專利名稱：一種用于腺癌早期診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種利用飛行質(zhì)譜技術(shù)檢測人腺癌血清，以獲得血清腫瘤標(biāo)志物的方法，為腺癌的早期診斷提供實驗基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居各類腫瘤的首位。在胃的惡性腫瘤中，腺癌占95%，也是最常見的消化道惡性腫瘤。我國胃癌死亡率為25. 2/10萬(男性32. 8/10萬，女性17. 0/10萬)，占全部惡性腫瘤死亡的23.2%,占惡性腫瘤死亡的第一位(男性是女性的1.9倍)。腺癌及癌前病變的癥狀隱匿且無特異性，因此早期腺癌很難發(fā)現(xiàn)。早期腺癌多無癥狀或僅有輕微癥狀。當(dāng)臨床癥狀明顯時，病變已屬晚期，目前尚缺乏可用于早期篩查腺癌的特異性腫瘤標(biāo)志物。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)已成為檢測和篩查腫瘤標(biāo)志物的重要手段之一。表面加強激光解析電極一飛行時間質(zhì)譜技術(shù)是最近幾年發(fā)展起來的一種新的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法， 它能夠直接從未處理的生物樣品獲取蛋白質(zhì)組圖譜。基于此技術(shù)開發(fā)的蛋白質(zhì)芯片可以非特異性或特異性地結(jié)合各種蛋白質(zhì)，并在質(zhì)譜儀中受到激光轟擊，各種結(jié)合蛋白質(zhì)會被激發(fā)而形成氣化離子，根據(jù)不同電離子在電場中飛行的時間長短，形成強弱不同的質(zhì)譜峰，進而形成圖譜用于分析。近年來該技術(shù)在差異表達蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)相互作用及疾病檢測方面得到了廣泛的應(yīng)用，尤其適合于多肽及低分子量蛋白質(zhì)譜分析。該技術(shù)在尋找前列腺、膀胱、乳腺等疾病的診斷標(biāo)記物方面已經(jīng)取得了較大進展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用Bio-Rad公司的蛋白質(zhì)飛行時間質(zhì)譜儀系統(tǒng)，檢測早期腺癌和健康人血清的蛋白質(zhì)譜，利用軟件分析腺癌與正常人血清對照蛋白質(zhì)組的差異，發(fā)表腺癌相關(guān)的蛋白質(zhì)譜，并構(gòu)建診斷模型，用于診斷早期腺癌。本發(fā)明將早期腺癌和健康人血清分別利用Bio-Rad公司蛋白質(zhì)芯片檢測，得到數(shù)據(jù)利用該公司的Biosystems軟件的Biomarker wizard功能，分別對腺癌和正常組樣品的蛋白質(zhì)波譜進行比較，得出特異的蛋白質(zhì)圖譜，再根據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)腺癌與正常組有統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P < 10-e5)的蛋白質(zhì)峰，并使用MathWorks公司的Matlab 2009a軟件對腺癌與對照組差異顯著特異蛋白質(zhì)進行分析，采用三倍交叉證實的方法抽樣，重復(fù)抽樣1000 次，得到1000個決策樹。從中選出交叉證實正確率最高的20個決策樹對盲法篩選組進行歸類預(yù)測，建立了腺癌與正常人蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。利用該指紋質(zhì)譜模型，將受檢人血清中相應(yīng)的蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比與本發(fā)明指紋圖譜模型逐一進行比對，可為早期腺癌診斷提供輔助指導(dǎo)。指紋質(zhì)譜模型的檢測方法如下1.血清標(biāo)本制備骨肉瘤患者術(shù)前血和正常對照外周靜脈血采集后立即放入4°C冰箱。檢測時，融解冰凍血清，離心，取血清樣品加緩沖液，振搖。2.平衡芯片將醋酸鈉溶液加入芯片的加樣孔中，平衡芯片2次，每次5min。3.血清樣品稀釋取血清樣品，加入尿素，振蕩30min，加入醋酸鈉溶液中，混勻稀釋。4.芯片上樣取稀釋后的血清樣品加入平衡好的芯片加樣孔，置芯片于搖床孵育90min。5.樣品洗脫取醋酸鈉溶液加入芯片加樣孔，洗脫2次，每次5min。取去離子水沖洗芯片。6.芯片和蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)取能量吸收劑加入芯片加樣孔，待自然揮發(fā)后再重復(fù)加吸收劑一次。7.芯片檢測將芯片置于蛋白芯片閱讀機中，用加有標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的芯片校正儀器。設(shè)置芯片閱讀儀參數(shù)，用CipheEgen Pmteinchip 3. 1. 1軟件收集數(shù)據(jù)。其中縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對含量， 橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(M/Z)。經(jīng)過臨床試用，20個決策樹模型可以較好地區(qū)分早期腺癌和正常對照，預(yù)測準(zhǔn)確率為85%。


圖1腺癌與正常人鑒別的蛋白質(zhì)指紋質(zhì)譜模型圖中m/z表示特異蛋白的質(zhì)荷比，case代表早期腺癌病人，ctrl代表正常人。
具體實施例方式1.材料1. 1檢測血清取受試者靜脈血5ml，在4度冰箱中靜置2小時后離心(4000rpm，5min).取血清， 置低溫冰箱(負80度)或液氮保存，備用。1. 2所需主要試劑與儀器乙酸鈉、乙腈、三氟乙酸、白芥子酸(SPA)均購自上?；瘜W(xué)試劑公司。CMW蛋白芯片和蛋白質(zhì)芯片閱讀機(PBS II型)購自美國Bio-Rad公司。2.方法2. 1平衡芯片取200ul 50mmol/L pH 4. 0的醋酸鈉(NaAc)溶液加入芯片的加樣孔中，平衡芯片2次，每次5min。2. 2血清樣品稀釋取6ul 血清樣品，加入 12ul 9mmol/L 尿素，振蕩 30min，加入 222ul 50mmol/L pH 為3. 0的NaAc溶液中，混勻稀釋。2. 3.芯片上樣取稀釋后的血清樣品200ul/孔加入平衡好的芯片加樣孔，置芯片于搖床孵育 90mino2. 4.樣品洗脫
取50mmol/L pH 4. 0的NaAc溶液200ul/孔加入芯片加樣孔，洗脫2次，每次5min。 取300ul/孔的去離子水沖洗芯片。2.5.芯片和蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)取能量吸收劑SPA(含飽和白芥子酸溶液與質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%乙腈和0. 15%三氟乙酸)0. 5ul/孔加入芯片加樣孔，待自然揮發(fā)后再重復(fù)加SPA —次。2. 6.芯片檢測將芯片置于蛋白芯片閱讀機中，用加有AU-in_0ne標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正儀器至0. 1 %范圍內(nèi)。芯片閱讀儀參數(shù)設(shè)置激光強度150，檢測靈敏度7，優(yōu)化范圍1984. 2 9921u，最高分子量49605u，芯片上的每個點采集130次。用CipheEgenProteinchip 3. 1. 1 軟件收集數(shù)據(jù)。其中縱坐標(biāo)為蛋白質(zhì)相對含量，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(M/Z)。將分析得到的受檢者的血清蛋白波譜根據(jù)指紋質(zhì)譜模型(圖1)中特異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比進行比較，以判斷受檢者是否患有腺癌(見實施實例)。實驗實例取受檢者血清，經(jīng)檢驗得到其血清蛋白圖譜，按圖1腺癌與正常組鑒別的蛋白質(zhì)指紋質(zhì)譜模型，運用20個決策樹來對受檢者進行預(yù)測，結(jié)果顯示20個模型中有1個(5% ) 決策樹預(yù)測結(jié)果認(rèn)為該樣本是病例組，19個(95% )認(rèn)為是對照組，投票結(jié)果以多數(shù)為準(zhǔn)， 即把受檢者歸為病例組，即早期腺癌病人。如果20個決策樹有大于50 %的決策樹將受檢者歸為對照組，則該受檢者為正常人。以上是對本發(fā)明的描述而非限定，基于本發(fā)明思想的其它實施方式，均在本發(fā)明的保護范圍之中。
權(quán)利要求
1.用于腺癌早期診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，其特征在于由蛋白質(zhì)芯片飛行時間質(zhì)譜儀系統(tǒng)檢測的血清蛋白質(zhì)圖譜經(jīng)過軟件統(tǒng)計分析得到腺癌患者多個特異蛋白質(zhì)的質(zhì)荷比m/z，利用這些差異m/z構(gòu)建了 20個決策樹，決策樹分別采用了 m/z4476，m/zll812, m/ z4095, m/z2819, m/z6198, m/z3361, m/z3361, m/z3377, m/z5639, m/z4820, m/z4259, m/ zll812, m/z8699。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，是一種可以用于早期腺癌診斷的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。本發(fā)明用蛋白質(zhì)芯片飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)，檢測正常人及早期腺癌病人的外周血清樣品，找出與腺癌患者差異顯著的特異蛋白質(zhì)峰，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比(m/z)，采用決策樹算法，得到擁有20個決策樹的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。只要將檢測人血清中相應(yīng)的蛋白質(zhì)的m/z與本發(fā)明的模型進行分析，依據(jù)決策樹少數(shù)服從多數(shù)的原則，就可以初步用于腺癌診斷。其預(yù)測準(zhǔn)確率為85％。
文檔編號G01N33/68GK102200538SQ201010227088
公開日2011年9月28日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月14日
發(fā)明者曾華宗 申請人:上海聚類生物科技有限公司