專利名稱：一種量子點免疫熒光探針的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種量子點免疫熒光探針的制備方法，屬于納米材料學、生物分析化 學、納米生物醫(yī)學領域。
背景技術：
量子點(quantum dots, QDs)，又稱半導體納米晶，其半徑小于或接近激子波爾半 徑，主要由II-VI族元素(如CdTe、CdSe)或III-V族元素(如GaAs、InP)構成。量子點因 具有獨特的光學與電學特性近年來引起了科學界的廣泛關注，其在紫外-可見光范圍內(nèi)廣 泛而連續(xù)的吸收光譜，窄且對稱的熒光發(fā)射光譜使之具有單激發(fā)、多發(fā)射的多色標記功能。 量子點還具有光穩(wěn)定性好、耐光漂白的獨特性質(zhì)，使其有望取代傳統(tǒng)的有機熒光染料，獲得 在生物醫(yī)學熒光標記領域的廣泛應用。量子點在生物醫(yī)學標記領域的應用，通常先需要與生物素/親和素、抗體、寡核苷 酸等生物分子結合，形成生物熒光探針，再加入樣品中結合欲標記的相應配體、抗原或者核 酸。量子點與抗體的結合可通過靜電吸附法直接與抗體結合，這種方法雖然簡單易行，但結 合不夠可靠，PH、溫度、離子強度等環(huán)境因素改變可使量子點-抗體復合物解偶聯(lián)。直接在 水相中制備的水溶性量子點在制備過程中在其表面引入了大量的氨基或者羧基，因此可以 通過這些功能集團與抗體蛋白分子中的氨基或者羧基形成化學共價偶聯(lián)，得到穩(wěn)定的量子 點-抗體熒光探針

發(fā)明內(nèi)容
為拓展量子點在生物醫(yī)學領域內(nèi)應用，本發(fā)明提供了一種將水溶性羧基化量子點 用于標記具有生物活性的抗體蛋白進而制備免疫熒光探針的方法，該方法可將羧基化量子 點有效地與抗體蛋白連接，并很好地保持抗體的生物活性，可應用于基于抗原抗體特異性 結合的生物標記分析領域，例如基于測量熒光強度的抗原/抗體定量分析、酶聯(lián)免疫吸附 分析、標記細胞中特定蛋白的胞內(nèi)定位、研究核酸雜交等。本發(fā)明的量子點免疫熒光探針是在羧基化量子點末端連接特異性的抗體，通常可 連接一個或者一個以上抗體分子，數(shù)目可以通過控制量子點和抗體的比例進行調(diào)整。其中羧基化量子點的核心為CdTe、CdSe、CdTe/ZnS、CdSe/ZnS中的任意一種，且為 水相中直接制備的，以巰基丙酸或者其他含羧基的巰基化合物修飾的水溶性量子點。所用 的抗體可以是針對一種蛋白或者某蛋白的一個結構域，或者一段多肽的單克隆抗體，也可 以是針對來自不同物種蛋白的多克隆抗體?！N量子點免疫熒光探針的制備方法，其特征在于采用如下步驟A)用濃度為0. 2mol/L, pH值為7. 2-7. 6的磷酸鹽緩沖液溶解1_乙基_3_ (3- 二甲 氨丙基)碳二亞胺和N-羰基琥珀酸亞胺，配制成羧基活化劑，活化劑中1-乙基-3-(3-二甲 氨丙基)碳二亞胺和N-羰基琥珀酸亞胺的濃度均為50mg/mL，將該活化劑按體積比1 8 加入至濃度為lmg/mL市售羧基化量子點中，在室溫下輕微振蕩使羧基活化形成活潑酯，經(jīng)高速離心機分離使量子點沉降，棄去上清液；B)往步驟A)的量子點沉淀中加入A)中使用的磷酸鹽緩沖液，在渦旋振蕩器上輕 微振蕩使量子點重新懸浮至A)加入活化劑后的體積，再高速離心機分離及重懸，照此重復 2次，再次高速離心使量子點沉降；C)加入濃度為lmg/mL的抗體溶液，輕微振蕩使量子點在抗體溶液中重新懸浮至 步驟A)中加入活化劑后的體積，并使抗體與羧基活化的量子點充分接觸，發(fā)生共價偶聯(lián)反 應，在室溫下放置lh，每隔20min輕微振蕩一次，Ih后經(jīng)低速離心機分離使形成的量子點團 塊沉降，所得上清液即為量子點免疫熒光探針。本發(fā)明是在近年來發(fā)展起來的水熱法直接制備水溶性量子點技術的基礎上，用巰 基丙酸作為穩(wěn)定劑修飾量子點表面，使之帶有大量的羧基功能基團，利用EDC和NHS或者其 中之一作為羧基與氨基的偶聯(lián)劑，將抗體可靠地連接在量子點表面。該方法簡單易行、安全 可靠，無需特殊儀器試劑，在大多數(shù)生物、化學實驗室均可完成，適合推廣應用于生物醫(yī)學 標記分析領域。


圖1為為量子點免疫熒光探針的照片。圖2為量子點免疫熒光探針的TEM圖像。圖3為量子點免疫熒光探針結合了 ELISA板底部的抗原后的熒光顯微鏡照片。
具體實施例方式實施例1 將0. 4g的NaBH4和0. 08g碲粉加入50mL錐形瓶中，加入5mL去離子水，通氮氣 20min，立即塞緊軟膠塞，插入一個注射器針頭，磁力攪拌2h，得到乳白色新鮮制備的NaHTe 溶液。取0. 5mL濃度為200mmol/L的CdCl2水溶液，0. 5mL濃度為200mmol/L新鮮配制的巰 基丙酸水溶液，加入另一個50mL錐形瓶中，加入14ml去離子水，滴加濃度為lmol/L的NaOH 溶液，調(diào)整PH為12. 0，向上述溶液中通氮氣20min，立即塞緊軟膠塞，插入一個注射器針頭， 用ImL注射器抽取新鮮制備的NaHTe溶液0. 2mL，快速注入裝有Cd前驅液的錐形瓶中，將錐 形瓶放入96°C水浴鍋中加熱lh，取出自然冷卻至室溫；打開裝有反應混合物的錐形瓶的軟 膠塞，將溶液等分于兩只15mL離心管中，再分別向兩只離心管中加入與上清液等體積的無 水乙醇，待有絮狀物產(chǎn)生時，用3000rpm/min的速度離心分離lOmin，吸出上清液，重復無水 乙醇洗滌、離心分離步驟2次，最后一次將上清液除去后將離心管放置于恒溫恒濕柜中過 夜，得到CdTe量子點干粉。按如下方法取用水溶性量子點將用PBS復溶的量子點干粉用2%的優(yōu)級純硝酸 稀釋100，000倍，根據(jù)衛(wèi)生部標準WS-T 174-1999所述方法，用石墨爐原子吸收光譜法定量 量子點中Cd的濃度，并換算成CdTe的濃度。用pH值為7. 2-7. 6，0. 2M的PBS稀釋量子點 溶液至1. Omg/mL，在渦旋振蕩器上振蕩分散20s，取ImL備用。若抗體為自行純化得到，則應避免添加疊氮鈉作為防腐劑，可使用prOClin300作 為防腐劑，終質(zhì)量百分濃度為0. 02% ；若抗體為商品化的產(chǎn)品，則應在4°C條件下對PBS透 析過夜后使用，防止疊氮鈉與活化的羧基結合，進而將其滅活，阻礙抗體的結合?？贵w的濃度可根據(jù)需要調(diào)整，優(yōu)選0. l_5mg/mL，更優(yōu)選0. 5-2mg/mL用于與量子點的偶聯(lián)。將EDC和NHS分別配制成濃度為50mg/mL的溶液，為保證偶聯(lián)的效率，偶聯(lián)劑溶液 應新鮮配制。取2個1.5mL離心管，向每個離心管中依次加入100 μ L分散好的量子點、540 μ L 去離子水，240yL PBS以及60yL EDC和60yL NHS溶液。將離心管以錫紙包裹，放在搖床 上室溫下避光反應30min。取出離心管，置于高速離心機中，室溫下12000rpm離心分離5min，使量子點沉降， 棄去上清液。加入1. OmL PBS，渦旋振蕩20s重懸量子點，之后再次高速離心分離，重復2 次，除去溶液中剩余的偶聯(lián)劑。加入200 μ L濃度為1. Omg/mL不含疊氮鈉的抗體溶液，加入裝有量子點的離心管
中，在渦旋振蕩器上輕輕振蕩使量子點在抗體溶液中均勻分散。用錫箔紙包裹離心管，放置 在搖床上室溫下振蕩反應Ih。取出離心管，置于低速離心機中，3000rpm離心5min，去除可能形成的沉淀，所得 上清即為水溶性量子點_抗體免疫熒光探針。將量子點免疫熒光探針通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察，可以看到所制備的探針 中量子點具有良好的單分散性(圖2)。用相應的抗原包被ELISA板，加入量子點免疫熒光 探針與之結合，再分別用含有Tween-20的洗滌液以及PBS洗板3次，之后在熒光顯微鏡下 觀察，可清楚地看到探針的熒光(圖3)，表明探針具有良好的生物活性。進一步采用ELISA 法測定探針中抗體的效價，結果可達106，證明抗體的生物活性在探針制備的偶聯(lián)反應中得 到了很好的維持。
權利要求
一種量子點免疫熒光探針的制備方法，其特征在于采用如下步驟A)用濃度為0.2mol/L，pH值為7.2 7.6的磷酸鹽緩沖液溶解1 乙基 3 (3 二甲氨丙基)碳二亞胺和N 羰基琥珀酸亞胺，配制成羧基活化劑，活化劑中1 乙基 3 (3 二甲氨丙基)碳二亞胺和N 羰基琥珀酸亞胺的濃度均為50mg/mL，將該活化劑按體積比1∶8加入至濃度為1mg/mL市售羧基化量子點中，在室溫下輕微振蕩使羧基活化形成活潑酯，經(jīng)高速離心機分離使量子點沉降，棄去上清液；B)往步驟A)的量子點沉淀中加入A)中使用的磷酸鹽緩沖液，在渦旋振蕩器上輕微振蕩使量子點重新懸浮至A)加入活化劑后的體積，再高速離心機分離及重懸，照此重復2次，再次高速離心使量子點沉降；C)加入濃度為1mg/mL的抗體溶液，輕微振蕩使量子點在抗體溶液中重新懸浮至步驟A)中加入活化劑后的體積，并使抗體與羧基活化的量子點充分接觸，發(fā)生共價偶聯(lián)反應，在室溫下放置1h，每隔20min輕微振蕩一次，1h后經(jīng)低速離心機分離使形成的量子點團塊沉降，所得上清液即為量子點免疫熒光探針。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法，其特征在于抗體是針對不同蛋白，或者蛋白的一 個結構域，或者一段多肽的單克隆抗體，或者是針對來自不同物種蛋白的多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種量子點免疫熒光探針的制備方法，水溶性量子點標記的單克隆抗體熒光探針是在羧基化修飾的量子點末端共價連接單克隆抗體，通常每個量子點可以連接一個或者一個以上的抗體分子，其制備方法是先在水溶液中利用水熱法制得巰基丙酸修飾的量子點，再通過共價偶聯(lián)的方法使羧基修飾的量子點連接抗體蛋白，得到既有良好的熒光特性又有優(yōu)異的生物活性的量子點免疫熒光探針。同現(xiàn)有技術比較，本發(fā)明的優(yōu)點是該探針分散性好、特異性強、熒光強度大且耐光漂白，可應用于與免疫檢測、細胞信號轉導、生物細胞或組織的熒光成像技術等相關生物醫(yī)學研究領域。該方法簡單易行，可在一般的生物、化學實驗室完成。
文檔編號G01N33/536GK101907625SQ20101022027
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月8日 優(yōu)先權日2010年7月8日
發(fā)明者張路遙, 潘敏, 牛婉婷, 陳裕泉 申請人:浙江大學