù)某些特征波長(zhǎng)光波的反射率相關(guān)。應(yīng)用連續(xù)投影算法在1100 2500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行特征波長(zhǎng)的選取，得到這些 特征波長(zhǎng)分別為 2360nm、2386nm、2306nm、2314nm、2330nm、1194nm、2198hm、1420nm、1462nm、 2106nm、1602nm、1878nm、2426nm、1814nm、2274nm、1676nm、1910nm 和 2052nm。將上述波長(zhǎng)的 反射率值作為多元線性回歸模型的輸入變量，實(shí)際測(cè)量的亮氨酸含量作為輸出變量，計(jì)算 得到上述多元線性回歸方程。本發(fā)明通過少數(shù)特征波長(zhǎng)進(jìn)行多元線性回歸分析，快速準(zhǔn)確檢測(cè)油菜葉片中亮氨 酸含量，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間，減少了環(huán)境污染，降低了檢測(cè)成本。


圖1為本發(fā)明建模集樣本預(yù)測(cè)結(jié)果散點(diǎn)分布圖；圖2為本發(fā)明預(yù)測(cè)集樣本預(yù)測(cè)結(jié)果散點(diǎn)分布圖。
具體實(shí)施例方式隨機(jī)收集248片油菜葉片，為使所采集的油菜葉片樣本更具有代表性和多樣性， 所采集的248片葉片中不僅包括正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的油菜葉片(共62片)，還包括噴施過不 同濃度(100，500，1000mg/L)丙酯草醚除草劑的油菜葉片186片(100，500，1000mg/L每個(gè) 濃度梯度采集油菜葉片62片)，噴灑時(shí)間為五葉一心期，噴灑方式為葉面噴施。丙酯草醚除 草劑是一種亮氨酸抑制劑，對(duì)油菜葉片亮氨酸具有抑制作用，可以使油菜葉片中的亮氨酸 含量具有更大的范圍，使得所建模型具有更好的適應(yīng)性和魯棒性。將248片油菜葉片放在105°C的烘箱中殺青30分鐘后于80°C下烘干至恒重，再 用研缽將烘干后的油菜葉片樣品磨成粉末，并過60目篩，在室溫下測(cè)定油菜葉片粉末樣本 在波長(zhǎng) 2360nm、2386nm、2306nm、2314nm、2330nm、1194nm、2198nm、1420nm、1462nm、2106nm、 1602nm、1878nm、2426nm、1814nm、2274nm、1676nm、1910nm 禾Π 2052nm 處的反射率值(Foss NIR Systems 5000)，同時(shí)利用背景技術(shù)所提及的傳統(tǒng)方法測(cè)量所有葉片的亮氨酸含量。然 后隨機(jī)選擇186個(gè)樣本作為建模集樣本，其余62個(gè)作為預(yù)測(cè)集樣本，以建模集樣本186片 油菜葉片的各特征波長(zhǎng)的反射率值作為輸入變量，以相應(yīng)的測(cè)量的亮氨酸含量作為輸出變量，利用多元線性回歸法(Multiple linear regression, MLR)得到如下多元線性回歸方 程y(mg/IOOmg Dff) = 199. 490 λ r205. 134 λ 2-157. 082 λ 3+158. 636 λ 4-98. 514 λ 5-4 0. 158 λ 6+74· 919 λ 7+79. 434 λ 8-79· 398 λ 9-76· 208 λ 10+142. 368 λ η+45. 322 λ 12+47. 134 λ ! 3-45. 866 λ 14+27. 124 λ 15-99· 757 λ 16-19· 316 λ 17+44. 704 λ 18+2. 5554，計(jì)算得到油菜葉片亮
氨酸含量。方程中y為油菜葉片亮氨酸含量，單位為mg/100mg DW ； λ工 λ 18分別為波長(zhǎng) 2360nm、2386nm、2306nm、2314nm、2330nm、1194nm、2198nm、1420nm、1462nm、2106nm、1602nm、 1878nm、2426nm、1814nm、2274nm、1676nm、1910nm 和 2052nm 光波所對(duì)應(yīng)的油菜葉片粉末樣
本的反射率。然后利用上述多元線性回歸方程對(duì)建模集和預(yù)測(cè)集油菜葉片樣本的亮氨酸含量 進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)指標(biāo)中相關(guān)系數(shù)和斜率越接近于1，均方根誤差、偏 差的絕對(duì)值和截距的絕對(duì)值越小，說明模型預(yù)測(cè)性能越好。預(yù)測(cè)結(jié)果如下表所示 對(duì)建模集和預(yù)測(cè)集進(jìn)行預(yù)測(cè)，油菜葉片亮氨酸含量的預(yù)測(cè)值與真實(shí)化學(xué)方法測(cè)量 值之間的相關(guān)系數(shù)均大于0. 95，獲得了滿意的預(yù)測(cè)精度。對(duì)建模集和預(yù)測(cè)集樣本預(yù)測(cè)結(jié)果 的散點(diǎn)分布圖如圖1和圖2所示，圖中樣本靠近分布于回歸直線兩側(cè)，具有很好的線性預(yù)測(cè) 效果。上述結(jié)果說明應(yīng)用本發(fā)明的方法能夠快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)油菜葉片亮氨酸含量的檢測(cè)。
權(quán)利要求
一種油菜葉片亮氨酸含量快速檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)將油菜葉片殺青、烘干后粉碎，得到葉片粉末；(2)分別采集波長(zhǎng)2360nm、2386nm、2306nm、2314nm、2330nm、1194nm、2198nm、1420nm、1462nm、2106nm、1602nm、1878nm、2426nm、1814nm、2274nm、1676nm、1910nm和2052nm光波所對(duì)應(yīng)的油菜葉片的反射率；(3)將各反射率分別代入多元線性回歸方程y＝199.490λ1 205.134λ2 157.082λ3+158.636λ4 98.514λ5 40.158λ6+74.919λ7+79.434λ8 79.398λ9 76.208λ10+142.368λ11+45.322λ12+47.134λ13 45.866λ14+27.124λ15 99.757λ16 19.316λ17+44.704λ18+2.5554，計(jì)算油菜葉片中亮氨酸含量；方程中y為油菜葉片亮氨酸含量；λ1～λ18分別為波長(zhǎng)2360nm、2386nm、2306nm、2314nm、2330nm、1194nm、2198nm、1420nm、1462nm、2106nm、1602nm、1878nm、2426nm、1814nm、2274nm、1676nm、1910nm和2052nm光波所對(duì)應(yīng)的油菜葉片粉末樣本的反射率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油菜葉片亮氨酸含量快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的葉 片粉末為40 80目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油菜葉片亮氨酸含量快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1) 中，殺青溫度為95 115°C，殺青時(shí)間為20 40min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油菜葉片亮氨酸含量快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1) 中，烘干溫度為70 90°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種油菜葉片亮氨酸含量快速檢測(cè)方法，包括以下步驟將油菜葉片殺青、烘干后粉碎，得到葉片粉末；分別采集波長(zhǎng)2360、2386、2306、2314、2330、1194、2198、1420、1462、2106、1602、1878、2426、1814、2274、1676、1910和2052nm光波所對(duì)應(yīng)的油菜葉片的反射率；將各反射率分別代入多元線性回歸方程，計(jì)算油菜葉片中亮氨酸含量。本發(fā)明通過少數(shù)特征波長(zhǎng)進(jìn)行多元線性回歸分析，快速準(zhǔn)確檢測(cè)油菜葉片中亮氨酸含量，大大縮短了檢測(cè)的時(shí)間，減少了環(huán)境污染，降低了檢測(cè)成本。
文檔編號(hào)G01N21/35GK101900678SQ201010219028
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月5日
發(fā)明者何勇, 劉飛, 孔汶汶 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)