專利名稱：具有促細胞分裂活性的Bv8的核酸和多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及利用具有促細胞分裂活性的蛋白BvS的方法，組合物和檢測法。
背景技術：
內(nèi)皮細胞局部微環(huán)境以組織特異性或器官特異性方式深刻影響著血管內(nèi)皮細胞的表型和 生長特性，但局部有益信號本身的性質(zhì)仍然很不明了。有明顯跡象表明，血管內(nèi)皮生長因 子(VEGF)和內(nèi)皮細胞特異性生長因子的血管生成蛋白(angiopoietin)家族都是胚胎發(fā)育 和各種生理和病理情況下的血管生成所必需的(Ferrara and Alitalo,Nature Medicine, 5:1359-1364(1999) ；Carmeliet, Nature Medicine，6 :389_395 (2000))。另外，對內(nèi)皮細 胞表型和生長的局部、組織特異性調(diào)節(jié)也有十分明顯的證據(jù)(Aird等，J. Cell Biol. , 138 1117-1124(1997) ；Stewart and Wiley, Dev. Biol. ,84 183-192 (1981)) 內(nèi)皮細胞的形 態(tài)和功能特征在不同器官中差別很大(Simionescu and Simionescu, Cell and Tissue Biology, Urban and Schwarzemberg, Baltimore, (1988)pp. 355—398) 。 Mi，MIlJii^iil 管生成因子的應用部位比類型更能決定新血管的特性(Dellian等，Am. J. Pathology. 149 59-71(1996) ；Roberts 等，Am. J. Pathology, 153 1239-1248 (1998)) 局部微環(huán)境對脈管 系統(tǒng)特性的這種影響的分子基礎目前尚不清楚，但有人認為特化的基質(zhì)在其中起主要作用 (Dellian，出處同上)。有理由相信，除了細胞的以及細胞外的基質(zhì)成分以外，由刺激(可能 包括組織特異性分泌蛋白)所形成的一種集成的網(wǎng)絡也能決定常駐內(nèi)皮的結(jié)構和功能以 及生長調(diào)節(jié)。因此現(xiàn)在需要鑒定并定性能影響內(nèi)皮細胞生長和/或分化的因子。這樣的化合物 除了能幫助我們進一步了解脈管系統(tǒng)的發(fā)育以外，還可以用于診斷和治療與脈管組織相關 的疾病。激素分泌細胞盡管現(xiàn)在的科學和醫(yī)學治療有了進步，但仍然需要新的針對社會的醫(yī)學疾病的治 療。一種發(fā)現(xiàn)新治療的方法是研究器官如何操作。具體目標是傳遞信號的細胞如何控制生 物的行為。例如，內(nèi)分泌細胞分泌所謂激素分子，這些激素的分泌出現(xiàn)故障時可以導致各種 疾病。特化的激素分泌細胞包括性腺細胞，它們分泌睪丸激素(睪丸間質(zhì)細胞(Leydig cell))，雌激素(卵泡內(nèi)膜細胞)和黃體酮(已分裂卵泡的黃體細胞)。盡管在醫(yī)學領域有 各種利用外源給予睪丸激素，雌激素和黃體酮來進行的治療，但是仍然需要對產(chǎn)生這些激 素的細胞進行調(diào)節(jié)。
其它特化的激素分泌細胞包括腎上腺的細胞和消化系統(tǒng)的細胞。例如，腎上腺的 細胞分泌腎上腺素，去甲腎上腺素和類固醇激素如鹽皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素。尤其有興趣 的是皮質(zhì)醇(Cortisol)，它產(chǎn)生于腎上腺皮質(zhì)，能影響多種類型細胞的代謝。消化系統(tǒng)的細 胞包括胰腺的細胞，它們分泌胰島素。胰島素由朗格漢島(islets of Langerhans)分泌， 它是糖代謝所必需的。胰島素用于治療和控制糖尿病(diabetes mellitus)，但目前仍需要 針對諸如糖尿病(diabetes)等疾病的有效治療。腸道和呼吸道的其它目的激素包括5_羥 色胺，內(nèi)啡肽，生殖激素抑制素，胃泌素，分泌素，縮膽囊素，胰高血糖素和鈴蟾肽。很多疾病與激素分泌細胞有關，尤其與內(nèi)分泌腺中生成類固醇的內(nèi)皮細胞有關。 因此，最好能鑒定特異性影響這類內(nèi)皮細胞的生長因子。這種內(nèi)皮細胞特異性生長因子將 會是，診斷和治療與這類細胞相關的疾病，以及鑒定可用于診斷和治療這類疾病的其它藥 物的有價值的工具。Bv8Bv8是一種小分子蛋白，它最初是從青蛙(Bombina variegata)的皮膚分泌物中 分離得到的(Mollay 等 Eur. J. Pharmacol. 374 189-196(1999))。Bv8 與 MIT-I 有 40 % 以上的同一性，后者是來自黑色樹蛇(mamba)毒液的一種小分子蛋白，已知它能強效誘導 小腸收縮(Schweitz等FEBS Lett. 461 183-188 (1999))。目前已經(jīng)從小鼠和人中克隆 出Bv8的多種哺乳動物同系物，它們都具有相同的氨基末端序列(Wechselberger等FEBS Lett. 462 :177-181(1999))。與MIT-I —樣，人Bv8使胃腸道平滑肌強烈收縮，EC50值在 亞納摩爾水平(1^等船1.卩1^1~111.59:692-698(2001))。現(xiàn)已在人類中鑒定出Bv8的兩種 形式，其中較長的形式反映了旁路剪接外顯子的存在。人BvS的較長形式與美國專利申請 09/886，242中所述的VRPA有近78%的同源性和58%的同一性。發(fā)明簡述本發(fā)明基于鑒定出BvS的新活性。具體地，發(fā)現(xiàn)BvS誘導內(nèi)皮細胞增殖，促進內(nèi)皮 細胞存活并促進血管生成。如本文詳述，BvS核酸和多肽可用于多種檢測法中，以及用于診 斷和治療與內(nèi)皮細胞相關的疾病。一方面，本發(fā)明提供了誘導內(nèi)皮細胞增殖的方法。在一個實施方案中，所述方法包 括使細胞與能夠有效誘導所述細胞增殖的量的BvS接觸。所述方法還包括使所述細胞與 VEGF接觸。在另一個實施方案中，所述方法包括將編碼BvS的核酸引入所述細胞，所述核酸 的量能有效誘導細胞增殖。所述方法還包括將編碼VEGF的核酸引入所述細胞中。在一個實施方案中，BvS是天然序列BvS多肽。優(yōu)選天然序列BvS多肽是天然人 Bv8多肽。天然人Bv8多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO 2或氨基酸序列SEQ ID NO :4。 在另一實施方案中，天然序列BvS包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。在另一實施方案中，BvS 能與肝素結(jié)合。在另一實施方案中，BvS是BvS免疫粘附素。在另一實施方案中，BvS是嵌 合 Bv8。在一個實施方案中，所述細胞是內(nèi)皮細胞，更優(yōu)選生成類固醇的內(nèi)皮細胞，如生成 類固醇的腺體的細胞。在另一方面，本發(fā)明提供了促進細胞存活的方法。在一個實施方案中，所述方法包 括使細胞與能夠有效促進所述細胞存活的量的BvS接觸。所述方法還包括使所述細胞與 VEGF接觸。在另一個實施方案中，所述方法包括將編碼BvS的核酸引入所述細胞，所述核酸
6的量能有效促進細胞存活。所述方法還包括將編碼VEGF的核酸引入所述細胞中。在一個實施方案中，BvS是天然序列BvS多肽。優(yōu)選天然序列BvS多肽是天然人 Bv8多肽。天然人Bv8多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO 2或氨基酸序列SEQ ID NO :4。 在另一實施方案中，天然序列BvS包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。在另一實施方案中，BvS 能與肝素結(jié)合。所述細胞優(yōu)選內(nèi)皮細胞，更優(yōu)選生成類固醇的內(nèi)皮細胞，如生成類固醇的腺體的 細胞。在另一方面，本發(fā)明提供了治療哺乳動物與產(chǎn)激素組織相關的疾病的方法。在一 個實施方案中，所述方法優(yōu)選包括對該哺乳動物給藥能夠有效治療該疾病的量的BvS或其 激動劑或拮抗劑。在另一個實施方案中，所述方法還包括對該哺乳動物給藥VEGF或其激動 劑或拮抗劑。所述哺乳動物優(yōu)選人類。在一個實施方案中，BvS與肝素結(jié)合。在另一實施方案中BvS是天然序列BvS多 肽。優(yōu)選天然序列BvS多肽是天然人BvS多肽。天然人BvS多肽可包含氨基酸序列SEQ ID NO 2或氨基酸序列SEQ ID NO :4。在另一實施方案中，天然序列BvS包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制內(nèi)皮細胞的方法。在一個實施方案中，所述方法包 括將內(nèi)皮細胞與能有效抑制細胞增殖的BvS拮抗劑接觸。在另一方面，本發(fā)明提供了治療哺乳動物中BvS應答細胞的癌癥的方法。所述方 法優(yōu)選包括給藥能有效治療所述癌癥的量的BvS拮抗劑。在另一實施方案中，所述癌癥是 激素依賴性癌癥。在另一實施方案中，所述癌癥是睪丸癌。在另一方面，本發(fā)明提供了治療哺乳動物(優(yōu)選人)中生殖器官的癌癥的方法。 在一個實施方案中，所述方法包括對該哺乳動物給藥能有效治療所述癌癥的量的BvS拮抗 劑。所述癌癥優(yōu)選睪丸癌。在另一方面，本發(fā)明提供了誘導血管生成的方法。在一個實施方案中，所述方法包 括將細胞與能有效誘導血管生成的量的BvS接觸。在另一實施方案中，所述方法包括將編 碼BvS的核酸引物細胞中，所述核酸的量能有效誘導血管生成。在另一方面，本發(fā)明提供了治療哺乳動物中與過度的、不希望有的或失控的血管 生成相關的疾病的方法。在一個實施方案中，所述方法優(yōu)選包括對該哺乳動物給藥能有效 治療所述疾病的量的BvS或其激動劑或拮抗劑。所述哺乳動物優(yōu)選人。在另一方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)哺乳動物生育力的方法。在一個實施方案中，所述 哺乳動物為人。所述方法優(yōu)選包括對該哺乳動物給藥能有效調(diào)節(jié)生育力的量的BvS拮抗 劑。在另一方面，本發(fā)明提供了一種制品，它包含容器；BvS ；以及使用BvS的說明。在 一個實施方案中，所述說明是指如何用BvS治療與產(chǎn)激素的內(nèi)皮組織(優(yōu)選睪丸組織)相 關的疾病。在另一方面，本發(fā)明提供了治療哺乳動物中類固醇激素依賴性疾病的方法。在一 個實施方案中，所述方法包括對該哺乳動物給藥能有效治療所述類固醇激素依賴性疾病的 量的BvS或其激動劑或拮抗劑。優(yōu)選哺乳動物為人。所述類固醇激素依賴性疾病優(yōu)選選自 先天性脂樣腎上腺增生，不育，性成熟，依賴雄性激素的腫瘤，性早熟，McCune-Albright綜合征，先天性腎上腺發(fā)育不全，或低促性腺激素型性腺功能衰退。在另一方面，本發(fā)明提供了一種制品，它包含容器，BvS拮抗劑，以及如何使用BvS 的說明。在一個實施方案中，所述說明是指如何用BvS拮抗劑治療癌癥，優(yōu)選睪丸癌。在另 一實施方案中，所述說明是指如何用BvS拮抗劑調(diào)節(jié)生育力。本發(fā)明另一方面提供了鑒定BvS拮抗劑的方法，是使候選化合物與BvS接觸，測定 該化合物對BvS生物學活性的影響，并在BvS生物學活性受到抑制的情況中鑒定拮抗劑。在 一個實施方案中，BvS拮抗劑通過其抑制BvS刺激內(nèi)皮細胞增殖的能力來鑒定。在另一實 施方案中，BvS拮抗劑通過其抑制BvS促進內(nèi)皮細胞存活的能力來鑒定。本發(fā)明還涉及1.誘導內(nèi)皮細胞增殖的方法，包括使所述細胞與能夠有效誘導所述細胞增殖的量 的Bv8接觸。2.項1的方法，其中所述細胞為血管內(nèi)皮細胞。3.項2的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是生成類固醇的內(nèi)皮細胞。4.項3的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是生成類固醇的腺體的細胞。5.項1的方法，其中所述BvS是天然序列BvS多肽。6.項5的方法，其中所述BvS是天然人BvS多肽。7.項6的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。8.項6的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :4。9.項5的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。10.項1的方法，其中所述BvS能與肝素結(jié)合。11.項1的方法，其中所述BvS是BvS免疫粘附素。12.項1的方法，其中所述BvS是嵌合Bv8。13.項1的方法，還包括使所述細胞與VEGF接觸。14.誘導內(nèi)皮細胞增殖的方法，包括將編碼BvS的核酸引入所述細胞，所述核酸的 量能有效誘導細胞增殖。15.項14的方法，其中所述BvS能與肝素結(jié)合。16.項14的方法，其中所述BvS是天然序列BvS多肽。17.項14的方法，其中所述細胞是內(nèi)皮細胞。18.項17的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是生成類固醇的內(nèi)皮細胞。19.項18的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是生成類固醇的腺體的細胞。20.項14的方法，還包括將編碼VEGF的核酸引入所述細胞。21.促進細胞存活的方法，包括將所述細胞與能有效促進存活的量的BvS接觸。22.項21的方法，其中所述BvS能與肝素結(jié)合。23.項21的方法，其中所述BvS是天然序列BvS多肽。24.項23的方法，其中所述BvS是天然人BvS多肽。25.項24的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :2。26.項24的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :4。27.項23的方法，其中所述Bv8包含氨基酸序列SEQ ID NO :6。28.項21的方法，其中所述細胞是內(nèi)皮細胞。
29.項28的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是生成類固醇的內(nèi)皮細胞。30.項29的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是生成類固醇的腺體的細胞。31.項21的方法，還包括使所述細胞與VEGF接觸。32.促進細胞存活的方法，包括將編碼BvS的核酸引入所述細胞，所述核酸的量能 有效促進存活。33.項32的方法，其中所述BvS能與肝素結(jié)合。34.項32的方法，其中所述BvS是天然序列BvS多肽。35.項32的方法，其中所述細胞是內(nèi)皮細胞。36.項35的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是生成類固醇的內(nèi)皮細胞。37.項36的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是生成類固醇的腺體的細胞。38.項32的方法，還包括將編碼VEGF的核酸引入所述細胞。39.抑制內(nèi)皮細胞增殖的方法，包括使所述細胞與能有效抑制細胞增殖的量的 Bv8拮抗劑接觸。40.治療哺乳動物的癌癥的方法，包括將能有效治療癌癥的量的BvS拮抗劑給予 該哺乳動物。41.項40的方法，其中所述哺乳動物是人。42.項40的方法，其中所述癌癥是激素依賴性癌癥。43.項40的方法，其中所述癌癥是生殖器官的癌癥。44.項43的方法，其中所述癌癥是睪丸癌。45. 一種治療哺乳動物中與生成激素的組織相關的疾病的方法，包括給予有效量 的Bv8來治療該疾病。46.項45的方法，其中所述與生成激素的組織相關的疾病選自先天性脂樣腎上腺 增生，不育，性成熟，依賴雄性激素的腫瘤，性早熟，McCime-Albright綜合征，先天性腎上腺 發(fā)育不全，或低促性腺激素型性腺功能減退癥。47.項45的方法，其中所述哺乳動物是人。48. 一種制品，包含容器；Bv8 拮抗劑；如何用BvS拮抗劑治療癌癥的說明。49.項48的制品，其中所述癌癥是睪丸癌。50. 一種制品，包含容器；Bv8 ；如何用BvS治療與生成激素的組織相關的疾病的說明。
0090]51.項50的制品，其中所述組織是睪丸組織。52. 一種制品，包含容器；Bv8 拮抗劑；如何用BvS拮抗劑調(diào)節(jié)生育力的說明。
53.鑒定BvS拮抗劑的方法，包括以下步驟a)使候選化合物與Bv8接觸；b)測定BvS刺激內(nèi)皮細胞增殖的能力；和c)在BvS刺激內(nèi)皮細胞增殖的能力受到抑制的情況下，將所述化合物鑒定為拮抗 劑。54.鑒定BvS拮抗劑的方法，包括以下步驟a)使候選化合物與Bv8接觸；b)測定BvS促進內(nèi)皮細胞存活的能力；和c)在BvS促進內(nèi)皮細胞存活的能力受到抑制的情況下，將所述化合物鑒定為拮抗 劑。55.誘導血管生成的方法，包括使所述細胞與能有效誘導血管生成的量的BvS接 觸。56.治療哺乳動物受試者中與過度、不良、或失控的血管生成相關的疾病的方法， 包括給予受試者能有效治療該疾病的量的BvS拮抗劑。


圖1顯示編碼人Bv8同系物的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO :1)。用粗體和下 劃線表示起始密碼子和終止密碼子的位置。圖2顯示人Bv8同系物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 2),由編碼序列SEQ ID NO 1衍生。公認的信號序列由氨基酸1-21組成。圖3顯示編碼人Bv8同系物旁路剪接形式的cDNA的核苷酸序列(SEQID NO 3)。 用粗體和下劃線表示起始密碼子和終止密碼子的位置。圖4顯示人Bv8同系物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 4),由編碼序列SEQ ID NO 3衍生。圖5顯示編碼小鼠Bv8同系物的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)。用粗體和 下劃線表示起始密碼子和終止密碼子的位置。圖6顯示小鼠Bv8同系物多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)，由編碼序列SEQ ID NO :5衍生。圖7顯示小鼠BvS同系物與人BvS同系物的序列比對。潛在的肝素-結(jié)合區(qū)用盒 子表示。如圖所示，該區(qū)不出現(xiàn)在旁路剪接轉(zhuǎn)錄子中。小鼠BvS同系物與人BvS同系物有 近96%相同。圖 8 顯示人 Bv8(SEQ ID NO 2) ^P EG-VEGF (SEQ ID NO 7)的氨基酸序列比對。人 Bv8與人EG-VEGF有近60%相同。圖9對人RNA樣品的Northern印跡分析顯示出約1. 8kb的單個轉(zhuǎn)錄子。在睪丸 中發(fā)現(xiàn)表達。各個泳道的內(nèi)含物在印跡的上方示出，大小(kb)在右側(cè)示出。圖IOA和IOB顯示小鼠和大鼠中Bv8表達的Northern印跡分析。在小鼠中，Bv8 表達可見于心臟和睪丸(圖10A)。在大鼠中，BvS表達僅見于睪丸(圖10B)。此外，在大 鼠睪丸中還可見到一條較小的0. Skb的帶。圖IlA和IlB顯示，Bv8誘導內(nèi)皮細胞增殖。圖IlA顯示，給藥1，10和50nM的Bv8，使牛腎上腺皮質(zhì)毛細管內(nèi)皮(ACE)細胞的增殖與未處理的對照(“C”)相比增加了。 同樣，圖IlB表明，所有三種濃度的BvS使牛腦毛細管細胞的增殖增加。在這兩種情況中， 由BvS誘導的增殖不及由VEGF誘導的增殖(“V” )。圖12顯示，Bv8促進內(nèi)皮細胞存活。在含有5或25nM Bv8的培養(yǎng)基中保溫，與在 2% FCS或EG-VEGF中保溫相比，使更少的牛腦毛細管細胞的凋亡。Bv8和VEGF顯示協(xié)同效 應，在同時含有Bv8和VEGF的培養(yǎng)基中保溫，與在單獨含有Bv8或VEGF的培養(yǎng)基中保溫相 比，出現(xiàn)的凋亡細胞的數(shù)量少。圖13顯示BvS增加裸鼠睪丸中間質(zhì)毛細胞的形成。給小鼠睪丸注射表達LacZ， VEGF, EG-VEGF,或Bv8的腺病毒載體以后，在經(jīng)Bv8_處理的動物中，觀察到睪丸內(nèi)血管增殖 的增加。優(yōu)選實施方案詳述I.定義除非特別聲明，本文中采用的技術和科學術語與本發(fā)明所述技術領域的普通技 術人員所通常理解的術語具有相同的含義。參見，例如Singleton等，Dictionafy of Microbiology and Molecular Biology 第 2 版，J. Wiley&Sons(New York, NY 1994)； Sambrook 等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)。為了本發(fā)明的目的，對以下術語作出如下限定。本文中術語“Bv8”和“Bv8多肽”可互換使用，它們指天然序列Bv8，BvS變體，和 嵌合Bv8，它們每一個都在本文中限定。可選地，BvS不與天然糖基化相關?！疤烊惶腔?是指，當BvS在哺乳動物細胞(尤其天然產(chǎn)生BvS的細胞)中產(chǎn)生時，與其共價結(jié)合的糖組 分。因此，非人細胞中產(chǎn)生的人BvS是一例“不與天然糖基化相關”的Bv8。有時，BvS根本 不發(fā)生糖基化，正如它在原核細胞，例如大腸桿菌中產(chǎn)生時那樣。Bv8核酸是編碼上文定義的Bv8多肽的RNA或DNA，或者是與所述DNA或RNA雜 交并在嚴格雜交條件下與其穩(wěn)定結(jié)合的、長度超過約10個核苷酸的RNA或DNA。嚴格雜 交條件是指，(1)利用低離子強度和高溫洗滌，例如，0. 15M NaCl/0.015M檸檬酸鈉/0. NaDodSO4, 50°C，或⑵在雜交期間使用變性劑，如甲酰胺，例如50% (vol/vol)甲酰胺以 及0. 牛血清白蛋白/0. 1% Ficoll/0. 聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH6. 5， 750mM NaCl，75mM 檸檬酸鈉，42°C。當核酸處于與另一個核酸序列有功能關系的位置上時，該核酸是可操作相連的。 BvS核酸可以與另一核酸序列在載體中可操作相連，使其能在具體宿主生物中表達。這可以 通過本領域已知方法進行。例如，前序列或分泌前導序列被表達為參與多肽分泌的前蛋白 時，編碼前序列或分泌前導序列的DNA與編碼該多肽的DNA是可操作相連的；啟動子或增強 子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄時，其與該編碼序列是可操作相連的；核糖體結(jié)合位點處在促進翻 譯的位置上時，它與編碼序列是可操作相連的。通常，“可操作相連”是指相連的DNA是鄰接 的，而且，在分泌前導序列的情況中，是鄰接并處在同一個閱讀框中的。但增強子不是必需 鄰接的。連接可通過，例如，在便利的限制性位點連接來完成的。如果不存在這類位點，可 根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸接頭或連接區(qū)?！疤烊恍蛄蠦v8”包括具有與自然界衍生的BvS有相同氨基酸序列的多肽，無論其 通過什么方法制備。因此，天然序列BvS可以具有天然來源的人Bv8、鼠Bv8、或任何其它哺乳動物物種的BvS的氨基酸序列。例如，全長天然序列人BvS的氨基酸序列見圖2(SEQ ID NO :2)。另一種全長天然序列人Bv8見圖4(SEQ ID NO :4)。這兩個序列是對編碼標 準(canonical)肝素結(jié)合區(qū)的外顯子進行兩種不同剪接的結(jié)果。因此，氨基酸序列如圖 2(SEQID NO 2)所示的那種天然序列人Bv8包含肝素結(jié)合區(qū)，而圖4(SEQ ID NO 4)所示天 然序列Bv8不含該區(qū)。天然序列小鼠Bv8氨基酸序列見圖6 (SEQ ID NO :6)。人和鼠Bv8的 序列也已經(jīng)公開，參見 Wechselberger 等(FEBS Lett. 462 177-181 (1999))和 Li 等(Mol. Pharm. 59 :692_698 (2001))。這樣的天然序列Bv8可以從自然界分離，也可以通過重組和/ 或合成手段制備。術語“天然序列Bv8”特別包含BvS的天然前原(pr印ro)形式，原(pro) 形式，成熟形式和截短形式，天然變體形式(例如旁路剪接形式，諸如圖4(SEQ ID N0:4)所 示的形式)，以及天然等位變體。優(yōu)選的天然序列BvS是圖2 (SEQ ID NO 2)所示的全長天 然序列人Bv8。"Bv8變體”是指，具有不同于天然序列BvS多肽的氨基酸序列的生物活性BvS多 肽，如圖2，4和6(SEQ ID NOs :2，4和6)所示的人和鼠Bv8，可通過在天然序列中插入、 缺失、修飾和/或取代一或多個氨基酸殘基而獲得。BvS變體通常與天然序列BvS有不到 100%序列同一性，如圖2(SEQ ID NO :2)所示的人Bv8。但一般情況下，生物活性Bv8變 體具有與天然Bv8(如圖2 (SEQ ID NO :2)所示的人Bv8)至少約70%氨基酸序列同一性 的氨基酸序列，優(yōu)選至少約75 %，更優(yōu)選至少約80 %，還更優(yōu)選至少約85 %，還更優(yōu)選至少 約90%，優(yōu)選以的增量從至少約95%遞增到至少約99%的氨基酸序列同一性。BvS變 體包括具有至少5個氨基酸且保留了編碼天然序列BvS多肽的生物活性的肽片段。BvS變 體還包括在天然BvS序列的N-或C-末端，或者內(nèi)部添加了一或多個氨基酸殘基的BvS多 肽。BvS變體還包括缺失了多個氨基酸殘基并且任選地被一或多個氨基酸殘基取代的BvS 多肽。BvS變體還可以進行共價修飾，例如用不同于天然氨基酸的組分進行取代，或者修飾 氨基酸殘基從而產(chǎn)生非天然氨基酸。BvS變體可以包含肝素結(jié)合區(qū)。BvS的“氨基酸序列同一性百分比”在本文中定義為，經(jīng)過序列對比，并在必要時 導入空隙以獲取最大序列同一性百分比，而不將任何保守取代視為序列同一性的一部分 時，候選序列中與BvS序列相同的氨基酸殘基的百分比。在候選的BvS序列中，在N-末端、 C-末端或內(nèi)部的延伸，缺失或插入，都不視為影響序列同一性或同源性。序列比對的方法和 計算機程序是已知的。一個這樣的計算機程序是Genentech，Inc.公司擁有“ALIGN-2”，該 程序及其用戶文件(user documentation)已提交美國版權局(United States Copyright Office)，Washington, D. C. 20559，其美國版權注冊號為 TXU510087?！扒逗螧v8”分子是包含與異源多肽融合或鍵合的全長BvS或其一或多個結(jié)構域的 多肽。嵌合BvS分子通常與天然BvS共享至少一種生物學特性。嵌合BvS分子的一個實例 是帶有可用于純化的表位標簽的分子。另一種嵌合BvS分子是BvS免疫粘附素。本文中“帶有表位標簽”是指，包含與“標簽多肽”融合的BvS的嵌合多肽。標簽 多肽具有足以提供制備抗體所需的表位的殘基，但同時它又很短，不會干擾BvS的生物活 性。標簽多肽優(yōu)選非常獨特，使其抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應。合適的標簽多 肽通常具有至少6個氨基酸殘基，通常約8-50個氨基酸殘基(優(yōu)選約9-30個殘基)。優(yōu)選 聚_組氨酸序列，它可以與鎳結(jié)合，從而能通過Ni-NTA層析分離帶有該標簽的蛋白(參見， 例如 Lindsay 等 Neuron 17 :571_574 (1996))。
“分離的Bv8”是指，從BvS來源純化得到的，或者是通過重組或合成方法制備并純 化的Bv8。純化的BvS基本上不含其它多肽或肽。“基本上不含”是指，其它來源的蛋白的 污染少于約5 %，優(yōu)選少于約2 %，更優(yōu)選少于約1 %，還更優(yōu)選少于約0. 5 %，最優(yōu)選少于約 0.1%?！盎炯儭钡牡鞍资侵敢环N組合物，其總重量中有至少約90%重量是所述蛋白，優(yōu) 選至少約95%重量，更優(yōu)選至少約90%重量，還更優(yōu)選至少約95%重量?！盎揪弧钡牡?白是指一種組合物，其總重量中有至少約99%重量是所述蛋白。BvS “激動劑”是具有天然序列BvS的一或多種生物學特性的分子或化合物。包括 但不限于，有機小分子，肽，和激動劑抗-BvS抗體。術語“拮抗劑”使用其最廣泛含義，包括任何能部分地或完全地阻斷、抑制、或中和 天然BvS多肽的生物活性的分子。合適的拮抗劑分子具體包括拮抗劑抗體或抗體片段，天 然BvS多肽的片段或氨基酸序列變體，肽，有機小分子等。鑒定BvS多肽的激動劑或拮抗劑 的方法包括使BvS多肽與候選的激動劑或拮抗劑分子接觸，并測定通常與BvS多肽有關的 一或多種生物活性的改變。本文中“活性”是指保留了天然BvS的生物活性或免疫活性的BvS形式，其中“生 物”活性是指由天然BvS導致的生物功能(抑制或刺激)，但它不是指天然BvS誘導產(chǎn)生抗 天然BvS加工的抗原性表位的抗體的能力，“免疫”活性是指天然BvS誘導產(chǎn)生抗天然BvS 加工的抗原性表位的抗體的能力。因此，當“生物活性”與“Bv8”或“分離的Bv8”或BvS激動劑聯(lián)合使用時，是指具 有或共有天然序列BvS的效應功能的BvS多肽。BvS的一種基本效應功能是其刺激內(nèi)皮細 胞增殖的能力。還更優(yōu)選，生物活性是指在內(nèi)分泌腺體內(nèi)部的毛細管內(nèi)皮細胞(優(yōu)選生成 類固醇的細胞)中誘導增殖的能力。BvS的另一種效應功能是其誘導血管生成的能力?！吧飳W特性”當與“Bv8”或“分離的Bv8”或BvS激動劑聯(lián)合使用時，是指具有由 天然序列BvS (不管是其天然構型還是非天然構型)直接或間接導致或?qū)嵤┑男δ芑?效應活性或抗原功能或抗原活性。效應功能包括增強內(nèi)皮細胞的增殖和/或誘導血管生 成。"Bv8受體”是與BvS結(jié)合并介導BvS的生物學特性的分子。術語“抗體”是指最廣義上的抗體，具體包括人、非-人(例如鼠)和人源化的單 克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體 片段，只要它們顯示所需的生物學活性。“抗體” (Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同結(jié)構特征的糖蛋白?？贵w表現(xiàn)出對 特異抗原的結(jié)合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和其它缺少抗原特異性的抗體-樣分子。 后一類多肽例如是，在淋巴系統(tǒng)中低水平產(chǎn)生而在骨髓瘤中高水平產(chǎn)生的那些?！疤烊豢贵w”和“天然免疫球蛋白”通常是約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由 兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相 連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈具有不同的二硫鍵數(shù)目。每條重鏈和輕鏈還有規(guī)則間 隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(Vh)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有 可變區(qū)(\)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對，輕鏈的可變區(qū)與 重鏈的可變區(qū)相對。人們相信有一些氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
術語“可變”是指可變區(qū)一些部分的序列在不同抗體之間有很大差異，它們可在各 個具體抗體針對其具體抗原的結(jié)合和特異性方面發(fā)揮作用。然而，該變異性并非均勻分布 于抗體的整個可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個稱為超變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)中 高度保守的區(qū)域稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包括4個FR(分別為FR1， FR2，F(xiàn)R3和FR4)，主要采取β折疊構型，由三個超變區(qū)相連，形成環(huán)狀連接，在某些情況下 可形成所述β折疊結(jié)構的部分。每條鏈的超變區(qū)通過FR緊密相連，彼此十分靠近，并且與 其它鏈的超變區(qū)一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(見Kabat等，Sequences of Proteins of Iroanzmaological Interest,第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)，第647-669頁)。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但 是表現(xiàn)出各種效應功能，例如參與抗體的抗體依賴性細胞毒性作用。本文中術語“超變區(qū)”是指抗體上負責與抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)包含來 自“互補決定區(qū)”或“CDR，，的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34 (Li)，50-56 (L2) 和 89-97 (L3)，重鏈可變區(qū)中的 31-35 (Hl)，50-65 (H2)和 95-102 (H3) ；Kabat 等，Sequence of proteins of Immunological Interest,第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))，和 / 或來自“超變環(huán)”的那些殘基(即， 輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32 (Li)，50-52 (L2)和91-96 (L3)，重鏈可變區(qū)中的26-32 (Hl)， 53-55 (H2)和 96-101(H3) ；Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. 196 :901_917 (1987))?！翱蚣軈^(qū)，， 或“FR”殘基是那些可變區(qū)的殘基而不是本文定義的超變區(qū)殘基。用木瓜蛋白酶消化抗體可產(chǎn)生兩個相同的各帶有單個抗原結(jié)合位點的抗原結(jié)合 片段(稱為“Fab”片段)和殘余的“Fe”片段，F(xiàn)c片段的名稱反應了其易于結(jié)晶的能力。經(jīng) 胃蛋白酶處理可產(chǎn)生具有兩個抗原結(jié)合位點并仍然能與抗原交聯(lián)的F(ab’)2片段。“Fv”是含有完整的抗原_識別和_結(jié)合位點的最小抗體片段。此區(qū)由一個重鏈可 變區(qū)與一個輕鏈可變區(qū)緊密地非共價連接形成的二聚體組成。在這個構型中，每個可變區(qū) 的三個CDR相互作用，在Vh-Vl 二聚體表面限定一個抗原結(jié)合位點。這六個CDR共同賦予抗 體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或Fv上僅含有三個抗原特異性超變區(qū)的 一半)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管與完整的結(jié)合位點相比其親和力較低。Fab段還包括輕鏈恒定區(qū)和重鏈的第一個恒定區(qū)(CHl)。Fab，片段區(qū)別于Fab片段 之處在于，F(xiàn)ab'在重鏈CHl區(qū)的羧基末端多出幾個殘基，包括抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半 胱氨酸。Fab’ -SH在本文中是指恒定區(qū)半胱氨酸殘基帶有至少一個游離巰基的那些Fab’。 F(ab' )2抗體片段最初產(chǎn)生為Fab’片段對的形式，在它們之間具有鉸鏈區(qū)半胱氨酸?？贵w 片段的其它化學偶聯(lián)是眾所周知的。脊椎動物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，可依據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列 而歸為兩種完全不同類型(稱為κ和λ)中的一類。免疫球蛋白根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列可分為不同的類。主要有5類免疫球 蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成“亞類”(同種型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對應于不同類抗體的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ 和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構和三維構型是眾所周知的?！翱贵w片段”包括完整抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的 實例包括Fab、Fab，、F (ab，)2和Fv片段；二價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由多個抗體片段形成的多特異性抗體。本文中術語“單克隆抗體”是指來自基本均一的抗體群的抗體，S卩，除了可能少量 存在的天然突變以外，該抗體群中的各個抗體均相同。單克隆抗體具有高度特異性，僅針對 單個抗原位點。而且，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆) 抗體制劑相反，每種單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。修飾詞“單克隆”表明該抗體 的特點，即，它來自基本均一的抗體群，不解釋為需通過任何特殊方法產(chǎn)生該抗體。例如，根 據(jù)本發(fā)明應用的單克隆抗體可通過由Kohler等，Nature, 256 =495(1975)首先描述的雜交 瘤法進行制備，或者可通過重組DNA法進行制備(例如見美國專利4，816，567)?！皢慰寺?抗體”還可利用例如 Clackson 等，Nature, 352 :624_628 (1991)和 Marks 等，J. Mol. Biol.， 222 581-597(1991))所述技術從噬菌體抗體庫中分離。本文中單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其重鏈和/或輕鏈的一 部分與源自具體物種或?qū)儆诰唧w抗體種類或亞類的抗體的相應序列相同或同源，但所述鏈 的剩余部分的序列與源自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞類的抗體(以及此抗體 的片段，只要它們顯示所需的生物學活性)的相應序列相同或同源(美國專利4，816，567; Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851_6855 (1984))?！叭嗽椿狈侨?例如小鼠)抗體是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗 體。大多數(shù)場合，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，但其中受體的超變區(qū)殘基被 具有所需特異性、親和力和能力的小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類等非人源物種抗體(供 體抗體)的超變區(qū)殘基所取代。在一些實例中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基由相應 的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。 這些修飾旨在進一步細化(refine)抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個 (通常包括兩個)可變區(qū)的全部，其中超變區(qū)的全部或基本上全部對應于非人免疫球蛋 白的相應部分，而FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白的序列。人源化抗體還任選包 括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常為人的免疫球蛋白恒定區(qū)。詳見Jones等，Nature 321 522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323_329 (1988)；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 593-596(1992)?！皢捂淔v”或“scFv”抗體片段包含抗體的Vh和\結(jié)構域，這些結(jié)構域存在于 單個多肽鏈上。Fv多肽在Vh和\結(jié)構域之間通常還包含一個多肽接頭，它能使scFv 形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構。關于scFv的綜述見Pluclcthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,卷 113, Rosenburg and Moore 編 Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994)。術語“二價抗體”是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小分子抗體片段，這些片段在一條 多肽鏈(Vh-Vl)上含有相連的一個重鏈可變區(qū)(Vh)和一個輕鏈可變區(qū)(VL)。利用一種太 短以至于同一條鏈上的兩個結(jié)構域無法配對的接頭，可以迫使這些結(jié)構域與另一條鏈上的 互補結(jié)構域配對，并形成兩個抗原結(jié)合位點。二價抗體的詳細說明參見，如EP 404,097 ；WO 93/11161 ；以及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)。本申請全文中用到的“線性抗體”，是指在Zapata等，Protein Eng. 8 (10) 1057-1062(1995)中描述的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd片段 (Vh-ChI-Vh-ChI)，其形成一對抗原結(jié)合區(qū)。線性抗體可以具有雙特異性或單特異性。
術語“表位”是指蛋白抗原上與(單克隆或多克隆)抗體結(jié)合的位點?！凹觿┛贵w”是指可以作為BvS激動劑并因此具有天然序列BvS的一或多種生物 學特性的抗體。術語“Bv8免疫粘附素”與術語“Bv8_免疫嵌合體”可以互換使用，它們都是指將 BvS分子(天然或變體)的至少一部分與免疫球蛋白序列組合形成的嵌合分子。免疫球蛋 白序列優(yōu)選，但并非必需是，免疫球蛋白恒定區(qū)。免疫粘附素可以具有人抗體的多種有價值 的化學或生物學特性。由于可以將具有所需特異性的人蛋白序列與適當?shù)娜嗣庖咔虻鞍足q 鏈區(qū)和恒定區(qū)(Fe)序列相連來構建免疫粘附素，因此可以用完整的人組分獲得所需的結(jié) 合特異性。這樣的免疫粘附素對患者的免疫原性最小，長期或反復使用的安全性較好。已報道可用于治療的同型多體免疫粘附素包括⑶4-IgG免疫粘附素，它可以使 HIV與細胞表面的CD4結(jié)合。在I期臨床試驗中，將CD4-IgG施用于即將臨產(chǎn)的孕婦，所得 的數(shù)據(jù)提示，這種免疫粘附素可以有效防止HIV的母嬰傳播(Ashkenazi等，Intern. Rev. Immunol. 10 :219-227 (1993))。還有人開發(fā)了與腫瘤壞死因子(TNF)結(jié)合的免疫粘附素。 TNF是一種前炎性(proinflammatory)細胞因子，有證據(jù)表明它是敗血性休克的主要介質(zhì)。 基于小鼠敗血性休克模型的試驗表明，TNF受體免疫粘附素有望作為臨床治療敗血性休克 的藥物(Ashkenazi，Α.等(1991)PNAS USASE 10535-10539)。ENBREL (etanercept) 也是一種免疫粘附素，它包含與IgG Fc區(qū)融合的TNF受體，美國食品和藥品管理局(FDA) 于1998年11月2日批準將它用于治療類風濕性關節(jié)炎。2000年6月6日，經(jīng)FDA批 準，ENBREL 在治療類風濕性關節(jié)炎方面的應用進一步擴展。有關TNF阻斷藥(包括 ENBREL )的最新信息，可參見 Lovell 等，N. Engl. J. Med. 342 =763-169 (2000)，以及第 810-811 頁的相關評論；Weinblatt 等，N. Engl. J. Med. 340 :253_259 (1999)；綜述見 Maini and Taylor, Annu. Rev. Med. 51 207-229(2000.當免疫粘附素結(jié)構的雙臂具有不同特異性時，將這種免疫粘附素稱為“雙特異性 免疫粘附素”，類似于雙特異性抗體。Dietsch等，J. Immunol. . Methods 162 123 (1993)描 述了一種這樣的雙特異性免疫粘附素，它組合了粘附分子E-選擇素和P-選擇素的胞外區(qū)， 這兩種選擇素在自然狀態(tài)下是在不同類型的細胞中表達。結(jié)合研究表明，如此形成的雙特 異性免疫球蛋白融合蛋白與衍生出它的單特異性免疫粘附素相比，與髓樣細胞系的結(jié)合能 力增強了。術語“異型粘附素”與“嵌合異型多體粘附素”可以互換使用，是指嵌合分子(氨 基酸序列)的復合物，其中每一嵌合分子將每一異型多體受體單體的生物活性部分(如胞 外區(qū))與一種多體化結(jié)構域組合在一起?！岸囿w化結(jié)構域(multimerization domain) ”促 進了該異型多體復合物內(nèi)部的嵌合分子之間穩(wěn)定的相互作用。多體化結(jié)構域可以借助以下 結(jié)構發(fā)生相互作用免疫球蛋白序列，亮氨酸拉鏈，疏水區(qū)，親水區(qū)，或者形成嵌合異型多體 的嵌合分子之間的分子間二硫鍵的游離巰基。多體化結(jié)構域可包含免疫球蛋白恒定區(qū)。經(jīng) 過工程改造，多體化結(jié)構域還可以使其空間相互作用不僅有利于穩(wěn)定的相互作用，而且有 利于在由單體混合物形成的同型二聚體上形成異型二聚體?！巴黄?Protuberances) ”是將 第一種多肽的界面上的氨基酸小側(cè)鏈替換為較大側(cè)鏈(如酪氨酸或色氨酸)而形成的。備 選地，可以在第二種多肽上，通過用較小的氨基酸側(cè)鏈(如丙氨酸或蘇氨酸)取代較大側(cè) 鏈，而形成與所述突起具有相同或相似大小的互補型“空穴”。所述免疫球蛋白序列優(yōu)選，但并非必需是，免疫球蛋白恒定區(qū)。本發(fā)明嵌合體中的免疫球蛋白組分優(yōu)選來自IgG，，IgG2， IgG3 或 IgG4 亞類，IgA, IgE, IgD 或 IgM，但優(yōu)選 IgG，或 IgG3。本文中“治療”是指獲得有益的或所需的臨床后果的方法。為了本發(fā)明的目的，有 益的或所需的臨床后果包括，但不限于，癥狀緩解，疾病的程度減輕，疾病狀態(tài)穩(wěn)定(即，不 惡化)，疾病進展延遲或減慢，疾病狀態(tài)改善或減輕，以及消退(部分或全部)，無論是可以 檢測到的還是不能檢測到的。“治療”還可以指與不接受治療所預期的存活相比，存活延長。 “治療”是為了阻止疾病進展或改變疾病的病理學而實施的介入。因此，“治療”既指治療性 措施也指預防性措施。需要治療的個體包括那些已經(jīng)患有疾病或者希望預防患病的個體。 具體地，治療可直接阻止，減緩或降低細胞變性或損傷的病理學，如癌癥治療中腫瘤細胞的 病理學，或者可以使細胞對其它治療劑的治療更敏感?！邦惞檀忌?Steroidogenesis) ”是由激素誘導、CAMP-介導的對“生成類固醇的 細胞”中類固醇激素生物合成的急性調(diào)節(jié)，其特征在于膽固醇從細胞內(nèi)貯藏地轉(zhuǎn)移到線粒 體外膜，以及轉(zhuǎn)移到內(nèi)膜，膽固醇在那里被轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮(pregnenolone)。“生成類固醇的組織”是指通過類固醇生成過程產(chǎn)生類固醇激素的組織。實例包括 腎上腺，生殖器官，腸道和呼吸道組織。“長期(Chronic) ”給藥是指將試劑以連續(xù)方式而非短期(acute)方式給藥，使得 能將最初的治療效應(活性)維持更長的時間。“間斷(Intermittent)”給藥是指一種治 療，它不是沒有中斷地連續(xù)進行，本質(zhì)上是一種循環(huán)。需要治療的“哺乳動物”是指哺乳類任何動物，包括人、其它高等靈長類，家養(yǎng)動 物、農(nóng)用動物，和動物園、運動項目用的動物或?qū)櫸铮缛?、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、兔等。 優(yōu)選哺乳動物是人。本文中“腫瘤”是指所有瘤細胞(neoplastic cell)生長和增殖(無論惡性或良 性)，和所有前癌性(pre-cancerous)和癌性(cancerous)細胞和組織。術語“癌”和“癌性的”是指或描述哺乳動物中通常以細胞生長失控為特點的病理 狀態(tài)。本文中癌的實例包括但不限于生殖器官癌，例如，卵巢癌，睪丸癌，子宮癌，宮頸癌；前 列腺癌；腎上腺癌，包括腎上腺皮質(zhì)癌(例如腎上腺皮質(zhì)瘤(carcinoma))和腎上腺髓質(zhì)癌； 甲狀腺癌；甲狀旁腺癌；胰腺癌；以及子宮內(nèi)膜癌。疾病的“病理學”包括患者健康狀況(well-being)在內(nèi)的所有現(xiàn)象。對于癌癥而 言，包括但不限于，異?；蚴Э氐募毎L，轉(zhuǎn)移，干擾鄰近細胞的正常功能，釋放異常水平 的細胞因子或其它分泌產(chǎn)物，抑制或加重炎癥或免疫應答，等等。與一或多種其它治療劑“聯(lián)合”給藥包括同時給藥和以任何順序連貫給藥。本文所用“載體”包括在所用劑量和濃度下對所暴露的細胞或哺乳動物沒有毒性 的可藥用載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑?？伤幱幂d體常常是含水的PH緩沖的溶液?？伤幱幂d體 的實例包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量 (小于10個殘基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡 咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖，和其它碳水 化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA ；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽反離子 如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和PLUR0NICS ?！爸|(zhì)體”是由能向哺乳動物有效運送藥物(如BvS多肽或其抗體)的各類脂質(zhì)、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子囊泡。脂質(zhì)體的組分通常排列為雙層形式，與生物膜 的脂質(zhì)排列相似本文中“小分子”是指分子量小于約500道爾頓。本文中術語“血管內(nèi)皮生長因子”，“VEGF”，“VEGF多肽”和“VEGF蛋白”包括天然 序列VEGF和VEGF變體(見下文詳述)。VEGF多肽可以從各種來源分離，如從人組織類型 或從其它來源分離，或通過重組和/或合成方法制備?！疤烊恍蛄蠽EGF”包括具有與自然界衍生的VEGF相同的氨基酸序列的多肽。所 述天然序列VEGF可以從自然界分離或者通過重組和/或合成手段制備。術語“天然序 列VEGF”具體包括VEGF的天然截短形式或分泌形式(如，胞外區(qū)序列)，天然變體形式 (如，旁路剪接形式)以及天然衍生的等位變體。在本發(fā)明一個實施方案中，天然序列 VEGF是分別由121，145，165，189和206個氨基酸殘基組成的五種同工型之一，對這五種 同工型的描述見美國專利 5，332，671 和 5，240，848 ；W098/10071 ；Leung 等，Science 246 1306-1309(1989) ；Keck 等，Science 246:1309-1312(1989)。"VEGF變體多肽”是指如下定義的活性VEGF多肽，其與天然序列VEGF的氨基酸序 列有至少約80 %，優(yōu)選至少約85 %，更優(yōu)選至少約90 %，還更優(yōu)選至少約95 %，最優(yōu)選至少 約98 %的氨基酸序列同一性。這樣的VEGF變體多肽包括，例如，在天然序列的N-和/或 C-末端、以及一或多個內(nèi)部結(jié)構域中添加或刪除一或多個氨基酸殘基所形成的VEGF多肽。VEGF的序列同一性(無論氨基酸或核酸)采用與BvS相同的方法來確定。類似 地，對BvS的激動劑和拮抗劑(包括但不限于抗體)的定義也適用于VEGF激動劑和拮抗劑。B.實施本發(fā)明的方法1.鑒定Bv8變體除了本文所述全長天然序列BvS多肽，本發(fā)明還涉及鑒定，制備和應用BvS變體。 BvS變體可通過將適合的核苷酸變化引入BvSDNAJP /或通過合成所需BvS多肽來制備。 本領域技術人員可以理解，氨基酸的變化可以改變BvS的翻譯后加工，例如改變糖基化位 點的數(shù)目或位置。制備BvS變體的方法優(yōu)選下文將詳細描述的制備天然序列BvS的方法相 同，唯一的差別是用編碼BvS變體的核酸取代編碼天然序列BvS的核酸。本發(fā)明的方法中用到了編碼BvS的核酸分子。編碼人BvS的兩種全長變體的cDNA 示于圖1和2(SEQ ID N0S:1和2)，相應的推導氨基酸序列示于圖2和4(SEQ ID NOS :2和 4)。編碼小鼠Bv8的cDNA示于圖5(SEQ ID NO :5)，其相應的推導氨基酸序列示于圖6 (SEQ ID NO :6)。本發(fā)明中使用的多核苷酸可以用本領域技術人員熟知的標準技術，如雜交篩選 和PCR方法來獲得。編碼BvS的氨基酸序列的任何核苷酸序列都可以用于制備能指導BvS表達的重組 分子。本發(fā)明的方法還可以利用由BvS編碼序列與編碼異源蛋白的第二種序列形成的融合 多核苷酸。為了從編碼完整Bv8cDNA的任何物種(species)克隆出全長同源cDNA序列，或者 克隆出家族成員或變體形式(如等位變體)，可以從對應于本文所述cDNA序列任何部分的 片段制備DNA探針，將該探針帶上標記，然后用于篩選從據(jù)信能表達BvS的細胞或組織類型 衍生的cDNA文庫。更具體地，可以用對應于編碼序列的5’或3’末端的寡核苷酸獲得更長 的核苷酸序列。
有可能必需篩選來自不同組織的多重cDNA文庫，以便獲得全長cDNA。進行cDNA 克隆時，常常難于鑒定編碼完整5’端編碼區(qū)的cDNA克隆，在這樣的事件中，可以使用 RACE(cDNA末端快速擴增)技術。RACE是業(yè)已證實的一種以PCR為基礎、擴增不完整cDNA 的5’端的策略。從人的胎盤合成的、含有唯一錨著序列的5’ -RACE-Ready RNA已有商品 (Clontech)。為了獲得cDNA的5，端，用所提供的錨著引物和3，引物對5，-RACE-Ready cDNA進行PCR。然后用被錨著的引物和一種巢式3’引物按照廠家建議進行第二輪PCR。一 旦獲得了全長cDNA序列，就可以將其翻譯成氨基酸序列，并檢查特定的標記(landmark)， 如，以翻譯起始和終止位點為兩側(cè)的連續(xù)的開放閱讀框，潛在的信號序列，以及整體結(jié)構與 本文所述BvS序列的相似性。備選地，可以使用下文所述的相應嚴格條件，用標記的探針篩選從目的生物衍生 的基因組文庫?？梢愿鶕?jù)本文所述的BvS編碼序列，設計兩個簡并寡核苷酸引物庫，通過聚合酶 鏈反應(PCR)分離出BvS編碼序列或同源序列。該反應的模板可以從，例如，人或非人細胞 系，或者已知或懷疑表達BvS等位基因的組織制備的mRNA進行反轉(zhuǎn)錄(RT)而獲得?？梢詫CR產(chǎn)物再克隆并測序，以確保所擴增的序列代表BvS的編碼序列。然后， 用PCR片段經(jīng)各種方法分離全長cDNA克隆。例如，可以將所擴增的片段進行標記，并用于 篩選噬菌體cDNA文庫。另一種方法是，用帶有標記的片段通過篩選基因組文庫來分離基因 組克隆。PCR技術也可以用于分離全長cDNA序列。例如，可以按照標準方法從相應的細胞 來源或組織來源分離RNA?？梢杂锰禺愑跀U增片段5’最末端的寡核苷酸引物對所述RNA進 行RT反應，從而引發(fā)第一鏈合成。然后，使所得RNA/DNA雜合體的尾部通過標準的末端轉(zhuǎn) 移酶反應而帶上(tailed with)鳥嘌呤，用RNAase H消化該雜合體，然后用poly-C引物引 發(fā)第二鏈合成。如此一來，可以輕易分離出擴增片段上游的cDNA序列。也可以利用，例如PCR，分離出BvS基因的突變體或等位基因變體的cDNA克隆。在 這種情況中，通過使oligo-dT寡核苷酸與從推定攜帶BvS等位基因突變的個體中已知或懷 疑表達BvS的組織分離得到的mRNA雜交來合成第一條cDNA鏈，并用逆轉(zhuǎn)錄酶延伸這條新 鏈。然后用與正?；虻?’末端特異性雜交的寡核苷酸合成第二條cDNA鏈。再用這兩種 引物將產(chǎn)物通過PCR進行擴增，克隆到合適的載體中，用本領域已知的方法進行DNA序列分 析。將BvS等位基因突變與正常的BvS等位基因的DNA序列進行比較，確定使突變的BvS 基因產(chǎn)物的功能發(fā)生損失或改變的突變。另一種方法是，從懷疑或已知攜帶突變的BvS等位基因的個體獲得DNA，用該DNA 構建基因組文庫；或者，從已知或懷疑表達突變的BvS等位基因的組織獲得RNA，用該RNA 構建cDNA文庫。再將未受損的(unimpaired)BvS基因或其任何合適的片段帶上標記，并用 作探針，來鑒定所述文庫中相應的突變的BvS等位基因。然后將包含所述不同的BvS基因 序列的克隆純化，按照本領域已知方法進行序列分析。另外，可以從懷疑或已知攜帶突變的BvS等位基因的個體中已知或懷疑表達該突 變的等位基因的組織分離出RNA，從該RNA合成cDNA，再用該cDNA構建表達文庫。在這種 方法中，由推定的突變組織制備的基因產(chǎn)物得以表達，并可以按照標準的抗體篩選技術，用 抗正常BvS基因產(chǎn)物的抗體進行篩選，如下所述。
本文中，術語核酸，多核苷酸和核苷酸可以互換使用，它們指任何核酸，無論是 脫氧核糖還是核糖核酸，也無論是由磷酸二酯鍵構成還是由下述經(jīng)過修飾的鍵構成， 所述經(jīng)過修飾的鍵如磷酸三酯，氨基磷酸酯，硅氧烷，碳酸酯，羧甲基酯，氨基乙酸酯 (acetamidate)，氨基甲酸酯，硫醚，橋聯(lián)(bridged)氨基磷酸酯，橋聯(lián)亞甲基膦酸酯，橋聯(lián) 氨基磷酸酯，橋聯(lián)氨基磷酸酯，橋聯(lián)亞甲基膦酸酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，二硫代磷酸 酯，橋聯(lián)硫代磷酸酯或磺內(nèi)酯(sultone)鍵，或這些鍵的組合。術語核酸，多核苷酸和核苷酸具體包括由除了 5種生物學天然堿基(腺嘌呤，鳥嘌 呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，和尿嘧啶)以外的其它堿基組成的核酸。例如，本發(fā)明的多核苷酸可 以包含至少一個選自下組的經(jīng)修飾的堿基5_氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿 嘧啶，次黃嘌呤，xantine，4-乙?；奏ぃ?-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨基甲 基-2-硫代尿苷，5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶，二氫尿嘧啶，beta-D-半乳糖基queosine， 次黃嘌呤核苷N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基次黃嘌呤核苷2，2- 二甲基鳥 嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基 鳥嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶，beta-D-甘露糖基 queosine, 5N-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代_N6_異戊烯基腺 嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2_硫代胞嘧啶，5_甲 基-2-硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基 酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，3-(3_氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧 啶，(acp3)w，和2，6_ 二氨基嘌呤。本發(fā)明所用的多核苷酸還可以包含至少一個修飾的糖組分，該糖組分選自阿拉伯 糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖，和己糖。本發(fā)明的方法并不想限定多核苷酸的來源。所述多核苷酸可以來自人或非人哺乳 動物，衍生自任何重組來源，通過體外合成或化學合成。所述核苷酸可以是DNA或RNA，可以 是雙鏈，單鏈或部分雙鏈形式。本發(fā)明有用的核酸包括，例如但不限于，寡核苷酸如反義DNA和/或RNA ；核酶；用 于基因治療的DNA ；DNA和/或RNA嵌合體；DNA的各種結(jié)構形式，包括單鏈DNA，雙鏈DNA， 超螺旋DNA和/或三螺旋DNA ；Z-DNA ；等等。核酸可以通過常用于大量制備核酸的任何常 規(guī)手段來制備。例如，DNA和RNA可以用市售試劑和合成儀按照本領域已知的方法進行化學 合成(參見，例如，Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis :A Practical Approach, IRL Press，牛津，英國)。RNA 可以例如諸如 SP65(Promega Corporation, Madison, WI)等質(zhì)粒 通過體外轉(zhuǎn)錄而大量制備。由BvS核酸序列編碼的任何mRNA轉(zhuǎn)錄子都可以用于本發(fā)明的方法中，包括對mRNA 前體進行旁路剪接或加工所得的mRNA轉(zhuǎn)錄子。在有些情況下，當希望增加核酸酶的穩(wěn)定性時，優(yōu)選具有修飾的核苷酸之間連接 鍵的核酸。具有修飾的核苷酸之間連接鍵的核酸也可以用本領域已知的試劑和方法合成。 例如，合成含有以下核苷酸之間連接鍵的核酸的方法是本領域已知的，所述連接鍵是指膦 酸硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，氨基磷酸甲氧基乙基氨基磷酸酯，甲乙縮醛(formacetal)， 硫代甲乙縮醛(thioformacetal)，二異丙基甲硅烷基(diisopropylsilyl)，氨基乙酸酯， 氨基甲酸酯，二亞甲基-硫醚(sulfide) (-CH2-S-CH2)，二亞甲基-亞砜(-CH2-S0_CH2)，二亞甲基-砜(-CH2-S02-CH2)，2，-0-烷基，和2’ -脫氧-2’ -氟硫代磷酸酯(參見，Uhlmarm 等，1990，Chem. Rev. 90 :543_584 ；Schneider 等，1990, Tetrahedron Lett. 31 335 以及其中 引用的參考文獻)。在本發(fā)明一些實施方案中，所用的核苷酸是α-端基異構(anomeric)核苷酸。 α -端基異構核苷酸與互補RNA形成特異性雙鏈雜合體，其中的鏈彼此平行，而不是形成通 常的 β-單位(Gautier 等，1987，Nucl. Acids Res. 15 :6131_6641)。所述核苷酸是 2N-0-甲 基核糖核苷酸(Inoue 等，1987，Nucl. Acids Res. 15 :6131_6148)，或嵌合 RNA-DNA 類似物 (Inoue 等，1987，F(xiàn)EBS Lett. 215 :327_330)。所述核酸可以用本領域已知的任何適當方法進行純化。例如，可以通過反相或離 子交換HPLC，大小排阻層析或凝膠電泳來純化核酸。當然，本領域技術人員應能認識到，純 化方法部分地取決于需要純化的DNA的大小。BvS編碼序列的經(jīng)過分離或純化并具有至少10個核苷酸(即可雜交部分)的多核 苷酸或其片段，也可以用于本發(fā)明的方法中。在其它實施方案中，所述多核苷酸包含BvS編 碼序列的至少25個(連續(xù))核苷酸，50個核苷酸，100個核苷酸，150個核苷酸，或200個核 苷酸，或包含BvS編碼序列的全長。核酸可以是單鏈或雙鏈。此外，本發(fā)明涉及與上述編碼 序列選擇性雜交的多核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，所述多核苷酸包含BvS編碼序列的至 少10，25，50，100，150或200個核苷酸或其全長。編碼BvS突變體，BvS肽片段，BvS截短形式，和BvS融合蛋白的核苷酸序列也可以 用于本發(fā)明的方法中。編碼融合蛋白的核苷酸包括，但不限于，全長BvS序列，BvS的截短 形式，或者與不相關蛋白或肽融合的編碼BvS肽片段的核苷酸，例如，與Ig Fc區(qū)融合而增 強所得融合蛋白(如BvS-Ig)在血流中的穩(wěn)定性和半壽期；或者酶，例如可以用作標志物的 熒光蛋白或發(fā)光蛋白。此外，本發(fā)明方法中可以使用至少部分地通過一些形式的變革，如基因改組和/ 或回歸(recursive)序列重組(美國專利5，605，793和5，837，458)而產(chǎn)生的Bv8多核苷 酸變體。例如，可以利用這樣的技術，以一或多個BvS編碼序列作為起始點，來產(chǎn)生編碼具 有改變的功能和/或結(jié)構特性的功能性和/或結(jié)構性類似蛋白的新序列。與上述編碼BvS的多核苷酸序列高度相關的基因同系物也可以用于本發(fā)明。高 度相關的基因同系物是編碼蛋白的多核苷酸，它們與天然BvS的氨基酸序列，例如圖2或 圖4(SEQ ID NOs 2和4)所示的人成熟Bv8的氨基酸序列，具有至少約60%的氨基酸序列 同一性，優(yōu)選至少約65 %，70 %，75 %，80 %，優(yōu)選以1 %的增量從至少約85 %遞增到至少約 99%的氨基酸序列同一性。高度相關的同系物可以編碼與BvS具有相同功能活性的蛋白。本發(fā)明方法的有利之處還在于可以利用以下物質(zhì)(a)DNA載體，包含上述任一種 BvS編碼序列和/或其互補體(即反義序列)；(b) DNA表達載體，包含上述任一種BvS編 碼序列、且該序列與指導其表達的調(diào)節(jié)元件可操作相連；(c)遺傳工程化宿主細胞，包含上 述任一種BvS編碼序列、且該序列與指導其在宿主細胞中表達的調(diào)節(jié)元件可操作相連；和 (d)遺傳工程化宿主細胞，其在外源引入的調(diào)節(jié)元件控制之下表達內(nèi)源BvS基因(即基因活 化)。天然序列BvS中或者本文所述BvS的結(jié)構域中的變異，可以通過，例如，進行保守 和非保守突變的任何技術和指南來產(chǎn)生，例如，參見美國專利5，364，934。變異可以是取代、缺失或插入一或多個編碼BvS的密碼子，使該BvS的氨基酸序列與天然序列BvS相比發(fā)生 改變。可選地，所述變異是將BvS的一或多個結(jié)構域中的至少一個氨基酸用另一氨基酸取 代。確定哪一個氨基酸殘基可以進行插入、取代或缺失而不影響所需活性的方法可以是，將 BvS的序列與已知的同源蛋白分子的序列進行比較，并使高度同源區(qū)域中氨基酸序列變化 的數(shù)量最小。氨基酸取代可以是將一個氨基酸替換為具有相似結(jié)構和/或化學特性的另一 氨基酸，如將亮氨酸替換為絲氨酸，即保守氨基酸替換。插入或缺失可以任選在約1-5個氨 基酸的范圍內(nèi)。所能允許的變異可以如下確定在所述序列中進行總體(systematically) 的氨基酸插入、缺失或取代，并檢驗所得變體是否具有全長或成熟天然序列的活性。BvS多肽片段也可以用于本發(fā)明方法中。這樣的片段可以是，與全長天然蛋白相 比，在N-末端或C-末端截短，或缺少內(nèi)部殘基。一些片段缺少BvS多肽的目標生物活性所 不必需的氨基酸殘基。BvS片段可以用多種常規(guī)技術中的任一種來制備。所需肽片段可以化學合成。另 外的方法涉及對BvS片段進行酶消化，例如用已知在特定氨基酸所占據(jù)的位點進行切割的 酶處理所述蛋白，或用合適的限制酶消化DNA并分離所需片段。另一種合適的技術涉及分 離并通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增編碼所需多肽片段的DNA片段。在PCR中，可以利用該 DNA片段所需末端的寡核苷酸作為5’和3’因為。優(yōu)選BvS多肽片段與天然BvS多肽具有 至少一種相同的生物學和/或免疫學活性。在具體實施方案中，感興趣的保守取代見表1的“優(yōu)選取代”欄。如果這些取代引 起生物學活性的改變，則可引入表1中“取代舉例”欄的更實質(zhì)性改變，或進一步在下文的 氨基酸分類中所述的更實質(zhì)性改變，并篩選產(chǎn)物。表1
原始殘基取代舉例優(yōu)選取代
Ala(A)val ；Ieu ；ileval
Arg(R)Iys ；gin ；asnIys
Ash(N)gin ；his ；asp, Iys ；arggin
Asp (D)glu ；asnglu
Cys(C)ser ；alaser
Gln(Q)asn ；gluasn
Glu(E)asp ；ginasp
Gly(G)alaala
His(H)asn ；gin ；Iys ；argarg
Ile(I)Ieu ；val ；met ；ala ；phe ；正亮氨酸leu
Leu(L)正亮氨酸；ile ；val ；met ；ala ；pheile
Lys(K)arg ；gin ；asnarg
Met (M)Ieu ；phe ；ileleu
Phe (F)Ieu ；val ；ile ；ala ；tyrtyr
Pro (P)alaala
Ser(S)thr ；cyscys
Thr(T)serser 22
Trp (W) tyr ；pheTyr (Y) trp ；phe ；thr ； serVal (V) ile ；Ieu ；met ；phe ；ala ；正亮氨酸
tyr
phe
IeuBvS多肽的功能或免疫學特性的實質(zhì)改變可通過選擇性取代來完成，所選的取代 應在維持(a)取代區(qū)多肽骨架的結(jié)構，例如片層結(jié)構或螺旋構象，(b)該分子的靶位點的電 荷或疏水性，(c)側(cè)鏈的大小，這幾方面有顯著不同的效應。天然殘基根據(jù)共有的側(cè)鏈特性 可分為(1)疏水性正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。也可以將這類取代殘基弓I入 保守取代位點，更優(yōu)選引入剩余(非保守)位點?？梢允褂帽绢I域已知方法如寡核苷酸_介導的(定點)誘變、丙氨酸掃描，和PCR 誘變技術來產(chǎn)生變異。可以對克隆的DNA實施定點誘變(Carter等，Nucl. Acids Res., 13 4331(1986) ；Zoller 等，Nucl. Acids Res.，10 :6487 (1987))、盒式誘變(Wells 等， Gene，34 :315 (1985))、限制選擇誘變(Wells 等，Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317 415(1986))或其它已知技術以產(chǎn)生Bv8變體DNA。掃描氨基酸分析也可用于沿鄰接序列鑒定一個或多個氨基酸。優(yōu)選的掃描氨基酸 是相對較小的中性氨基酸。此類氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。丙氨酸通 常是此組中優(yōu)選的掃描氨基酸，因為它不存在β “碳上的側(cè)鏈并且極少改變變體的主鏈構 象(Cunningham 和 Wells，Science, 244 1081-1085 (1989))。優(yōu)選丙氨酸的另一原因是因 為它是最常用氨基酸。而且，它常常既出現(xiàn)在埋藏位置也出現(xiàn)在暴露位置(Creight0n，The Proteins, (W. H. Freeman&Co. , N. Y.) ；Chothia，J. Mol. Biol.，150 1 (1976))。如果丙氨酸 取代不能產(chǎn)生足夠量的變體，則可使用同構(isoteric)氨基酸。2.制備Bv8和Bv8變體適合于制備BvS和BvS變體的技術是本領域已知的。鑒于優(yōu)選的技術對于BvS和 BvS變體而言是一樣的，因而下述技術既可以應用于BvS變體也可以應用于天然序列Bv8。優(yōu)選的制備方法包括從BvS的內(nèi)源性來源分離該多肽，肽合成(用肽合成儀)和 重組技術(或這些技術的任意組合)。以下論述主要涉及，通過培養(yǎng)已被含有BvS核酸的載體轉(zhuǎn)化的細胞并從培養(yǎng)物中 回收該多肽來重組制備Bv8。但本領域技術人員將認識到，還有其它很多種制備BvS的方法。簡言之，該方法涉及用構建體(即載體)轉(zhuǎn)化含有BvS編碼基因的原代人細胞，所 述構建體包含可以擴增的基因(如二氫葉酸還原酶(DHFR)或下述其它基因)和至少一個 側(cè)翼區(qū)，該側(cè)翼區(qū)有至少約150bp且與BvS基因編碼區(qū)座位上的DNA序列同源，因而能擴增 BvS基因。所述可以擴增的基因必須位于不影響B(tài)vS基因表達的位置。轉(zhuǎn)化應使得所述構建體同源整合到該原代細胞的基因組中，以便限定可以擴增的區(qū)域。。含有該構建體的原代細胞然后可以借助所述可以擴增的基因或該構建體中存在 的其它標記物來進行選擇。標記基因的存在可以確認該構建體在宿主基因組中的存在和整 合。不需要再對原代細胞進行其它選擇，因為可以在第二宿主中進行選擇。需要時，同源重 組事件的發(fā)生可以在進行PCR之后如下確定對所擴增的DNA序列測序，或者當存在來自正 確的同源整合體的DNA時確定PCR片段的合適長度并且僅僅擴增含有這類片段的細胞。另 外，如果需要，可以在這時，通過將適當?shù)臄U增試劑(當可以擴增的基因是DHFR時，擴增試 劑是氨甲蝶呤)作用于(stress)所選出的細胞，使這些細胞擴增，從而獲得靶基因的多個 拷貝。但優(yōu)選直到下述第二輪轉(zhuǎn)化之后再進行擴增步驟。上述擴增步驟之后，從所選的原代細胞中分離出具有足以包括完整可擴增區(qū)的大 小的基因組DNA部分。然后用這些基因組DNA部分轉(zhuǎn)化第二種哺乳動物表達宿主細胞，對 細胞進行克隆，選出包含可擴增區(qū)的克隆。然后，在可擴增區(qū)尚未在原代細胞中擴增的情況 下，用擴增試劑使可擴增區(qū)擴增。最后，對那些已包含多拷貝可擴增區(qū)(含有Bv8)的第二 種表達宿主細胞進行培養(yǎng)，從而表達所述基因并產(chǎn)生所述蛋白。編碼Bv8的DNA可以從cDNA文庫獲得，所述cDNA文庫是從據(jù)信具有Bv8mRNA并 且以可測得的水平表達BvS的組織制備的。因此，可以從人多重組織制備的cDNA文庫中很 方便地得到BvSDNA。也可以從基因組文庫或通過寡核苷酸合成來獲得編碼BvS的基因。文庫可以使用為鑒別目的基因或其編碼的蛋白而設計的探針(如抗BvS抗體或至 少約20-80個堿基的寡核苷酸)來篩選。用所選探針篩選cDNA或基因組文庫可以按照標 準操作進行，如 Sambrook 等在 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (New York : Co Id Spring Harbor Laboratory, 1989)中第10-12章所述方法。另一種分離Bv8編碼基因的方 法，是使用Sambrook等(出處同上)第14章所述的PCR方法。分離BvScDNA的優(yōu)選方法是，使用精心選出的寡核苷酸序列篩選來自各種 人組織的cDNA文庫。選作探針的寡核苷酸序列應當具有足夠的長度并且足夠明確 (unambiguous)，以便使假陽性出現(xiàn)機率最小。優(yōu)選的序列是從本文所述天然BvS獲得的。寡核苷酸必須帶有標記，使其能通過與正在篩選的文庫中的DNA雜交而被檢測。 優(yōu)選的標記方法是如本領域所公知的那樣，用32P-標記的ATP和多核苷酸激酶使寡核苷酸 帶上放射性標記。也可以使用其它方法標記寡核苷酸，包括但不限于，生物素標記或酶標 記?？梢詫⒕幋aBvS的核酸(如cDNA或基因組DNA)插入復制載體以便進一步克隆 (擴增該DNA)或進行表達。可以使用的載體有很多。載體組分通常包括，但不限于，以下一 或多項信號序列，復制起點，一或多個標記基因，增強子元件，啟動子，以及轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明的BvS不僅可以直接重組制備，還可以制備成與異源多肽融合的多肽，所 述異源多肽優(yōu)選信號序列或在成熟蛋白或多肽的N-末端具有特異性切割位點的其它多 肽。通常，信號序列可以是載體的組分，或者是插入該載體的BvSDNA的一部分。所選的異源 信號序列優(yōu)選是能被宿主細胞識別并加工(即被信號肽酶切割)的信號序列。對于不能識 別并加工天然BvS信號序列的原核宿主細胞來說，可以將信號序列替換為選自下組的原核 信號序列堿性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或熱穩(wěn)定腸毒素II前導序列。為了進 酵母分泌， 可以將天然信號序列替換為，例如，酵母轉(zhuǎn)化酶前導序列，α因子前導序列(包括糖酵母α因子前導序列和1991年4月23日授權的美國專利5，010, 182所述的克魯維酵母α因子 前導序列)，或酸性磷酸酶前導序列，白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導序列(EP 362，179，公 開于1990年4月4日)，或于1990年11月15日公開的WO 90/13646描述的信號。在哺 乳動物細胞表達中，天然信號序列(如通常在體內(nèi)指導BvS從人的細胞中分泌的BvS前序 列)可以滿足要求，但其它哺乳動物信號序列也是適合的，如來自其它動物BvS多肽的信號 序列，來自相同或相關物種的分泌多肽的信號序列，以及病毒的分泌前導序列，如單純皰疹 病毒gD信號?？梢詫⑺銮绑w區(qū)域的DNA與編碼成熟BvS或其可溶性變體的DNA連接在同一個 閱讀框內(nèi)。表達載體和克隆載體都包含能使該載體在一或多種選定的宿主細胞中復制的核 酸序列。一般情況下，在克隆載體中，這種序列是能使該載體獨立于宿主染色體DNA而復制 的序列，包括復制起點或自我復制序列。這樣的序列在各種細菌、酵母和病毒中都是眾所周 知的。質(zhì)粒pBR322的復制起點適合大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2 μ質(zhì)粒起點適合酵母菌，多種 病毒起點(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳動物細胞中的克隆 載體。復制起點組分一般不是哺乳動物表達載體所必需的(SV40起點的使用通常僅僅是由 于其包含早期啟動子)。大多數(shù)表達載體都是“穿梭”載體，即它們能在至少一類生物中復制但可以轉(zhuǎn)移到 另一生物中進行表達。例如，可以在大腸桿菌中克隆出載體，然后將該載體轉(zhuǎn)移到酵母或哺 乳動物細胞中進行表達，即使它不能獨立于宿主細胞染色體而復制也無所謂。DNA也可以通過插入宿主基因組而擴增。這可以利用芽孢桿菌作為宿主，通過，例 如在該載體中包含與芽孢桿菌基因組DNA中找到的序列互補的DNA序列而很容易地實現(xiàn)。 用該載體轉(zhuǎn)化芽孢桿菌導致基因組與BvSDNA插入片段之間發(fā)生同源重組。但編碼BvS的 基因組DNA的回收比外源復制載體的回收更復雜，因為必需用限制酶消化BvSDNA。表達載體和克隆載體應該包含選擇基因，也稱選擇標記。該基因編碼使經(jīng)過轉(zhuǎn)化 的宿主細胞在選擇性培養(yǎng)基中存活或生長所必需的蛋白。沒有被包含該選擇基因的載體 轉(zhuǎn)化的宿主細胞在所述選擇性培養(yǎng)基中不能存活。典型的選擇基因編碼具有以下性質(zhì)的 蛋白(a)賦予對抗生素或其它毒素(如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性， (b)彌補營養(yǎng)缺陷，或(c)提供復合培養(yǎng)基不能供給的關鍵營養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙 氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個實例是利用藥物限制(arrest)宿主細胞的生長。那些被異源基 因成功轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生一種賦予藥物抗性的蛋白，從而在該選擇環(huán)境中存活。這種顯性選 擇可以采用的藥物有新霉素，霉酚酸和潮霉素。適合于哺乳動物細胞的另一例選擇標記是允許鑒定能攝取BvS核酸的細胞的那 些，如DHFR或胸苷激酶?？梢詫⒉溉閯游锛毎D(zhuǎn)化體置于僅有轉(zhuǎn)化體能通過攝取該標記物 而存活的選擇壓力下。選擇壓力通過將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在具有連續(xù)變化的選擇試劑濃度的培養(yǎng) 基中來實施，所述連續(xù)變化的濃度導致選擇基因和編碼BvS的DNA都被擴增。擴增是指，對 生長十分關鍵的那些蛋白的生產(chǎn)所重點需要的基因在連續(xù)數(shù)代重組細胞的染色體中被不 斷復制(reiterated in tandem)的過程。擴增的DNA不斷地合成Bv8。擴增基因的其它實 例包括金屬硫蛋白-I和-II，優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因，腺苷脫氨酶，鳥氨酸脫羧酶等。一種優(yōu)選的載體系統(tǒng)可參見美國專利5，561，053。例如，用DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細胞首先通過將所有轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在包含氨甲蝶呤 (Mtx，為DHFR的一種競爭型拮抗劑)的培養(yǎng)基中來進行鑒定。當采用野生型DHFR時，合適 的宿主細胞包括DHFR活性有缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系，其制備和增殖參見Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216 (1980)。然后將經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細胞暴露于濃度漸增的 氨甲蝶呤。這導致合成多拷貝的DHFR基因，同時還合成多拷貝的包含在所述表達載體中的 其它DNA，如編碼BvS的DNA。當采用Mtx高抗性DHFR突變基因時，這種擴增技術可以使用 其它合適的宿主細胞，如ATCC CCL61 CHO-Kl，盡管它存在內(nèi)源DHFR(EP 117,060)?；蛘?，宿主細胞(尤其包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)被編碼BvS的DNA序列，野生 型DHFR蛋白，以及另一種選擇標記如氨基糖苷3’ -磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化以后， 可以通過在含有針對該選擇標記的選擇試劑如氨基糖苷類抗生素(如卡那霉素，新霉素或 G418)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來進行選擇。參見美國專利4，965，199。適用于酵母的合適選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb 等，Nature, 282 :39(1979))。Trpl基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變株(例如ATCC 44076 或 PEP4-1)提供了選擇標記(Jones, Genetics，85 :12 (1977))。此后，酵母宿主細 胞基因組中trpl損傷的存在提供了通過在缺乏色氨酸的條件中生長而檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán) 境。類似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20，622或38，626)可以由攜帶Leu2基因的已 知質(zhì)粒來互補。此外，源自1. 6 μ m環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可以用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母(Kluyveromyces)。 Bianchi 等，Curr. Genet. ,12 185 (1987)。 最近，Van den Berg, Bio/Technology, 8 135(1990)報道了一種用于在乳克魯維酵母(K. Iactis)中大規(guī)模制備重組小牛凝乳酶的 表達系統(tǒng)。還有人公開了用于通過克魯維酵母工業(yè)菌株分泌成熟重組人血清白蛋白的穩(wěn) 定、多拷貝表達載體。Fleer 等，Bio/Technology, 9 :968_975 (1991)。表達載體和克隆載體通常包含能被宿主生物識別的啟動子，它與BvS核酸可操作 相連。啟動子是位于結(jié)構基因的起始密碼子上游(5’，一般相距不超過大約IOO-IOOObp) 的非翻譯序列，它控制著與之可操作相連的具體核酸序列，如BvS核酸序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。 這種啟動子通常分為誘導型和組成型這兩類。誘導型啟動子，當培養(yǎng)條件發(fā)生一些改變，例 如存在或缺乏某種營養(yǎng)，或者溫度改變時，應答這樣的改變而使受其控制的DNA的轉(zhuǎn)錄水 平升高的那些啟動子。迄今為止，由不同的宿主細胞識別的非常多種啟動子已為本領域熟 知。通過限制酶消化而從來源DNA取出啟動子，并將分離的啟動子序列插入載體，從而將這 些啟動子與編碼BvS的DNA可操作相連。天然BvS啟動子序列和多種異源啟動子都可以用 于指導BvSDNA的擴增和/或表達。但優(yōu)選異源啟動子，因為它們與天然BvS啟動子相比， 通過能引起B(yǎng)vS的更強轉(zhuǎn)錄并獲得更高的產(chǎn)量。適用于原核宿主的啟動子，包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)(Chang等， Nature, 275 615(1978) ；Goeddel 等，Nature, 281 :544 (1979))，堿性磷酸酶，色氨酸(trp) 啟動子系統(tǒng)(Goeddel，Nucleic acids Res.，8 :4057 (1980) ；EP36776)，和雜化啟動子如 tac 啟動子。deBoer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 :21_25(1983)。也可以使用其它已知 的細菌啟動子。它們的核苷酸序列已經(jīng)公開，因此本領域技術人員可以利用接頭或銜接子 來提供任何所需的限制性位點，將已知啟動子與編碼BvS的DNA可操作相連(Siebenlist等，Cell，20 =269(1980)) 0適用于細菌系統(tǒng)的啟動子還可以包含與編碼Bv8的DNA可操作 相連的 Shine-Dalgamo (S. D.)序列。真核生物的啟動子序列也是已知的。幾乎所有的真核基因在轉(zhuǎn)錄起始點上游約 25-30個堿基處具有AT-富集區(qū)。很多基因在其轉(zhuǎn)錄起始點上游70-80個堿基處有另一種 序列CXCAAT，其中X可以是任何核苷酸。大多數(shù)真核基因的3’端是AATAAA序列，它可以 作為一種信號用于將poly-Α尾添加到編碼序列3’端。所有這些序列都適合于插入真核表 達載體中。適用于酵母宿主的啟動序列的實例包括:3_磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J. Biol. Chem.，255 2073 (1980))或其它糖酵解酶(Hess 等，J. Adv. EnzymeReg.，7 149 (1968)； Holland, Biochemistry, 17 =4900(1978))的啟動子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油 醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖_6磷酸異構酶，3-磷酸 甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶。其它的酵母啟動子，即那些還具有由生長條件控制轉(zhuǎn)錄的優(yōu)點的誘導型啟動子， 是下述基因的啟動子區(qū)醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、 金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73，657中進 一步描述了適用于酵母表達系統(tǒng)的載體和啟動子。酵母增強子與酵母啟動子聯(lián)合使用也是 有利的。在哺乳動物宿主細胞中，從載體轉(zhuǎn)錄BvS可以受啟動子調(diào)控，所述啟動子例如來 自病毒基因組，如多形瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如 腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒 40(SV40)的啟動子，或者來自異源哺乳動物的啟動子，如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟 動子等，來自熱休克啟動子，以及來自通常與BvS序列相連的啟動子，前提是這些啟動子與 宿主細胞系統(tǒng)相容。SV40病毒的早期和晚期啟動子可以作為還包含SV40病毒復制起點的SV40限 制性片段而方便地獲得。Fiers 等，Nature，273 :113 (1978) ；Mulligan 等，Science, 209 1422-1427 (1980) ；Pavlalcis 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 :7398_7402 (1981)。人巨 細胞病毒的即早期啟動子可以作為Hind III E限制性片段方便地獲得。Greenaway等， Gene, 18 :355_360 (1982)。美國專利4，419，446中公開了在哺乳動物宿主中用牛乳頭瘤病 毒作為載體來表達DNA的系統(tǒng)。美國專利4，601，978中敘述了對這個系統(tǒng)改進。另見Gray 等，Nature，295 =503-508(1982)中關于在猴細胞中表達編碼免疫干擾素的cDNA ；Reyes等， Nature, 297 =598-601(1982)中關于在單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子控制下在小鼠細胞中 表達人 β 干擾素 cDNA ；Canaani 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 5166-5170 (1982)中關 于在培養(yǎng)的小鼠和兔細胞中表達人干擾素β 1基因；以及Gorman等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 6777-6781(1982)關于在CV-I猴腎細胞、雞胚成纖維細胞、中國倉鼠卵巢細胞、 HeLa細胞和小鼠OTH-3T3細胞中，用勞氏肉瘤病毒長末端重復序列作為啟動子來表達細菌 CAT序列。編碼BvS的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄常常通過將增強子序列插入載體中來 增加。增強子是作用于啟動子以增加其轉(zhuǎn)錄的DNA順式作用元件，一般約10 300bp。增 強子相對不太依賴于方向和位置，見于轉(zhuǎn)錄單元的5，端(Laimins等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 78 993(1981))和 3，端(Luslcy 等，Mol. Cell Bio.，3 1108 (1983)),內(nèi)含子內(nèi)部 (Banerji 等，Cell，33 729(1983)),以及編碼序列的內(nèi)部。Osborne 等，Mol. Cell Bio.，4 1293(1984)。目前已知很多哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島 素)的增強子序列。但通常使用真核細胞病毒的增強子。實例包括在其復制起始點晚期側(cè) 的SV40增強子(bp 100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在其復制起始點晚期側(cè)的多 形瘤增強子，和腺病毒增強子。也可參見Yaniv，Nature，297 17-18 (1982)所述用于活化真 核啟動子的增強元件。所述增強子可以剪接插入載體中BvS編碼序列的5’或3’側(cè)，但優(yōu) 選位于啟動子的5’側(cè)。用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有 核細胞)的表達載體，還包括對轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。這些序列通常來自真 核或病毒DNA或cDNA的5’ (偶爾為3’)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼BvS的mRNA 的非翻譯區(qū)中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。包含上述一或多個組分的合適載體的構建可以利用標準連接技術。分離的質(zhì)?；?DNA片段經(jīng)過切割，修剪(tailored)，并重新連接為所需形式，以便產(chǎn)生所需質(zhì)粒。為了通過分析來證實所構建的質(zhì)粒中的正確序列，可用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 K12菌株294(ATCC 31，446)，并用相應的氨芐青霉素或四環(huán)素抗性選擇成功的轉(zhuǎn)化子。從 轉(zhuǎn)化子制備質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切核酸酶消化來分析，和/或用Messing等，Nucleic Acids Res.，9 309(1981)所述方法或 Maxam 等，Methods in Enzymology, 65 499(1980)所述方 法測序。在BvS和BvS變體的制備中特別有用的是，能在哺乳動物細胞中瞬時表達編碼BvS 的DNA的表達載體。通常，瞬時表達涉及應用能在宿主細胞中有效復制的表達載體，從而 該宿主細胞積累所述表達載體的多個拷貝，并合成高水平的由該表達載體所編碼的所需多 肽。Sambrook等，出處同上pp. 16. 17-16. 22。包含適宜表達載體及宿主細胞的瞬時表達系 統(tǒng)，允許對克隆化DNA所編碼的多肽進行方便地陽性鑒定，還允許快速篩選這些多肽的所 需生物特性或生理特性。因此，瞬時表達系統(tǒng)特別可用于本發(fā)明鑒定具有BvS生物活性的 BvS類似物和變體的目的。適應于在重組脊椎動物細胞培養(yǎng)物中合成BvS的其它方法，載體，和宿主細胞 在 Gething 等，Nature, 293 :620_625 (1981) ；Mantei 等，Nature, 281 40-46 (1979) ；EP 117，060 JPEP 117，058中描述。特別可用于BvS的哺乳動物細胞培養(yǎng)表達的質(zhì)粒是 pRK5 (EP 307,247)或 pSVI6B。WO 91/08291，1991 年 6 月 13 日公開?？寺』虮磉_本文所述載體中DNA的適宜宿主細胞，包括原核生物、酵母或高等真 核細胞。適于此目的的原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌，例如腸桿 菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌屬(Escherichia)，例如，大腸桿菌(E. coli), 腸桿菌屬(Enterobacter)，歐文菌屬(Erwinia)，克雷白菌屬(Klebsiella)，變形菌桿屬 (Proteus)，沙門菌屬(Salmonella)(如鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium))，沙雷 菌屬(Serratia)(如粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescans))和志賀菌屬(Shigella)等，以及 芽孢桿菌屬(Bacilli)如枯草芽孢桿菌(B. subtilis)和地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis) (例如1989年4月12日出版的DD 266，710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬 (Pseudomonas)如銅綠菌假單胞菌(P. aeruginosa)，及鏈霉菌(Str印tomyces)。優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294 (ATCC 31，446)，但其它菌株，如大腸桿菌B，大腸桿菌 X1776(ATCC 31,537)和大腸桿菌W3110 (ATCC 27, 325)也是合適的。這些實例是用于說明， 并非限制。W3110株是一個特別優(yōu)選的宿主或親本宿主，因為它是重組DNA產(chǎn)物發(fā)酵常用 的宿主菌株。優(yōu)選地，宿主細胞分泌少量蛋白水解酶。例如，可以修飾W3110株以使編碼蛋 白的基因中發(fā)生遺傳突變，此類宿主的實例包括大腸桿菌W3110株27C7。27C7的完整基因 型是 tonA Δ ptr3 phoA Δ Ε15 Δ (argF-lac) 169ompT Δ degP41kanr。菌株 27C7 已于 1991 年 10月31日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，保藏 號為ATCC 55，244。或者，可以采用1990年8月7日授權的美國專利4，946，783中公開的 具有突變型周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌株。除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適合于BvS編碼載體的克隆或 表達宿主。釀酒酵母或常見的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。還有多個其它 屬、種和株已有商品供應，并且可以用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe) (Beach 等，Nature，290 140 (1981) ； 1985 年 5 月 2 日公布的 EP 139,383)；克魯維酵 母屬(Kluyveromyces)宿主(美國專利4，943，529 ；Fleer等，出處同上)，例如乳克魯維酵 母(K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574 ；Louvencourt 等，J. Bacteriol.，737 (1983))、脆 壁克魯維酵母(K. fragilis) (ATCC 12，424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus) (ATCC 16，045)、威克曼氏克魯維酵母(K. wickeramii) (ATCC24, 178)、K. waltii (ATCC 56，500)、 果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum) (ATCC36, 906 ；Van den Berg等，出處同上)、耐熱克 魯維酵母(K. thermotolerans)和馬克斯克魯維氏酵母(K. marxianus)等；yarrowia(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris) (EP 183，070 ;Sreekrishna 等，J.Basic Microbiol. ,28 265-278(1988))；念珠菌 M ；Trichoderma reesia(EP 244，234)；粗 糙鏈孢霉(Case 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 :5259_5263 (1979))；許旺氏酵母屬 (schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis) (1990 年 10 月 31日公布的EP 394, 538)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、T0lyp0Cladium(1991 年1月10日公布的WO 91/00357)以及曲霉屬宿主如構巢曲霉(Ballance等，Biochem. Biophys. Res. Commun.，112 :284_289 (1983) ；Tilburn 等，Gene，26 :205_221 (1983) ；Yelton 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81 :1470_1474(1984))和黑曲霉等(Kelly 等，EMBO J. ,4 475-479(1985))。適合于表達糖基化BvS的宿主細胞來自多細胞生物。這樣的宿主細胞能將加工 活性和糖基化活性組合在一起。原則上，任何高等真核細胞培養(yǎng)物都是可以的，無論它來 自脊椎動物培養(yǎng)物還是無脊椎動物培養(yǎng)物。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細 胞。目前已經(jīng)從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒株和變體以及相應的容許型昆蟲宿主 細胞草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda，毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白 紋伊岐(Aedes albopictus,岐子)、Drosophila melanogaster (果蠅)禾口家蠶蛾(Bombyx mori)等。參見，例如 Luckow 等，Bio/Technology,6 47-55(1988) ；Miller 等，在 Genetic Engineering 中，Setlow 等編，Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277—279 ；Maeda 等， Nature, 315 =592-594(1985)。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒株可以公開地獲得，例如加利福尼亞Y 級夜蛾(Autographa California)NPV的L-I變體和家蠶蛾NPV的Bm_5株，并且這些病毒 可以在此用作本發(fā)明的病毒，尤其是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細胞。
棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草的植物細胞培養(yǎng)物也可以用作宿 主。通常，植物細胞通過與事先經(jīng)過操作而含有Bv8-DNA的根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株一起保溫來進行轉(zhuǎn)染。在植物細胞培養(yǎng)物與根癌土壤桿菌一起保溫期 間，編碼BvS的DNA被轉(zhuǎn)移到該植物細胞宿主中，使它被轉(zhuǎn)染，然后在適當?shù)臈l件下表達編 碼BvS的DNA。此外，與植物細胞相容的調(diào)節(jié)序列和信號序列也是可以獲得的，如胭脂氨酸 合成酶啟動子和聚腺苷酸化信號序列。D印iclcer等，J.Mol.Appl.Gen.，1 :561(1982)。此 外，從T-DNA 780基因上游區(qū)分離的DNA節(jié)段能活化或增加含有重組DNA的植物組織中植 物可表達型基因的轉(zhuǎn)錄水平。EP 321，196，1989年6月21日公開。然而，關注最多的是脊椎動物細胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊椎動物細胞 已經(jīng)成為常規(guī)方法。參見，例如 Tissue Culture,Academic Press,Kruse and Patterson, 編(1973)。有效哺乳動物宿主細胞系的實例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl細胞系(C0S_7，ATCC CRL 1651)；人胚腎細胞系(293細胞或經(jīng)過再克隆以便能在懸浮培養(yǎng)物中生長的293細胞， Graham 等，J. Gen Virol. 36 59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK, ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵 巢細胞/-DHFR(CH0，Urlaub 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 77 4216 (1980))；小鼠足細 胞(ΤΜ4，Mather，Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))；猴腎細胞(CVIATCC CCL 70)；非洲綠 猴腎細胞(VER0-76, ATCC CRL-1587)；人宮頸癌細胞 OffiLA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2, HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)； TRI 細胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 :44_68 (1982)) ；MRC 5 細胞；FS4 細胞；和人肝細胞癌細胞系Ofep G2)。宿主細胞用上述用于制備BvS的表達或克隆載體轉(zhuǎn)染(優(yōu)選轉(zhuǎn)化)，并在改進型傳 統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經(jīng)改進已適于誘導啟動子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴增編碼所需 序列的基因。轉(zhuǎn)染是指由宿主細胞攝取表達載體，而不論事實上是否表達了任何編碼序列。多 種轉(zhuǎn)染方法是本領域普通技術人員已知的，例如，CaPOjX淀和電穿孔。成功的轉(zhuǎn)染一般在 宿主細胞中出現(xiàn)關于該載體操作的任何征兆時可以予以識別。轉(zhuǎn)化是指，將DNA引入生物體，使DNA能夠作為染色體外元件或以染色體整合體 的形式復制。根據(jù)所用的宿主細胞，用適合于所述細胞的標準技術進行轉(zhuǎn)化。利用氯化鈣 進行鈣處理的方法(見Sambrook等，出處同上的1.82章節(jié))或電穿孔常用于包含堅固的 細胞壁屏障的原核細胞或其它細胞。用根癌土壤桿菌進行的感染可以用于轉(zhuǎn)化一些植物細 胞，參見Shaw等，Gene，23 :315 (1983)以及1989年6月29日公開的WO 89/05859。此外， 植物可以用1991年1月10日公開的WO 91/00358中所述的超聲處理方法進行轉(zhuǎn)染。對于沒有所述細胞壁的哺乳動物細胞，優(yōu)選Graham等，Virology, 52 456-457(1978)所述的磷酸鈣沉淀法。哺乳動物細胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的綜述見1983年8月 16日公布的美國專利4，399，216。酵母轉(zhuǎn)化通常根據(jù)Van Solingen等，J. Bact.，130 946 (1977)和 Hsiao 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 3829 (1979)所述方法進行。但也可 使用將DNA引入細胞中的其它方法，如核顯微注射、電穿孔、使細菌原生質(zhì)體與完整無損的 (intact)細胞融合，或聚陽離子如polybrene，聚鳥氨酸等。哺乳動物細胞轉(zhuǎn)化的各種技 術可參見 Keown 等，Methods in Enzymology, 185 :527_537 (1990)和 Mansour 等，Nature,336 348-352(1988)。用于產(chǎn)生BvS多肽的原核細胞在Sambrook等，出處同上所一般性描述的合適培養(yǎng) 基中進行培養(yǎng)。用于產(chǎn)生本發(fā)明BvS的真核宿主細胞可以在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如 Ham，s FlO(Sigma)，基本必需培養(yǎng)基((MEM) Sigma)，RPMI-1640 (Signma)，和 Dulbecco 改 良Eagle培養(yǎng)基((DMEM)，Sigma)都適于培養(yǎng)所述宿主細胞。此外，Ham and Wallace, Meth. Enz.，58 44 (1979)，Barnes 等，Anal. Biochem.，102 255 (1980)，U. S. 4，767，704 ； 4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；WO 90/03430 ；WO 87/00195 ；U. S. Pat. Re. 30，985所述的任一種培養(yǎng)基也可以用作宿主細胞培養(yǎng)基。任何上述培養(yǎng)基可以根據(jù) 需要添加激素和/或其它生長因子(如胰島素，運鐵蛋白，或表皮生長因子)，鹽(如氯 化鈉，韓，鎂，和磷酸鹽)，緩沖液(如HEPES)，核苷(如腺苷和胸腺嘧啶)，抗生素(如 Gentamycin )，痕量元素(定義為通常以微摩爾水平的終濃度出現(xiàn)的無機化合物)，和葡萄 糖或等效能源。還可以包括本領域技術人員已知的適當濃度的任何其它必需添加物。培養(yǎng) 條件，如溫度，PH等，都是前面在選定的表達宿主上用到的那些，并且對本領域技術人員而 言也是顯而易見的。通常，使哺乳動物細胞培養(yǎng)物的生產(chǎn)力最大化的原則、方案、以及具體技術可以 參見 Mammalian Cell Biotechnology :aPractical Apprcach, Μ· Butler,編(IRL Press, 1991)。該文獻中提到的宿主細胞包括培養(yǎng)的細胞以及宿主動物體內(nèi)的細胞?；驍U增和/或表達，可以基于本文提供的序列選擇適當標記的探針，利用諸如 常規(guī) Southern 印跡、測定 mRNA 轉(zhuǎn)錄量的 Northern 印跡(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :5201-5205(1980))、點印跡(DNA分析)或原位雜交，直接在樣品中測定。可以采用 各種標記，最常見放射性同位素，尤其是32P。也可以采用其它技術，如用生物素修飾的核苷 酸來引入多核苷酸。該生物素然后可以作為親和素或抗體的結(jié)合位點，后者可以帶有各種 標記，如放射性核素，熒光，酶等等。或者，可以使用能夠識別特異雙鏈體的抗體，所述雙鏈 體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜合雙鏈體或者DNA-蛋白雙鏈體?？贵w也可以 帶有標記，試驗在雙鏈體與表面結(jié)合之處進行，因此通過在表面形成雙鏈體可以檢測與雙 鏈體結(jié)合的抗體的存在?；蛘撸虮磉_可以通過免疫學方法，如組織切片的免疫組化染色和細胞培養(yǎng)物 或體液的分析來測定，以便直接確定基因產(chǎn)物的表達量。有了免疫組化染色技術，就可以制 備細胞樣品(通常通過脫水和固定來制備)，然后將其與特異于所結(jié)合的基因產(chǎn)物的標記 抗體反應，所述標記一般是可以目測觀察到的，如酶標記，熒光標記，發(fā)光標記等。適用于本 發(fā)明的一種具體的敏感染色技術可參見Hsu等，Am. J.Clin Path. ,75 :734_738 (1980)。適用于免疫組化染色和/或樣品液分析的抗體，可以是單克隆抗體或多克隆抗 體，并且可以如本文所述進行制備。BvS優(yōu)選從培養(yǎng)基中回收，為分泌多肽的形式，也可以從宿主細胞裂解物回收。如 果BvS為膜結(jié)合型，可以用合適的去污劑溶液(例如Triton-ΧΙΟΟ)從膜上釋放。當BvS是在重組細胞中產(chǎn)生而不是從人源產(chǎn)生時，該BvS完全不含人源蛋白或多 肽。但必需從重組細胞蛋白或多肽純化Bv8，以獲得本質(zhì)上均一的BvS制劑。第一步，可以使培養(yǎng)基或裂解物離心以除去微粒狀細胞殘渣。然后用以下舉例說明的適宜純化方法， 從污染的可溶性蛋白和多肽中純化出BvS 在離子-交換柱上分級分離；乙醇沉淀；反相 HPLC ；硅層析；層析聚焦；免疫親和；表位_標簽結(jié)合樹脂；SDS-PAGE ；硫酸銨沉淀；使用例 如S印hadex G-75進行凝膠過濾；和蛋白A Sepharose柱以除去污染物如IgG。3.修飾 Bv8本發(fā)明包括BvS和BvS變體的共價修飾。一種共價修飾形式包括使BvS多肽的靶 氨基酸殘基與能與該BvS的選定側(cè)鏈或N-或C-末端殘基發(fā)生反應的有機衍化劑進行反 應。用雙功能劑進行的衍化可以用于，例如，使BvS與水溶性支持物基質(zhì)或表面發(fā)生交聯(lián)， 以便在純化抗-BvS抗體的方法中使用，反之亦然。常用的交聯(lián)劑包括，例如，1，1_雙(二偶 氮乙?；?-2-苯乙烷，戊二醛，N-羥琥珀酰亞胺酯，如與4-疊氮基水楊酸的酯，同型雙功 能酰亞胺酯，包括二琥珀酰亞胺酯如3，3' -二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)、雙功能馬 來酰亞胺如雙-N-馬來酰亞胺-1，8-辛烷和試劑如甲基-3-[(對-疊氮苯基)二硫]丙炔 亞胺酯。其它修飾包括，谷氨酰胺基和天冬酰胺基分別脫酰胺成為相應的谷氨酰基和天 冬氨?；?，脯氨酸和賴氨酸羥基化，絲氨酰或蘇氨酰殘基的羥基磷酸化，賴氨酸、精氨酸和 組氨酸側(cè)鏈的 α -氨基甲基化(Τ· E. Creighton，Proteins :Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman&Co.，San Francisco, pp. 79-86 (1983))，N-末端胺的乙?；?，以 及任何C-末端羧基的酰胺化。本發(fā)明還包括BvS多肽的另一類共價修飾，所述共價修飾包括改變多肽的天然糖 基化模式?！案淖兲烊惶腔Ｊ健睘楸疚哪康氖侵?，刪除天然序列BvS中一個或多個糖組 分(方法是除去潛在的糖基化位點或利用化學和/或酶手段消除糖基化)，和/或添加一或 多個在天然序列BvS中本不存在的糖基化位點。此外，該短語包括天然蛋白糖基化中的性 質(zhì)變化，它涉及不同糖組分在性質(zhì)和比例上的變化。在BvS多肽中添加糖基化位點還可以通過改變氨基酸序列來現(xiàn)。所述改變可以 是，例如，向天然序列BvS中添加、或取代一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(對0-連接糖基化 位點而言)。任選地，可以通過DNA水平的變化，特別是通過使編碼BvS多肽的DNA中的預 定堿基發(fā)生突變從而產(chǎn)生出翻譯所需氨基酸的密碼子，來改變BvS的氨基酸序列。另一種增加BvS多肽上糖組分數(shù)目的方法是，將配糖體(glycolside)通過化 學處理或酶處理而與所述多肽偶聯(lián)。這類方法可參見，例如1987年9月11日公布的WO 87/05330，以及 Aplin 和 Wriston，CRC Crit. Rev. Biochem.第 259-306 頁(1981)。BvS多肽中糖組分的去除可以通過化學處理或酶處理來實現(xiàn)，或者通過使編碼 糖基化靶點的氨基酸殘基的密碼子發(fā)生突變性取代來實現(xiàn)?；瘜W脫糖基化技術為本領域 所公知，例如參見 Hakimuddin 等，Arch. Biochem. Biophys.，259 52 (1987)和 Edge 等， Anal. Biochem.，118 :131(1981)。多肽上糖組分的酶切除可以利用Thotakura等，Meth. Enzymol.，138 350 (1987)所述的各種內(nèi)-和外-糖苷酶來實現(xiàn)。Bv8的另一類共價修飾包括，按照美國專利4, 640,835,4, 496,689 ；4, 301, 144、 4，670，417 ；4, 791, 192或4，179，337所述方式，將Bv8多肽連接與諸如聚乙二醇(PEG)、聚 丙二醇或聚氧化烯等各種非蛋白聚合物之一連接。本發(fā)明BvS也可被修飾成嵌合分子，其中包含與另一異源多肽或氨基酸序列融合的 Bv80在一個實施方案中，所述嵌合分子包含BvS與標簽多肽所形成的融合體，該 標簽多肽提供抗-標簽抗體可以選擇性結(jié)合的表位。表位標簽一般位于BvS的氨 基_或羧基_末端。BvS的這類表位-標記形式的存在可以使用抗標簽多肽的抗體來 檢測。另外，提供表位標簽，使BvS能利用抗-標簽抗體或另一類與該表位標簽結(jié)合 的親和基質(zhì)容易地進行親和純化。各種標簽多肽及其各自的抗體是本領域眾所周知 的。實例包括聚-組氨酸(poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標簽； flue HA 標簽多肽及其抗體 12CA5 (Field 等，Mol. Cell. Biol.，8 :2159_2165 (1988))； c-myc 標簽以及針對它的 8F9、3C7、6E10、G4、B7 禾Π 9Ε10 抗體(Evan 等，Molecular and Cellular Biology，5 :3610_3616 (1985))；單純皰疹病毒糖蛋白 D (gD)標簽及其 抗體(Paborsky 等，Protein Engineering, 3 (6) :547_553 (1990))。其它標簽多肽包 括 Flag-肽(Hopp 等，BioTechnology, 6 12041210 (1988)) ；KT3 表位肽(Martin 等， Science, 255 192-194 (1992)) ；α-微管蛋白表位肽(Skinner 等，J. Biol. Chem.，266 15163-15166(1991))；和 T7 基因 10 蛋白肽標簽(Lutz-Freyermuth 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87 6393-6397(1990))。在另一實施方案中，嵌合分子可包括BvS與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區(qū)域的 融合。對于二價形式的嵌合分子(也稱“免疫粘附素”)而言，所述融合可以是與IgG分子 的Fc區(qū)融合。最簡單和最直接的免疫粘附素設計是將“粘附素”蛋白的結(jié)合區(qū)與免疫球蛋白重 鏈的鉸鏈區(qū)和Fc區(qū)結(jié)合。通常，制備本發(fā)明所用的BvS-免疫球蛋白嵌合體時，將編碼BvS 的核酸在C末端與編碼免疫球蛋白恒定區(qū)序列的N末端融合，也可以進行N末端融合。通常在此融合中，編碼的嵌合多肽至少保留免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的功能活性鉸 鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。還可以與恒定區(qū)的Fc區(qū)的C末端或者緊鄰重鏈CHl的N-末端處或 輕鏈的相應區(qū)域進行融合。進行所述融合的確切位點并不重要；具體位點是眾所周知的，并且為了使BvS-免 疫球蛋白嵌合體的生物活性最佳，可以對這些位點進行選擇。在一些實施方案中，BvS-免疫球蛋白嵌合體被組裝成單體，或者異型或同型多聚 體，尤其二聚體或四聚體，基本上如WO 91/08298所述。在優(yōu)選實施方案中，BvS序列與抗體C末端區(qū)(尤其Fc區(qū))的N末端融合，所述 C末端區(qū)具有免疫球蛋白，例如免疫球蛋白Gl(IgGl)的效應功能。可以將整個重鏈恒定區(qū) 與BvS序列融合。然而，更優(yōu)選在融合中應用起始于鉸鏈區(qū)中正好在木瓜蛋白酶切割位點 (它從化學上限定IgG Fc ；以重鏈恒定區(qū)的第一個殘基為114時的殘基216，或其它免疫球 蛋白的類似位點)上游的序列。在具體優(yōu)選實施方案中，BvS氨基酸序列與IgGl，IgG2，或 IgG3重鏈的鉸鏈區(qū)和CH2和CH3，或與CH1、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)融合。融合的確切位點并非 關鍵，最佳位點可以通過常規(guī)實驗來確定。 在一些實施方案中，所述免疫粘附素被組裝為多聚體，尤其是同型_ 二聚體或_四 聚體。通常，這些組裝好的免疫球蛋白具有已知的單元結(jié)構?？梢孕纬梢环N基本的四鏈結(jié) 構單元，其中有IgG、IgD和IgE。四-單元在較高分子量免疫球蛋白中重復；IgM —般以通 過二硫鍵維持的基本四-單元的五聚體形式存在。IgA球蛋白，偶爾也包括IgG球蛋白，在血清中也以多聚體的形式存在。在多聚體的情況中，每個四-單元可以相同或不同?；蛘?，可將BvS序列插入免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列之間，以得到含有嵌合重鏈 的免疫球蛋白。在這個實施方案中，將BvS序列與免疫球蛋白每個臂中的重鏈3’末端融合， 可以是在鉸鏈和CH2區(qū)之間或在CH2和CH3區(qū)之間。類似的構建體可參見Hoogenboom等， Mol. Immunol. ,28 1027-1037 (1991)的報道。盡管本發(fā)明的免疫粘附素不需要免疫球蛋白輕鏈的存在，但也可使免疫球蛋白輕 鏈與BvS-免疫球蛋白重鏈融合多肽共價結(jié)合，或直接與BvS融合。在前一種情況中，編 碼免疫球蛋白輕鏈的DNA通常與編碼BvS-免疫球蛋白重鏈融合蛋白的DNA共表達。通 過分泌，雜合重鏈和輕鏈共價結(jié)合，從而提供一種免疫球蛋白_樣結(jié)構，它含有兩個二硫 鍵連接的免疫球蛋白重鏈-輕鏈對。適合制備此類結(jié)構的方法可以參見，例如美國專利 4,816, 567 (1989 年 3 月 28 日授權)。在一優(yōu)選實施方案中，用于構建本發(fā)明免疫粘附素的免疫球蛋白序列來自IgG免 疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。對人免疫粘附素而言，優(yōu)選使用人IgGl和IgG3免疫球蛋白序列。使 用IgGl的主要好處是，IgGl免疫粘附素可以在固相蛋白A上有效純化。IgG3的純化需要 蛋白G，這是一種遠不及蛋白A常用的介質(zhì)。然而，當選擇具體免疫粘附素構建體的Ig融合 配對物時，應該考慮免疫球蛋白的其它結(jié)構和功能特性。例如，IgG3鉸鏈較長且較易彎曲 (flexible)，因此它與可以適應較大的粘附素結(jié)構域，這樣的結(jié)構域在與IgGl融合時可能 不能正確折疊或發(fā)揮功能。另一考慮是化合價；IgG免疫粘附素都是二價同型二聚體，而Ig 亞型象IgA和IgM分別可產(chǎn)生基本Ig同型二具體單元的二聚體或五聚體結(jié)構。對那些為 體內(nèi)應用而設計的BvS免疫粘附素而言，由Fc區(qū)決定的藥代動力學特性和效應功能也是重 要的。盡管IgGl，IgG2和IgG4都具有21天的體內(nèi)半衰期，但它們激活補體系統(tǒng)的潛力是 不同的。IgG4不激活補體，IgG2的補體激活能力顯著弱于IgGl0而且，與IgGl不同，IgG2 不結(jié)合單核細胞或中性粒細胞表面的Fc受體。IgG3對于補體激活而言是最佳的，但其體內(nèi) 半壽期僅為其它IgG同種型的約三分之一。對設計用于人治療的免疫粘附素而言，另一個 重點考慮是具體同種型的同種異型(allotypic)變體的數(shù)量。一般優(yōu)選具有較少的血清學 限定性同種異型的IgG同種型。例如，IgGl僅具有四個血清學限定性同種異型位點，其中 兩個(Glm和2)位于Fc區(qū)中；其中的Glml不具有免疫原性。而IgG3中有12個血清學限 定性同種異型，它們都位于Fc區(qū)中；其中僅3個位點(G3m5，ll和21)具有一種非免疫原性 同種異型。因此，Y 3免疫粘附素的潛在免疫原性大于Yl免疫粘附素的。對親本免疫球蛋白而言，一個有效連接點是緊靠鉸鏈區(qū)胱氨酸上游之處，它形成 兩條重鏈之間的二硫鍵。在常用的設計中，將該分子BvS部分的C-末端殘基的密碼子置于 緊靠IgGl鉸鏈區(qū)序列DKTHTCPPCP的密碼子上游之處。適于構建和表達免疫粘附素的一般方法與上文中涉及BvS的方法相同。BvS免疫 粘附素最方便的構建方法是，將編碼BvS部分的cDNA序列與Ig cDNA序列融合在同一閱 讀框內(nèi)。也可以與基因組Ig片段融合(參見，例如Gascoigne等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 2936-2940(1987) ；Aruffo 等，Cell，61 1303-1313 (1990) ；Stamenkovic 等，Cell， 66:1133-1144(1991))。后一種融合形式需要表達調(diào)節(jié)序列的存在。編碼IgG重鏈恒定區(qū) 的cDNA，可以根據(jù)已公開的序列，從衍生自脾或外周血淋巴細胞的cDNA文庫中，通過雜交 或通過聚合酶鏈反應(PCR)技術分離。將編碼BvS的cDNA以及免疫粘附素的Ig部分串聯(lián)插入能在所選宿主細胞中指導有效表達的質(zhì)粒載體中。為了在哺乳動物細胞中表達，可以 采用基于 PRK5 的載體(Schall 等，Cell, 61 361-370 (1990))和基于 CDM8 的載體(Seed, Nature, 329 840 (1989))?？梢岳霉押塑账岫ㄏ蛉笔дT變，除去所設計的連接密碼子之間 的額外序列，來創(chuàng)建真正的連接(Zoller 等，Nucleic Acids Res. ,10 =6487(1982) ；Capon 等，NatUre，337 :525-531 (1989))?？梢允褂煤铣晒押塑账幔渲忻恳话肱c所需連接的任一 側(cè)的序列互補；理想條件下，它們是36體-48體?；蛘?，可以通過PCR用合適的載體將該分 子的兩部分連接在同一閱讀框中。對表達BvS免疫粘附素的宿主細胞系的選擇主要取決于表達載體。另一個考慮 是需要的蛋白量。毫克量常?？梢酝ㄟ^瞬時轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生。例如，經(jīng)腺病毒EIA-轉(zhuǎn)化的293 人胚腎細胞系可以用基于PRK5的載體通過改良的磷酸鈣方法進行瞬時轉(zhuǎn)染，從而有效表 達免疫粘附素。基于CDM8的載體可以用于通過DEAE-葡聚糖法轉(zhuǎn)染COS細胞(ArufTo等， Cell, 61 1303-1313(1990) ；Zettmeissl 等，DNA Cell Biol. US，9 :347_353 (1990))。當希 望獲得大量蛋白時，可以在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宿主細胞系之后表達免疫粘附素。例如，可以將基于 PRIC5的載體在存在編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)并賦于G418抗性的附加質(zhì)粒的情況下引 入中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在培養(yǎng)中選出G418抗性克?。辉谟兴讲粩嘣黾拥腄HFR抑制 劑氨甲蝶呤存在的情況下培養(yǎng)這些克?。贿x出編碼DHFR的基因拷貝和免疫粘附素序列的 數(shù)量一起被擴增的那些克隆。當免疫粘附素在其N-端包含疏水前導序列時，它傾向于被轉(zhuǎn) 染細胞加工并分泌。具有更復雜結(jié)構的免疫粘附素的表達可能需要唯一匹配的宿主細胞； 例如，象輕鏈或J鏈等組分可以由特定的骨髓瘤或雜交瘤細胞宿主來提供(Gascoigne等， 1987，出處同上，Martin 等，J. Virol.，67 :3561_3568 (1993))。免疫粘附素可以通過親和層析方便地進行純化。蛋白A作為親和配體的合適性取 決于嵌合體中所用的免疫球蛋白Fc區(qū)的類別和同種型。蛋白A可以用于純化那些基于人 Y 1, Y 2，或 Y 4 重鏈的免疫粘附素(Lindmark 等，J. Immunol. Meth.，62 1-13 (1983))。蛋 白G被推薦用于小鼠的所有同種型和人的Y3(Guss等，EMBO J.，5 :1567_1575 (1986))。親 和配體所附著的基質(zhì)最常見瓊脂糖，也可以用其它基質(zhì)。機械穩(wěn)定型基質(zhì)如控制孔徑的玻 璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯與瓊脂糖相比能允許較快的流速和較短的處理時間。使免疫粘 附素與蛋白A或蛋白G親和柱結(jié)合所需的條件完全取決于Fc區(qū)的特性；即，其類別和同種 型。一般而言，當選擇了正確的配體時，在未經(jīng)培養(yǎng)的培養(yǎng)液中可以直接產(chǎn)生有效結(jié)合。免 疫粘附素的區(qū)別特征之一是，對于人Y 1分子而言，與蛋白A結(jié)合的能力相對于具有相同F(xiàn)c 型別的抗體而言在一定程度上減弱。結(jié)合的免疫粘附素可以在酸性PH(3. O或更高)或在 含有離液序列適中的鹽的PH緩沖液中有效洗脫。這種親和層析步驟可以獲得> 95%純的 免疫粘附素制劑?？梢杂帽绢I域已知的其它方法替代，或補充在蛋白A或G上進行的親和層析， 來純化免疫粘附素。免疫粘附素的行為在嗜硫凝膠層析(Hutchens等，Anal. Biochem.， 159 217-226(1986))和固相金屬螯合層析(Al-Mashikhi 等，J. Dairy Sci. ,71 1756-1763(1988))中與抗體類似。但與抗體相反，它們在離子交換柱上的行為不僅取決于 它們的等電點，還取決于它們的嵌合特性所導致的分子中的偶極電荷(charge dipole)。需要時，可以制備雙特異性免疫粘附素。因此，本發(fā)明的免疫粘附素可以將BvS 區(qū)與另一區(qū)，如來自另一種生長因子的區(qū)組合。對于雙特異性分子而言，由一條臂上的嵌合抗體重鏈和另一條臂上的嵌合抗體重鏈_輕鏈對組成的具有它們的抗體_樣結(jié)構的三 聚體分子是有利的，因為它們易于純化。常規(guī)用于生產(chǎn)雙特異性免疫粘附素的抗體_生成 quadroma可以產(chǎn)生十種四聚體的混合物，與它相反，用編碼三聚體免疫粘附素的三條鏈的 核酸轉(zhuǎn)染的細胞僅僅產(chǎn)生三種分子的混合物，從該混合物中純化所需產(chǎn)物要相對較容易。4.制備并鑒定Bv8活件的調(diào)節(jié)物本發(fā)明還涉及篩選化合物以便鑒定那些能模擬或增強BvS的一或多種生物活性 (激動劑)或阻止BvS的效應(拮抗劑)的方法。BvS激動劑和拮抗劑也稱BvS調(diào)節(jié)物。 針對拮抗劑藥物候選物的篩選試驗經(jīng)過設計，可以鑒定出與BvS多肽結(jié)合或與之形成復合 物，或者干擾BvS與其它細胞蛋白相互作用的化合物。a.小分子篩詵小分子可以具有作為BvS激動劑或拮抗劑的能力并因此具有治療價值。這樣的小 分子可以包括天然小分子，合成的有機或無機化合物和肽。但本發(fā)明的小分子不限于這些 形式。市場上已有廣泛多種小分子文庫，本領域也已知廣泛多種篩選具有所需活性的小分 子的試驗。候選的BvS激動劑或拮抗劑小分子優(yōu)選首先在允許快速鑒定BvS活性的潛在調(diào)節(jié) 物的試驗中予以鑒定。這類試驗的一個實例是蛋白-蛋白結(jié)合試驗，其中檢測候選分子與 BvS受體結(jié)合的能力。在另一實例中，檢測候選分子干擾BvS與BvS受體結(jié)合的能力。在優(yōu)選實施方案中，小分子BvS激動劑通過它們模擬BvS的一或多種生物活性的 能力來鑒定。例如，篩選小分子的以下能力誘導內(nèi)皮細胞增殖，促進內(nèi)皮細胞存活，如下文 中實施例2和3所述，或誘導血管生成，如下文中實施例4所述。在另一實施方案中，小分子BvS拮抗劑通過它們抑制BvS的一或多種生物活性的 能力來鑒定。為此，將候選化合物與BvS接觸。然后評估BvS的生物活性。在一個實施方 案中，測量了 BvS刺激內(nèi)皮細胞增殖的能力，如實施例2所述。在另一實施方案中，測量了 BvS促進內(nèi)皮細胞存活的能力，如實施例3所述。一種化合物當能抑制BvS的生物活性時被 鑒定為拮抗劑。鑒定為BvS激動劑或拮抗劑的化合物可以應用在本發(fā)明的方法中。例如，BvS拮 抗劑可以用于治療癌癥。b.制備和鑒定激動劑抗體能模擬BvS生物學特性的激動劑型的人和非_人多克隆和單克隆抗體(包括 非-人單克隆抗體的人源化形式)也包括在本發(fā)明中。這些包括抗體的氨基酸序列變體， 糖基化變體和片段。制備這類抗體并篩選激動劑抗體的一般技術是本領域已知的，簡述如 下。( )多克隆抗體制備多克隆抗體的方法為本領域已知。多克隆抗體可在哺乳動物中產(chǎn)生，例如，通 過一次或多次注射致免疫劑，如果需要，可加入佐劑。通常，對哺乳動物皮下或腹膜內(nèi)多次 注射致免疫劑和/或佐劑。將致免疫劑與針對所免疫的哺乳動物具有免疫原性的蛋白(如 血清白蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑)進行偶聯(lián)是有效的?？梢允褂玫淖魟┑膶嵗ǜナ?完全佐劑和MPL-TDM佐劑。(ii)單克隆抗體
單克隆抗體可以使用由Kohler和Milstein，Nature，256 495(1975)首次描述的 雜交瘤方法來制備，或者可以通過重組DNA方法來制備(美國專利4，816，567)。在雜交瘤方法中，對小鼠或其它適宜宿主動物如倉鼠或獼猴(macaque monkey)按 照進行上文所述免疫，以刺激那些產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與免疫所用蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋 巴細胞?；蛘撸馨图毎梢栽隗w外致敏。然后，將淋巴細胞與骨髓瘤細胞用合適的融合劑， 如聚乙二醇融合，以便形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal Antibodies principles and Practice,pp.59-103, (Academic Press,1986))。如此制備的雜交瘤細胞可以接種在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一或 多種抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌 呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)時，雜交瘤的培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤、氨基蝶 呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細胞的生長。優(yōu)選骨髓瘤細胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生 抗體，并對諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓 瘤系，如由 Salk Institute Cell Distreibution Center, San Diego, California USA提供 的M0PC-21和Μ. C. -11小鼠腫瘤，和由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockvilie，Maryland USA 提供的SP-2或X63-Ag8-653細胞。也有報道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細胞系 可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol.，133 3001(1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63Marcel Dekker,Inc. ,New York,1987))?？稍诤猩L的雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中分析抗所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。優(yōu) 選地，雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合試驗， 如放射免疫分析(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來分析。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過，例如Muson等，Anal. Biochem.，107 220 (1980) 所述Scatchard分析來測定。鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后， 將這些細胞通過有限稀釋法進一步克隆并用標準方法進行培養(yǎng)(Goding，Monoclonal Antibodies Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。適于此目的 的培養(yǎng)基包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可以進行體內(nèi)生長，為 動物中的腹水腫瘤形式。由這些亞克隆分泌的單克隆抗體可以適當?shù)赜贸Ｒ?guī)免疫球蛋白純化方法從培養(yǎng) 基、腹水或血清中分離，所述方法例如蛋白-A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析 或親和層析。編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易的分離和測序(如利用能與編碼該單 克隆抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是這類DNA的優(yōu)選來 源。DNA分離后，可將其插入表達載體中，然后用此表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，如大腸桿菌細 胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產(chǎn)生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，以便在重組 宿主細胞中合成單克隆抗體。DNA也可以通過，例如，用編碼人類重鏈和輕鏈恒定區(qū)的序列 取代小鼠同源序列來修飾，Morrison 等，Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 81 :6851 (1984))，或 通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價結(jié)合來修飾。
37在這種方式中，可以制備出具有本文所述BvS激動劑單克隆抗體的結(jié)合特異性的“嵌合”或 “雜合”抗體。嵌合或雜合抗體也可以用合成蛋白質(zhì)化學中的已知方法在體外制備，包括那些涉 及交聯(lián)劑的方法。例如，可以用二硫鍵交換反應或通過形成硫醚鍵來構建免疫毒素。適 于此目的的合適試劑包括亞氨基硫醇酯(iminothiolate)和甲基_4_巰基丁基亞胺酸酯 (mercaptobutyrimidate) 0抗體的重組制備將在下文中詳述。(iii)人源化抗體—般情況下，人源化抗體中已導入一或多個源自非人來源的氨基酸殘基。這些非 人氨基酸殘基常稱為“引進的”殘基，它們通常來自“引進的”可變區(qū)。人源化過程基本是 按照 Winter 及其同事(Jones 等，Nature，321 :522_525 (1986) ；Riechmann 等，Nature，332 323-327(1988) ；Verhoeyen 等，Science，239 :1534_1536 (1988))所述，用嚙齒類 CDR 或 CDR 序列取代人類抗體的相應序列來進行。因此，這樣的“人源化”抗體是嵌合抗體(Cabilly，出處同上)，其中完整人類可變 區(qū)的很少一部分被非人物種的相應序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中 CDR殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代。重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為 達到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列 和各種概念性人源化產(chǎn)物來制備人源化抗體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領域技 術人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構象結(jié)構的計算機 程序。通過觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作 用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。通過這種方法，可從共有序 列和引進序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對靶抗原的親和力增加。 總之，CDR殘基直接并且最主要涉及對抗原結(jié)合的影響。詳見1992年8月21日提交的美 國專利申請07/934，373，它是1991年6月14日提交的美國申請07/715，272的部分繼續(xù)申 請。(iv)人的抗體人單克隆抗體可以通過雜交瘤方法制備。人骨髓瘤和小鼠-人異質(zhì)性骨髓瘤細胞 系用于產(chǎn)生人單克隆抗體的相關報道可參見，例如，Kozbor，J. Immunol. , 133 =3001(1984)； Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 51-63 Marcel Dekker, Inc., New York,1987))。現(xiàn)在可以制備轉(zhuǎn)基因動物(如小鼠)，它經(jīng)過免疫能在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白生 成的情況下產(chǎn)生全套人抗體。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突變小鼠中，抗體 重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合缺失導致內(nèi)源性抗體生成的完全抑制。將人胚系免疫球蛋 白基因陣列轉(zhuǎn)移到此胚系突變小鼠中，將導致在抗原攻擊的情況下產(chǎn)生人抗體。例如，見 Jakobovits 等，Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature, 362 255-258(1993)。Mondez 等(Nature Genetics 15 146-156 (1997))進一步改進了該技術并產(chǎn)生出 命名為“Xenomouse II”的轉(zhuǎn)基因小鼠品系，當其受到抗原攻擊時，可產(chǎn)生高親和性完全人抗體。這是通過將兆堿基人重鏈和輕鏈基因座經(jīng)胚系整合到上述具有內(nèi)源JH節(jié)段缺失的 小鼠中實現(xiàn)的。Xenomouse II具有含約66VH基因，完全D1^P Jh區(qū)以及三種不同恒定區(qū)(μ， δ和χ )的1020Kb人重鏈基因座，并具有包含32VK基因，Jk節(jié)段和Ck基因的800Kb人κ 基因座。這些小鼠中產(chǎn)生的抗體與人類中所見的抗體在各方面均十分相似，包括基因重排、 組裝和所有組成成分。由于內(nèi)源Jh節(jié)段中的缺失阻止鼠基因座中的基因重排，人抗體優(yōu)先 于內(nèi)源抗體表達?；蛘?，可用噬菌體展示技術(McCafferty等，自然348 =552-553(1990))從未免疫 供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因的所有組成而體外產(chǎn)生人類抗體和抗體片段。依據(jù)此技 術，將抗體V區(qū)基因與絲狀噬菌體(如Μ13或fd)主要或次要衣殼蛋白基因克隆在相同的 閱讀框內(nèi)，并在噬菌體顆粒的表面展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因 組的單鏈DNA拷貝，根據(jù)抗體的功能特點進行的選擇也導致對顯示這些性質(zhì)的抗體的編碼 基因進行選擇。因此，噬菌體模仿了B細胞的部分特點。噬菌體展示可以以多種形式進行； 這些綜述見 Johnson, Kevin S.禾口 Chiswell, David J. , Current Opinion in Structural Biology 3 :564-571(1993)?？墒褂肰基因節(jié)段的多個來源進行噬菌體展示。Clackson等， Nature, 352 =624-628(1991)從免疫小鼠脾臟來源的V基因隨機組合小文庫中分離出一批 多樣的抗-噁唑酮抗體?？苫救鏜arks等，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1991)，或Griffith 等，EMBO J. 12 725-734(1993)所述，構建未免疫的人類供體的V基因庫，并分離針對多種 多樣抗原(包括自身抗原)的抗體。在天然免疫應答中，抗體基因以較高速率積累突變(體 細胞超變)。其中一些變化賦于較高親和力，而展示高親和力表面免疫球蛋白的B細胞在隨 后的抗原攻擊階段優(yōu)先復制并分化。這種天然過程可以用已知為“鏈改組”的技術(Marks 等，Bio/Technol. 10，779-783 [1992])來模仿。在該方法中，通過噬菌體展示而獲得的“原 代”人抗體的親和力可以得到改進，方法是用未免疫供體的V區(qū)基因的天然變體所有組成相 繼取代重鏈和輕鏈V區(qū)基因。該技術允許產(chǎn)生具有nM水平的親和力的抗體和抗體片段。制 備非常大的噬菌體抗體庫(也稱“所有庫的母庫”(the mother-of-all library))的策略 在Waterhouse等，Nucl. Acids Res. 21，2265-2266 (1993)中描述，直接從這樣的噬菌體大 文庫中分離出高親和力人抗體的技術可參見Griffith等，EMBO J. (1994)，待出版?；蚋?組也可以用于從嚙齒動物的抗體衍生出人抗體，其中的人抗體具有與起始的嚙齒動物抗體 相似的親和性和特異性。根據(jù)該方法(也稱“表位印痕(印itope imprinting)”)，通過噬 菌體展示技術獲得的嚙齒動物抗體重鏈或輕鏈V區(qū)基因被人V區(qū)基因所有組成取代，產(chǎn)生 嚙齒動物_人嵌合體。對抗原的選擇導致分離出能重建原功能性抗原結(jié)合位點的人類可變 區(qū)，即表位控制(govern)(決定(imprint))對配對物的選擇。當重復該方法以取代余下的 嚙齒動物V區(qū)時，獲得人抗體(見PCT專利申請WO 93/06213，公開于1993年4月1日)。 與嚙齒動物的抗體通過CDR移植進行的傳統(tǒng)人源化不同，該技術提供徹底的人抗體，其不 具有嚙齒動物來源的框架或CDR殘基。(ν)雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同表位的結(jié)合特異性的單克隆抗體(優(yōu)選 人抗體或人源化抗體)。制備雙特異性抗體的方法是本領域已知的。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體 的重組制備是基于兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中這兩條鏈具有不同特異性 (Millstein and Cuello，Nature，305 :537_539 (1983))。由于免疫球蛋白重鏈輕鏈隨機分配，這些雜交瘤(quadroma)產(chǎn)生10種不同抗體分子的混合物，其中只有一種具有正確的雙 特異性結(jié)構。對所述正確分子的純化(通常通過親和層析步驟來進行)非常復雜，且產(chǎn)量 很低。類似的方法見W093/08829(1993年5月13日公開)和Traunecker等，EMBO J, 10 3655-3659(1991)。依據(jù)另一種并且是更優(yōu)選的方法，可將具有所需結(jié)合特異性(抗體_抗原結(jié)合位 點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合優(yōu)選與包含鉸鏈區(qū)、CH2及CH3區(qū) 的至少一部分的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)融合。優(yōu)選使含有輕鏈結(jié)合所需位點的第一重鏈恒 定區(qū)(CHl)出現(xiàn)在至少在一種融合中?？蓪⒕幋a免疫球蛋白重鏈融合體，以及必要時，編碼 免疫球蛋白輕鏈的DNA插入不同表達載體，共轉(zhuǎn)染至適當宿主生物。這使得在使用非等比 的三種多肽鏈進行構建的實施方案中，能夠較靈活地調(diào)整三種多肽片段的相互比例，以獲 得最佳產(chǎn)量。但也可在至少兩種多肽鏈以等比例表達而獲得高產(chǎn)時或所述比例無特別意義 時，將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一表達載體。在該方法的一個優(yōu)選實施方 案中，所述雙特異性抗體由一條臂上的具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈和另一 條臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構成。已發(fā)現(xiàn)這種不對稱 結(jié)構有利于從非必要免疫球蛋白鏈的混合中分離出所需雙特異性化合物，因為只有該雙特 異性分子的一半存在免疫球蛋白輕鏈，這使得分離更加容易。此方法公開于1994年3月3 日公開的W094/04690中。制備雙特異性抗體的進一步細節(jié)可以參見，例如Suresh等，Methods in Enzymology, 121 210(1986)。(vi)異源偶聯(lián)抗體異源偶聯(lián)抗體由兩個共價連接的抗體組成。此種抗體據(jù)稱例如可以使免疫系統(tǒng) 細胞靶向不需要的細胞(美國專利4，676，80)和用于治療HIV感染(W0 91/00360和WO 92/200373 ；EP 03089)。異源偶聯(lián)抗體可以用任何方便的交聯(lián)方法來制備。適宜的交聯(lián)劑 為本領域已知，并在美國專利4，676，980中與一些交聯(lián)技術一起公開。(Vii)抗體片段在一些實施方案中，BvS拮抗劑抗體(包括鼠，人和人源化抗體，以及抗體變體) 是抗體片段。已開發(fā)了多種技術用于生產(chǎn)抗體片段。傳統(tǒng)上，這些片段通過對完整抗體 進行蛋白水解消化來衍生(見例如，Morimoto等，J. Biochem. Biojphys. Methods 24: 107-117(1992)和Brennan等，Science 229:81(1985))。然而，這些片段現(xiàn)在可通過重組 宿主細胞直接產(chǎn)生。例如，F(xiàn)ab' -SH片段可從大腸桿菌直接回收并利用化學方法偶聯(lián)形成 F(ab，)2 片段(Carter 等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。在另一實施方案中，利用 亮氨酸拉鏈GCN4形成F(ab，)2以便促進F(ab，)2分子的組裝。根據(jù)另一方法，F(xiàn)v, Fab或 F(ab' )2片段可以直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物中分離。制備抗體片段的其它技術對于熟練 技術人員而言是顯而易見的。(Viii)鑒定激動劑抗體BvS激動劑抗體根據(jù)它們的生物活性來鑒定。在一個實施方案中，BvS激動劑抗體 通過它們誘導內(nèi)皮細胞增殖的能力來鑒定，如實施例2所述。在另一實施方案中，BvS激動 劑抗體通過它們誘導血管生成的能力來鑒定，如實施例4所述。5.篩選與Bv8相互作用的蛋白的試驗
適于檢測蛋白-蛋白相互作用的任何方法都可以用于鑒定與BvS相互作用的蛋白 或其它分子，包括但不限于跨膜蛋白或細胞內(nèi)蛋白。在眾多可以應用的傳統(tǒng)方法中，有免疫 沉淀，利用梯度或?qū)游鲋M行交聯(lián)和共_純化，來鑒定與BvS相互作用的蛋白。在這樣的試 驗中，BvS組分可以是全長蛋白，其可溶性衍生物，對應于目的結(jié)構域的肽，或含有BvS某一 區(qū)域的融合蛋白?？梢圆捎媚芡瑫r鑒定編碼與BvS相互作用的蛋白的基因的方法。這些方法包括， 例如，用標記的BvS或其變體，按照類似于已知對Sgtll文庫的抗體探測技術的方式來探測 表達庫。一種體內(nèi)檢測蛋白質(zhì)相互作用的方法，雙雜合體系(two-hybrid system)在這里 詳細描述作為舉例，而非限制。該體系的一種版本已有文獻描述(Chien等，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :9578_9582)，并且可以從 Clontech (Palo Alto, CA)購買。簡言之，可以利用這樣的體系構建編碼兩種雜合蛋白的質(zhì)粒其中一種質(zhì)粒由編 碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA-結(jié)合區(qū)的核苷酸與編碼Bv8、或其多肽、肽、或融合蛋白的核苷酸序 列融合而組成，另一種質(zhì)粒作為cDNA文庫的一部分、由編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的激活區(qū)的核苷 酸與編碼已重組在該質(zhì)粒中的未知蛋白的cDNA融合而組成。將DNA-結(jié)合區(qū)融合質(zhì)粒和 cDNA文庫轉(zhuǎn)化到含有報告基因的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，所述報告基 因(如HBS或IacZ)的調(diào)節(jié)區(qū)包含所述轉(zhuǎn)錄激活劑的結(jié)合位點。任何一種雜合蛋白單獨都 不能激活該報告基因的轉(zhuǎn)錄所述DNA-結(jié)合區(qū)雜合體不能激活是因為它不能提供激活功 能，所述激活區(qū)雜合體不能激活是因為它不能定位到激活劑結(jié)合位點。這兩種雜合蛋白的 相互作用可以重新組建功能性激活蛋白，并導致報告基因的表達，該表達可以通過測定該 報告基因產(chǎn)物的試驗來檢測。所述雙雜合體系或相關方法學可以用于篩選與“誘餌(bait) ”基因產(chǎn)物相互作用 的蛋白的激活區(qū)文庫。例如，但并非限制地，可以用BvS作為誘餌基因產(chǎn)物。將總基因組或 cDNA序列與編碼激活區(qū)的DNA融合。用該文庫和編碼誘餌BvS基因產(chǎn)物與DNA結(jié)合區(qū)融合 的雜合體的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母報告菌株中，并篩選出表達該報告基因的轉(zhuǎn)化體。例如，但并 非限制地，可以將誘餌BvS基因序列，例如所述基因的開放讀框，克隆到載體中，使其與編 碼GAL4蛋白的DNA-結(jié)合區(qū)的DNA融合在一起被翻譯。純化這些菌落，并分離出負責報告 基因表達的文庫質(zhì)粒。然后用DNA測序來鑒定所述文庫質(zhì)粒編碼的蛋白。當從一種細胞系中檢測出與誘餌BvS基因產(chǎn)物相互作用的蛋白時，可以用本領域 常規(guī)實踐的方法制備該細胞系的cDNA文庫。根據(jù)本文所述的具體體系，例如，可以將cDNA 片段插入載體中，使它們與GAL4的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合在一起被翻譯。該文庫可以與誘餌BvS 基因-GAL4融合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到含有IacZ基因的酵母菌株中，所述IacZ基因受到含有GAL4 激活序列的啟動子驅(qū)動。由cDNA編碼、與GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合、并與誘餌BvS基因產(chǎn)物相 互作用的蛋白可以重新組建活性GAL4蛋白并因此驅(qū)動表達。可以用本領域常規(guī)方法檢測 出驅(qū)動表達的菌落。然后從這些菌株純化出cDNA，將其用于通過本領域常規(guī)實踐的技術來 制備并分離誘餌BvS基因-相互作用蛋白。a.分析能調(diào)節(jié)Bv8表達或活性的化合物設計以下試驗來鑒定與BvS相互作用(即發(fā)生結(jié)合)的化合物，干擾BvS與其結(jié) 合配對物、關連物(cognate)或受體的相互作用的化合物，以及調(diào)節(jié)BvS基因表達活性(即調(diào)節(jié)BvS基因表達水平)或調(diào)節(jié)機體中BvS水平的化合物。還可以利用能鑒定出與BvS基 因調(diào)節(jié)序列(如啟動子序列)結(jié)合、并因此可調(diào)節(jié)BvS基因表達的化合物的試驗。參見，例 如 Platt，K. Α.，1994，J.Biol. Chem. 269 :28558_28562?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明進行篩選的化合物包括，但不限于，肽，抗體及其片段，以及其它 有機化合物(例如肽模擬物)，它們可以與BvS或BvS受體結(jié)合并模擬由天然配體激發(fā)的活 性(即激動劑)或抑制由天然配激發(fā)的活性(即拮抗劑)。這類化合物包括但不限于肽，如可溶性肽，包括但不限于隨機肽文庫的成員；(參 見，例如，Lam, K. S.等，1991，Nature 354 :82_84 ；Houghten, R.等，1991，Nature 354 84-86)，以及由D-和/或L-構型的氨基酸組成的組合型化學衍生分子庫的成員，磷肽 (phosphop印tides)(包括但不限于隨機或部分變性的直接磷肽庫的成員(members of random or partially degenerate, directed phosphopeptide libraries)；參見，例如， Songyang，Ζ.等，1993，Cell72 :767_778)，抗體(包括但不限于多克隆抗體，人源化抗體， 抗_獨特型抗體，嵌合抗體或單鏈抗體，以及FAb，F(xiàn) (abN) 2和FAb表達庫片段，及其表位-結(jié) 合片段)，還有有機或無機分小子?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明進行篩選的其它化合物包括，但不限于，能進入相應細胞(如內(nèi) 皮細胞)并影響B(tài)vS基因表達或影響與BvS介導的途徑(例如，通過與涉及基因表達的調(diào) 節(jié)區(qū)或轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用)有關的一些基因表達的有機小分子；或者，影響或替代BvS 活性或影響或替代與BvS信號傳遞、分解代謝，或代謝途徑有關的一些其它細胞內(nèi)因子的 活性的化合物。計算機建模和搜索技術允許鑒定能調(diào)節(jié)BvS表達或活性的化合物或已知化合物 的改進。在鑒定出這樣的化合物或組合物后，可以鑒定出活性位點或區(qū)域。這樣的活性位點 通常是配體結(jié)合位點?；钚晕稽c可以用本領域已知方法來鑒定，例如從肽的氨基酸序列，從 核酸的核苷酸序列，或從相關化合物或組合物與其天然配體形成的復合物的研究來鑒定。 在后一種情況中，可以用化學方法或X-線晶體成像方法，通過找出該因子(factor)上發(fā)現(xiàn) 復合配體之處來找出活性位點。接著，測定活性位點的二維幾何結(jié)構。這可以通過已知方法(包括測定完整分子 結(jié)構的X-線晶體成像)來完成。另一方面，可以用固相或液相NMR來確定一些分子內(nèi)間距。 任何其它測定結(jié)構的實驗方法都可以用于獲得部分或完整的幾何結(jié)構。幾何結(jié)構可以用天 然或人工的復合配體來測量，它可以提高所測定的活性位點結(jié)構的精確度。如果測定出不完整或不夠精確的結(jié)構，可以用基于計算機的數(shù)字化建模方法來完 成該結(jié)構或提高其精確度。任何可以識別的建模方法都可以使用，包括特異于具體生物大 分子(如蛋白或核酸)的參數(shù)化模型，基于計算機化分子運動的分子動力學模型，基于熱系 綜(thermal ensemble)的統(tǒng)計學機械模型，或組合模型。對大多數(shù)類型的模型而言，標準 分子力場(代表原子和基團之間的力)是必需的，且可以選自物理化學中已知的力場。上 述不完整或不夠精確的實驗結(jié)構可以作為用這些建模方法通過計算機獲得更精確的完整 結(jié)構時的一種限制。最后，通過實驗，通過建模，或者通過組合而測定了活性位點(或結(jié)合位點)的結(jié) 構以后，可以通過搜索含有化合物以及它們分子結(jié)構的信息的數(shù)據(jù)庫來鑒定候選的調(diào)節(jié)性 化合物。這樣的搜索可找出具有與測定的活性位點結(jié)構相匹配的結(jié)構并與限定該活性位點的基團相互作用的化合物。這樣的搜索可以是手動的，但優(yōu)選有計算機輔助。根據(jù)該搜索 找出的這些化合物都是BvS活性的潛在調(diào)節(jié)物。另一方面，可以用這些方法從已知的調(diào)節(jié)化合物或配體鑒定改進的調(diào)節(jié)化合物。 可以對已知化合物的組合物進行修飾，修飾的結(jié)構效應可以用上述應用于新組合物的實驗 方法和計算機建模方法來確定。然后將改變的結(jié)構與該化合物的活性位點結(jié)構相比較，從 而確定是否匹配得更好或相互作用更好。通過這種方式，可以對組合物中的系統(tǒng)變化，諸如 改變側(cè)鏈基團所導致的變化進行快速評估，以便獲得改進了特異性或活性的修飾型調(diào)節(jié)化 合物或配體。其它可以根據(jù)對BvS活性位點(或結(jié)合位點)，以及相關轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄因子的鑒定， 來鑒定調(diào)節(jié)化合物的實驗方法和計算機建模方法，都是本領域已知的。分子建模系統(tǒng)實例如CHARMm 和 QUANTA 程序(Polygen Corporation, ffaltham, MA)。CHARMm執(zhí)行能量最小化和分子動力學功能。QUANTA執(zhí)行分子結(jié)構的構建，建立模型 圖和分析。QUANTA允許交互構建、修飾、觀察、以及分析分子相互之間的行為。關于與具體蛋白相互作用的藥物的計算機建模綜述可以參見多篇文獻，如 Rotivinen，等，1988，Acta Pharmaceutical Fennica 97 159-166 ；Ripka，New Scientist 54-57 (June 16，1988) ；McKinalyand Rossmann，1989，Annu.Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29 111-122 ；Perry and DaviesiOSAR !Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989) ；Lewis and Dean，1989 Proc. R. Soc. Lond. 236 :125-140 and 141-162 ；關于核酸組分的模型受體，參見 Askew 等，1989，J. Am. Chem. Soc. Ill :1082_1090。其它用圖像和畫面描述化學物品的計算機程序可以從諸如 BioDesign, Inc. (Pasadena, CA.), Allelix, Inc. (Mississauga, Ontario, Canada), I^l Jk. Hypercube,Inc. (Cambridge,Ontario)公司獲得。盡管這些程序主要是為具體蛋白的特異 性藥物應用所設計的，它們也適于設計DNA或RNA區(qū)域特異性藥物，只要該區(qū)域是確定的。上文針對能夠改變結(jié)合的化合物的設計和制備進行了描述，但也可以在已知化合 物(包括天然產(chǎn)物或合成的化學物質(zhì))，以及生物活性物質(zhì)(包括蛋白)的文庫中篩選可以 作為抑制劑或激活劑的化合物。通過本文上述試驗鑒定出的化合物可以用于，例如，闡述BvS基因產(chǎn)物的生物功 能?？梢詫⑦@樣的化合物以治療有效劑量給予患者，以便治療任一種生理學疾病。治療有 效劑量是指化合物足以導致任何生物學癥狀的改善，阻礙(impediment)，預防或改變的量。b.分析與Bv8結(jié)合的化合物可以設計一些系統(tǒng)，用于鑒定能與BvS相互作用(如結(jié)合)或能模擬Bv8，或能干 擾BvS與關連受體、結(jié)合配對物或底物的相互作用的化合物。所鑒定的化合物可以用于，例 如，調(diào)節(jié)野生型和/或突變的BvS基因產(chǎn)物的活性；闡述BvS的生物功能；在篩選中鑒定那 些能破壞BvS的正常相互作用的化合物；或它們自身可以破壞或激活這類相互作用。用于鑒定與BvS結(jié)合，或與BvS關連受體或底物結(jié)合的化合物的試驗，在原則上涉 及制備BvS與待測化合物的反應混合物，該過程所用的時間和條件足以允許這兩種組分相 互作用并結(jié)合而形成復合物，該復合物可以從反應混合物中取出和/或檢測出。所用的BvS 的類型可以根據(jù)篩選試驗的目的不同而不同。例如，希望篩選出天然受體的激動劑時，可以 利用全長Bv8，或可溶性截短型Bv8，肽，或包含一或多個BvS結(jié)構域與在試驗系統(tǒng)中提供便
43利(如，標記，分離所得復合物，等等)的蛋白或多肽的融合蛋白。當希望篩選出與BvS直 接相互作用的化合物時，可以使用對應于BvS的多肽以及含有BvS的融合蛋白。篩選試驗可以通過多種方式來進行。例如，一種方法涉及將Bv8，其多肽，肽，或融 合蛋白錨著在固相上，并在反應結(jié)束時檢測錨著在固相上的BvS/待測化合物復合物。在這 類方法的一個實施方案中，BvS反應試劑可以錨著在固體表面，未錨著的待測化合物可以被 直接或間接標記。在實踐中，可以方便地用微滴板作為固相。將錨著組分通過非共價或共價結(jié)合作 用而固定。非共價結(jié)合可以通過將固體表面簡單地包被蛋白溶液并干燥而實現(xiàn)?；蛘?，可 以用特異于待固定蛋白的固相抗體(優(yōu)選單克隆抗體)將該蛋白錨著到固體表面。所述表 面可以事先制備并貯藏。為了進行試驗，將未固定的組分添加到含有錨著組分的包被表面。反應完成后，在 能使所形成的任何復合物仍然固定在固體表面的條件下除去(例如，通過洗滌)未反應的 組分。對錨著在固體表面的復合物的檢測可以通過多種方式實現(xiàn)。當上述未固定組分事先 已有標記時，檢測出固定在所述表面的標記就表明形成了復合物。當上述未固定組分事先 未被標記時，可以用間接標記物檢測錨著在所述表面的復合物；例如，用帶有標記的特異于 上述未固定組分的抗體(該抗體本身可以直接標記或用標記的抗-Ig抗體間接標記)?；蛘?，可以在液相中進行反應，使反應產(chǎn)物與未反應的組分分離，并檢測復合物； 例如用特異于BvS蛋白，多肽，肽，或融合蛋白或待測化合物的固相抗體來錨著溶液中形成 的任何復合物，以及用對抗可能的復合物中另一組分的特異性標記抗體來檢測錨著的復合 物。c.分析那些能干擾Bv8的相互作用的化合物與BvS相互作用的大分子在本節(jié)中稱為“結(jié)合配對物”。這些結(jié)合配對物都很傾向 于參與BvS介導的生物途徑。因此，希望鑒定干擾或破壞所述結(jié)合配對物的相互作用的化 合物，它們可用于調(diào)節(jié)或增強機體中的BvS活性和/或控制與該活性相關的疾病(或該活 性的缺陷)。用于鑒定能干擾BvS與結(jié)合配對物或配對物相互作用的化合物的試驗系統(tǒng)，其基 本原則涉及制備含有BvS或其一些變體以及結(jié)合配對物的反應混合物，該過程所用的時間 和條件足以允許這兩種組分相互作用并結(jié)合而形成復合物。為了檢驗化合物的抑制活性， 所述反應混合物在有和沒有該待測化合物的條件下制備。待測化合物可以是最初就包括在 反應混合物中，或者可以是在添加了 BvS和它的結(jié)合配對物之后間隔一段時間而加入混合 物中。對照反應混合物在不含待測化合物或含有安慰劑的條件下保溫。然后檢測BvS與結(jié) 合配對物是否形成任何復合物。在對照反應中形成復合物，但在含有待測化合物的反應混 合物中不形成復合物，則表明所述化合物干擾BvS與結(jié)合配對物的相互作用。另外，也可以 將在含有待測化合物和正常BvS蛋白的反應混合物中復合物的形成與在含有待測化合物 和BvS突變蛋白的反應混合物中復合物的形成進行比較。當在這些情況中希望鑒定出那些 特異性破壞突變體或突變的BvS而不是正常蛋白的相互作用的化合物時，這種比較是很重 要的。干擾BvS與結(jié)合配對物相互作用的化合物的分析可以采用異質(zhì)(heterogeneous) 形式或同質(zhì)(homogeneous)形式。異質(zhì)試驗涉及將BvS或者結(jié)合配對物錨著在固相上，并在反應結(jié)束時檢測錨著在固相上的復合物。在同質(zhì)試驗中，整個反應在液相中進行。在每 一種方法中，可以改變反應試劑的添加順序，以便獲得關于待測化合物的不同信息。例如， 通過競爭來干擾相互作用的待測化合物，可以通過在有該待測物質(zhì)存在的情況下進行反應 來鑒定；即，將待測物質(zhì)先加入反應混合物中，然后再加入BvS和相互作用結(jié)合配對物；或 者將它們同時加入。另外，對已形成的復合物造成破壞的待測化合物，例如具有較高結(jié)合常 數(shù)因而能替換掉復合物上的一種組分的化合物，可以通過在形成復合物之后將該待測化合 物加入反應混合物中而進行檢驗。各種形式簡述如下。在異質(zhì)試驗系統(tǒng)中，將BvS或者相互作用結(jié)合配對物錨著在固體表面，未錨著的 物質(zhì)被直接或間接標記。在實踐中，常常利用微滴板。錨著物質(zhì)可以通過非共價或共價結(jié) 合作用而固定。非共價結(jié)合可以簡單地通過將固體表面包被BvS或結(jié)合配對物溶液并干燥 而實現(xiàn)?；蛘?，可以用特異于待錨著物質(zhì)的固相抗體將所述物質(zhì)錨著到固體表面。所述表 面可以事先制備并貯藏。為了進行該試驗，在有或無待測化合物的條件下將所固定物質(zhì)的配對物暴露于包 被表面。反應完成后，除去(例如，通過洗滌)未反應的組分，所形成的任何復合物仍然固 定在固體表面。對錨著在固體表面的復合物的檢測可以通過多種方式實現(xiàn)。當未被固定的 物質(zhì)事先已有標記時，檢測出固定在所述表面的標記就表明形成了復合物。當未被固定的 物質(zhì)事先未被標記時，可以用間接標記物檢測錨著在所述表面的復合物；例如，用帶有標記 的特異于最初未被固定的物質(zhì)的抗體(該抗體本身可以直接標記或用標記的抗-Ig抗體間 接標記)。根據(jù)反應組分的添加順序，可以檢測出抑制復合物形成或者破壞已形成的復合物 的待測化合物?；蛘撸梢栽诖郎y化合物存在或缺乏的條件下在液相中進行反應，使反應產(chǎn)物與 未反應的組分分離，并檢測復合物；例如用特異于其中一種結(jié)合組分的固相抗體來錨著溶 液中形成的任何復合物，以及用特異于另一種配對物的標記抗體來檢測錨著的復合物。同 樣，根據(jù)液相中反應組分的添加順序，可以鑒定出抑制復合物形成或者破壞已形成的復合 物的待測化合物。在本發(fā)明的另一實施方案中，可以采用同質(zhì)試驗。在該方法中，制備預形成的BvS 與結(jié)合配對物的復合物，使其中的BvS或其結(jié)合配對物被標記，但該標記所產(chǎn)生的信號由 于形成復合物而消失(參見，例如Rubenstein的美國專利4，109，496，它利用此方法進行免 疫分析)。加入能競爭并替換掉預形成復合物上的一種物質(zhì)的待測物質(zhì)，將產(chǎn)生高于背景的 信號。這樣就可以鑒定出破壞所述相互作用的待測物質(zhì)。 在一個具體實施方案中，可以制備BvS融合體用于進行固定。例如，可以用融合載 體(如PGEX-5X-1)將BvS或其肽片段與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因融合，所用的融合 方式使得在最終的融合蛋白中保留了 BvS的結(jié)合活性?？梢詫⒔Y(jié)合配對物純化，并用于產(chǎn) 生單克隆抗體，其利用實踐中常規(guī)的以及本發(fā)明上文中描述的方法。該抗體可以通過本領 域常規(guī)實踐的方法用放射性同位素125I進行標記。在異質(zhì)試驗中，可以將融合蛋白錨著在 谷胱甘肽_瓊脂糖珠上。然后在有或沒有待測化合物的情況下，按照允許發(fā)生相互作用并 結(jié)合的方式，添加相互作用結(jié)合配對物。在反應結(jié)束時，將未結(jié)合的物質(zhì)洗去，向該系統(tǒng)中 添加標記的單克隆抗體，使之與復合的組分結(jié)合。BvS與相互作用結(jié)合配對物之間的相互作 用，可以通過測量仍然保持與谷胱甘肽-瓊脂糖珠結(jié)合的放射活性的量來檢測。待測化合物對相互作用的成功抑制可以導致所測量的放射活性降低?；蛘?，在缺乏固體的谷胱甘肽_瓊脂糖珠的情況下，可以將GST融合蛋白與相互作 用結(jié)合配對物混合在液體中。待測化合物可以在上述物質(zhì)發(fā)生相互作用期間或之后加入。 然后將該混合物添加到谷胱甘肽_瓊脂糖珠上，洗去未結(jié)合的物質(zhì)。BvS與結(jié)合配對物之 間相互作用受到抑制的程度，可以通過添加標記抗體并測量與珠結(jié)合的放射活性來進行檢 測。在本發(fā)明另一實施方案中，可以用對應于BvS和/或相互作用配對物或結(jié)合配對 物(在結(jié)合配對物是蛋白的情況中)的結(jié)合區(qū)的肽片段，代替兩種全長蛋白之一或兩者，實 施上述相同的技術?？梢杂帽绢I域常規(guī)實踐的任意多種方法來鑒定并分離結(jié)合位點。這些 方法包括，但不限于，對編碼其中一種蛋白的基因進行誘變并在共-免疫沉淀試驗中篩選 對結(jié)合的破壞。然后可以選出編碼復合物中第二種物質(zhì)的基因中的補償突變。對編碼每種 蛋白的基因進行序列分析，可以揭示對應于蛋白上參與相互結(jié)合的區(qū)域的突變?；蛘?，可以 用上述方法將一種蛋白錨著在固體表面，使之與其帶有標記的結(jié)合配對物發(fā)生相互作用并 結(jié)合，所述配對物已經(jīng)經(jīng)過蛋白水解酶(如胰蛋白酶)處理。洗滌后，相對較短的、含有結(jié) 合區(qū)的標記肽可以保持與固體物質(zhì)結(jié)合，可以將其分離并通過氨基酸測序而鑒定。一旦獲 得了編碼細胞內(nèi)結(jié)合配對物的基因，可以對短基因節(jié)段進行工程化，以便表達所述蛋白的 肽片段，然后檢驗其結(jié)合活性，并進行純化或合成?？梢匀缟纤鰧vS錨著在固體物質(zhì)上，方法是例如，但并非限制地，制備GST融 合蛋白并使之與谷胱甘肽_瓊脂糖珠結(jié)合。相互作用結(jié)合配對物可以被放射性同位素如35S 標記，并用諸如胰蛋白酶等蛋白水解酶切割。再將切割產(chǎn)物添加到錨著的融合蛋白上，使之 結(jié)合。洗去未結(jié)合的肽之后，可以用已知方法將標記的結(jié)合物質(zhì)(代表細胞內(nèi)結(jié)合配對物 結(jié)合區(qū))洗脫，純化，并分析其氨基酸序列。如此鑒定出的肽可以通過合成來制備，或者利 用重組DNA技術與適當?shù)挠欣鞍兹诤稀?.藥物組合物本文所述BvS多肽及其調(diào)節(jié)物可以以治療劑的形式應用。本發(fā)明的BvS多肽和 BvS調(diào)節(jié)物可以按照已知方法配制，以便制備藥物學有效的組合物，其中將這里的BvS產(chǎn)物 與可藥用載體賦形劑混合。BvS的治療性配制劑可以如下制備將具有所需純度(優(yōu)選基本 純)的抗體與任選的藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 見上文)混合成凍干劑或水溶液的形式。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑對暴露在所用劑 量和濃度下的細胞或哺乳動物無毒性。實例包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽和其它有 機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；小分子多肽(少于約10個殘基)；蛋白，如血清白蛋白，明 膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、 精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如 EDTA ；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽反離子如鈉；和/或非離子表面活性劑，如Tween， Pluronics 或 PEG。用于體內(nèi)給藥的BvS必需是無菌的。這可以通過本領域已知的任何方法，如在冷 凍干燥和重新配制之前或之后通過除菌濾膜過濾而輕易實現(xiàn)。BvS可以以凍干形式保存。 治療性BvS組合物通常置于具有無菌存取口的容器中，例如靜脈注射袋或帶有能通過皮下 注射針刺穿的塞子的小瓶。
Bv8可以選擇與其它生長因子組合或聯(lián)合給藥。例如，它可以與EG-ECGF或VEGF組合。BvS可以與癌癥治療的其它常規(guī)療法一起使用。給藥途徑與已知方法一致，例如通過靜脈，腹腔，大腦內(nèi)，及肉牛，眼內(nèi)，動脈內(nèi)或 損傷內(nèi)等途徑進行注射或輸注，局部給藥，或通過緩釋系統(tǒng)給藥。本發(fā)明藥物組合物的劑量和所需藥物濃度將依預想的特定用途而異。決定適宜 劑量或給藥途徑是普通內(nèi)科醫(yī)師完全能夠很好勝任的事情。動物實驗可以為確定人類 治療的有效劑量提供可靠的指導?？梢园凑誐ordenti，J. and Chappel 1, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics，，In Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi 等編，Pergamon Press, New York 1989，pp. 42-96 中所述原則，來換 算種屬間有效劑量的比例(Interspecies scaling)。當希望將BvS多肽以配制劑形式給藥且該配制劑具有治療任何需要給藥BvS多肽 的疾病所合適的釋放特性時，考慮將BvS多肽或調(diào)節(jié)物包封在微膠囊中。例如，將純化的 BvS包封在按照例如凝聚技術或界面聚合技術制備的微膠囊(分別例如羥甲基纖維素或明 膠微膠囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中，在膠體藥物釋放系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體，白蛋白 微球體，微乳劑，納米顆粒和毫微膠囊)中或在大乳劑中。這類技術公開在Remington' s Pharmaceutical Sciences，16th edition, Osol, A. Ed. (1980)中?？梢詫v8摻入緩釋制劑中用于治療用途。緩釋制劑的適當實例包括具有一定形 狀的半通透聚合物基質(zhì)，如膜或微膠囊。緩釋基質(zhì)實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙 基-異丁烯酸酯)(Langer 等，J. Biomed. Mater. Res. , 15 167-277 (1981) ；Langer, Chem. Tech. ,12 =98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利 3773919，EP 58，481)，L-谷 氨酸與Y乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22 :547 (1983))，不可降 解的乙烯乙酸乙酯(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron Depot (由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的 微球體)，以及聚D- (-) -3-羥丁酸(EP 133，988)。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸_羥基乙酸能持續(xù)釋放分子100天以上，而一 些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。當膠囊化蛋白長時間停留在體內(nèi)時，它們可能由于暴露 在37°C潮濕環(huán)境中而變性或凝聚，導致?lián)p失生物活性，且免疫原性可能會改變?？梢愿鶕?jù)相 關機理來設計使蛋白穩(wěn)定的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換 而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍干、控制濕度、采用合適的 添加劑、和開發(fā)特異性聚合物基質(zhì)組合物來實現(xiàn)穩(wěn)定。緩釋的BvS組合物也可以包括用脂質(zhì)體包裹的Bv8。含有BvS的脂質(zhì)體通過本 領域已知方法來制備(Epstein 等，1985，Proc. Natl. Acid. Sci. 82 3688 ；Hwang 等，1980， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4030 ；DE 3. 218，121A ；EP 52322A ；EP 36676A ；EP 88046A ； EP 143949A ；EP 142641A ；日本專利申請 83-118008 ；美國專利 4，485，045 和 4，544，545 ；EP 102, 324A) 0脂質(zhì)體通常為小單層(imilamelar)(約200-800人)，其中的脂質(zhì)含量超過約 30mol. %膽固醇，調(diào)整所選比例以便使BvS治療效果最佳。當局部用藥時，BvS適合于與諸如載體和/或佐劑等其它成分組合。對所述其它成 分的特性沒有限制，只要它們是生理上可接受的，對于其目的用藥是有效的，并且不會降低
47組合物中活性成分的活性。合適的賦形劑的例子包括軟膏劑，乳膏，凝膠劑，或懸液，含有或 不含純化的膠原蛋白。組合物也可浸滲到經(jīng)皮貼劑(patch)，硬膏劑(plaster)和繃帶中， 優(yōu)選以液體或半液體的形式浸滲。為了獲得凝膠配制劑，可以將配制在液體組合物中的BvS與有效量的水溶性多肽 或合成聚合物如PEG混合，以便形成具有適合于局部應用的粘度的凝膠。可以使用的多 糖包括，例如，纖維素衍生物，如醚化的纖維素衍生物，包括烷基纖維素，羥基烷基纖維素， 和烷基羥基烷基纖維素，例如，甲基纖維素，羥乙基纖維素，羧甲基纖維素，羥丙基甲基纖 維素，和羥丙基纖維素；淀粉和分級淀粉；瓊脂；藻酸和藻酸鹽；阿拉伯膠；支鏈淀粉；瓊脂 糖；角叉藻聚糖；葡聚糖(dextran)；糊精；果聚糖；菊粉；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖； 脫乙酰殼多糖；糖原；葡聚糖(glucan)；和合成性生物聚合物；以及膠，例如黃原膠；瓜爾 豆膠；槐豆莢膠；阿拉伯膠；西黃蓍膠；和刺梧桐樹膠；及其衍生物和混合物。本文優(yōu)選的膠 化劑是對生物學系統(tǒng)為惰性的，無毒的，制備簡單的，且不太流動或粘滯的膠化劑，它不會 使承載在其內(nèi)部的BvS失去穩(wěn)定性。優(yōu)選的多糖是醚化的纖維素衍生物，更優(yōu)選充分鑒定、純化并在USP中列出的多 糖，例如，甲基纖維素和羥烷基纖維素衍生物，如羥丙基纖維素，羥乙基纖維素和羥丙基甲 基纖維素。本文最優(yōu)選甲基纖維素。用于凝膠配制的聚乙二醇一般是低分子量和高分子量PEG的混合物，這樣能獲得 適當?shù)恼扯取＠?，分子?00-600的PEG與分子量1500的PEG的混合物當以適當比率混 合而獲得糊劑(paste)時對該目的是有效的。用于多糖和PEG的術語“水溶性”意在包括膠體溶液和分散液。一般來說，纖維素 衍生物的溶解度可以通過醚基團的取代程度來確定，本文有用的穩(wěn)定衍生物在纖維素鏈中 每個脫水葡萄糖單元應具有足夠量的這類醚基團以使所述衍生物具有水溶性。醚取代程度 為每個脫水葡萄糖單元上至少0. 35個醚基團一般是足夠的。另外，纖維素衍生物可以是堿 金屬鹽，例如，Li，Na, K，或Cs鹽的形式。 當凝膠中使用甲基纖維素時，優(yōu)選它占該凝膠的約2-5%，更優(yōu)選約3%，而BvS的 量為每毫升凝膠約300-1000mg。半通透的可植入膜裝置可以作為在一些情況下運送藥物的有效工具。例如，可以 將分泌Bv8，Bv8變體，BvS嵌合體或BvS激動劑或拮抗劑的細胞被囊化，并將這類裝置植入 到患者體內(nèi)。相應地，本發(fā)明還包括預防或治療癌癥的方法，包括將分泌Bv8、或根據(jù)具體情 況需要分泌其激動劑或拮抗劑的細胞植入到有需要的患者體內(nèi)。最后，本發(fā)明包括通過在 患者體內(nèi)植入植入體來預防或治療癌癥的裝置，所述植入體包含半透膜，和分泌BvS (或根 據(jù)具體情況的需要分泌BvS激動劑或拮抗劑)的細胞，所述細胞包裹在所述膜中，且所述膜 可以透過BvS (或其激動劑或拮抗劑)但不能透過來自患者的對細胞有害的因子?？梢詫?患者自身的經(jīng)過轉(zhuǎn)化能回體(ex vivo)產(chǎn)生BvS的細胞直接植入該患者，任選不經(jīng)過上述 被囊化。將活細胞用膜進行被囊化的方法是本領域普通技術人員很熟悉的，且被囊化細胞 的制備以及將它們植入患者都無需過多的實驗就可以實現(xiàn)。含有BvS或BvS激動劑或拮抗劑的藥物組合物優(yōu)選裝在合適的容器內(nèi)。所述容器 優(yōu)選帶有詳細說明該藥物組合物的相應用途和劑量的說明。本領域技術人員將認識到，依 據(jù)治療方法的不同，這些說明會有不同。
7.治療方法本文提供的治療劑可以在多種治療中使用。所述治療包括治療哺乳動物(優(yōu)選 人)的與產(chǎn)激素的組織或內(nèi)分泌腺體相關的情況和/或與過度、不想要的或失控的血管生 成相關的情況。在一個方面，BvS或BvS激動劑以有效治療疾病的劑量給予需要治療的哺 乳動物。用于給藥的BvS可以是多肽或核酸形式。優(yōu)選，BvS或BvS激動劑用于要求使產(chǎn) 生具體激素的細胞存活或數(shù)量增加的情況中。這種情況的實例包括糖尿病。其它情況包括 希望增加生殖器官中細胞(如睪丸中的細胞)的數(shù)量或增強其存活的那些疾病。其它情況 包括希望減少新血管形成的那些。這種情況的實例包括腫瘤，如睪丸癌。BvS可以與另一種化合物或組合物聯(lián)合給藥。在一個實施方案中，所述化合物是 VEGF或其激動劑或拮抗劑。可選地，所述化合物為編碼多肽(如VEGF)的核酸。在一個實施方案中，諸如由上文第4和第5章節(jié)所述篩選試驗鑒定出的那些化合 物，可以用于調(diào)節(jié)BvS活性或表達的水平。具體地，鑒定為BvS激動劑的化合物或能刺激 BvS與其受體結(jié)合的化合物，可以用于希望增加BvS活性水平的治療中。類似地，經(jīng)鑒定能 增加BvS基因表達的化合物可以用于這類治療中。優(yōu)選地，將BvS或其激動劑或拮抗劑給藥個體以便治療與生成激素的組織或內(nèi)分 泌腺體相關的情況，優(yōu)選需要減少生成具體激素的細胞的數(shù)目、減少細胞增殖或減少血管 生成的情況。例如，本文提供一種調(diào)節(jié)個體的生育力的方法，它包括將BvS拮抗劑以有效調(diào) 節(jié)生育力的量給予個體。也可以給藥BvS拮抗劑來治療囊腫(cysts)和其它與生成激素的 組織過度增生有關的情況。類固醇激素依賴性疾病也可以用本發(fā)明的組合物和方法進行治療。這類疾 病包括脂樣先天性腎上腺肥大，不育，性成熟(sexual maturation)，雄激素依賴性 腫瘤，性早熟(precocious puberty)，McCune-Albright綜合征，先天性腎發(fā)育不全 (adrenal-hypoplasia congenital), 氐生Ι/Ι "生 功倉^MilSS (hypogonadotropic hypogonadism)?？梢杂帽疚奶峁┑脑噭┖徒M合物進行治療的一種具體情況是癌癥，尤其類固醇依 賴性癌癥，如雄激素依賴性癌癥。本文提供的治療癌癥的優(yōu)選方法包括，對患有或易患癌癥 的個體給藥有效治療該癌癥的量的BvS拮抗劑。在一個實施方案中，所述癌癥是睪丸的癌癥。在另一實施方案中，將BvS拮抗劑與一或多種化療劑聯(lián)合給予患者，如在癌癥 的治療中。這里考慮在用化療劑治療之前、期間或之后給藥BvS以便增強療效。優(yōu)選的 化療劑包括但不限于長春新堿(vincristine)，順鉬(cisplatin)，氨甲蝶呤，3’ -疊氮 (azido)_3，-脫氧胸苷，紫杉醇(taxane) ( TAXOL , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)和紫杉萜(doxetaxel) ( TAXOTERE , Rh0ne-Poulenc Rorer, Antony, France)和/或蒽環(huán)類(anthracycline)抗生素。這類化療劑的制備和劑量 方案可以按照廠家的說明書所述來確定，或者可以由有經(jīng)驗的醫(yī)師根據(jù)其經(jīng)驗來確定。 這類化療劑的制備和劑量方案還可以參見Chemotherapy Service Ed. , Μ. C. Perry, ffilliams&ffilkins, Baltimore, MD(1992)。應理解，增加細胞的增殖和抑制細胞的增殖的方法可以在體內(nèi)或體外進行。在一 些情況中，希望將BvS添加到體外細胞樣品中以便刺激特定細胞類型的增殖。經(jīng)BvS處理的樣品然后可以用于篩選試驗中或被移植到需要治療的個體中或動物模型中。有效量的BvS或BvS激動劑或拮抗劑可以根據(jù)，例如治療目的，給藥途徑，和病人 的情況而用于治療。因此，臨床醫(yī)師必需根據(jù)獲得最佳治療效果的需要來滴定劑量并調(diào)整 給藥途徑。通常，臨床醫(yī)師會持續(xù)給藥BvS直到獲得所需效果。全身治療的通常日劑量為約 10ng/kg-最多100mg/kg哺乳動物體重/天或更高劑量不等。優(yōu)選約1 μ g/kg/天-IOmg/ kg/天，這取決于給藥途徑。應能預計到，不同配制劑可以針對不同的治療化合物和不同的 疾病有效，針對一種器官或組織進行給藥時所必需的方式可以不同于其它器官或組織。另一種建議是，將BvS以能在靶組織中建立有效但不含不當毒性的BvS水平的劑 量來配制并運送到靶位點或組織。該組織內(nèi)濃度應通過連續(xù)輸注、緩釋、局部應用、植入BvS 表達細胞、或按照經(jīng)驗確定的頻率進行注射等方式盡可能地維持。該治療的進展可以通過 常規(guī)試驗很容易地監(jiān)控。用藥方案必需根據(jù)個體的情況來確定。但在優(yōu)選實施方案中，BvS或BvS激動劑 或拮抗劑是每天給藥，更優(yōu)選每隔天給藥，還更優(yōu)選一周至少兩次給藥。治療優(yōu)選持續(xù)6個 月，更優(yōu)選持續(xù)1個月，還更優(yōu)選持續(xù)至少兩周。本領域技術人員將認同，真實的用藥方案 必需由臨床醫(yī)師根據(jù)個體的情況來確定。編碼BvS多肽的核酸可以用于基因治療。在基因治療的應用中，將基因引入細胞 以便實現(xiàn)在體內(nèi)合成對治療有效的基因產(chǎn)物，例如用于替換缺陷基因基因產(chǎn)物?！盎蛑?療”既包括經(jīng)單次治療就可獲得永久效果的常規(guī)基因治療，也包括基因治療劑的給藥，后者 涉及一次或重復多次施用治療有效量的DNA或mRNA。反義RNA和DNA可用作體內(nèi)阻斷特定 基因表達的治療劑。業(yè)已證明，可以將短鏈反義寡核苷酸運輸?shù)郊毎?，它們在那里起抑?劑的作用，該作用不受細胞膜限制其攝取所導致的其較低細胞內(nèi)濃度。(Zamecnik等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :4143_4146[1986])。可以修飾寡核苷酸以增強其攝取，例如用不帶 電荷的基團取代帶負電荷的磷酸二酯基團。有多種技術可以用于將核酸引入到活細胞中。所述技術根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移到體 外培養(yǎng)的細胞中，還是轉(zhuǎn)移到目標宿主體內(nèi)的細胞中而異。適于將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動物 體外細胞中的技術，包括脂質(zhì)體的使用、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸 鈣沉淀法等。目前優(yōu)選的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術包括，用病毒(通常為逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體進 行轉(zhuǎn)染和用病毒衣殼蛋白-脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染(Dzau等，Trends in Biotechnology 11， 205-210 (1993))。有些情況下，希望提供帶有靶向靶細胞的試劑的核酸源，所述物質(zhì)如對 細胞表面膜蛋白或靶細胞具有特異性的抗體，靶細胞表面受體的配體等。使用脂質(zhì)體時， 將與參與胞吞的細胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白用于靶向和/或促進攝取，例如對特定類型細 胞具有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中發(fā)生內(nèi)化的蛋白的抗體、靶向細胞內(nèi)位置并延 長細胞內(nèi)半壽期的蛋白。有關受體-介導的胞吞的技術在例如Wu等，J.Biol. Chem. 262, 4429-4432(1987)；和 Wagner 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,3410-3414(1990)中有描 述。關于基因示蹤(marking)和基因治療方案的綜述，請參見Anderson等，Science 256， 808-813(1992)。BvS序列也可以用于診斷方法中。BvS的過度表達可以指示生殖器官中的囊腫或 癌癥。而且，可以分析患者樣品中突變的或失去功能的Bv8。這類方法一般包括比較患者樣 品和對照樣品中BvS的表達。
8.制品本發(fā)明另一實施方案涉及一種制品，其包含可用于治療或預防疾病或用于調(diào)節(jié)生 育力的材料。所述制品優(yōu)選包括一個容器和位于該容器表面的或與該容器相連的標簽或包 裝插頁。適當?shù)娜萜饔衅孔?，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容 器內(nèi)裝載含有BvS或其激動劑或拮抗劑的組合物，標簽或包裝插頁優(yōu)選提供BvS或其激動 劑或拮抗劑的使用說明。在一個實施方案中，所述制品包含BvS拮抗劑和用BvS拮抗劑治 療或預防癌癥的使用說明。在另一實施方案中，所述制品包含BvS和用BvS治療或預防與 產(chǎn)激素的內(nèi)皮組織相關的疾病的使用說明。在另一實施方案中，所知制品包含BvS拮抗劑 和用BvS拮抗劑調(diào)節(jié)生育力的使用說明。包裝插頁還可以包括適當劑量方案的說明。在一 個實施方案中，該插頁指示，可以按照約0. 01 μ g/kg-50mg/kg的量給藥所述組合物。
實施例以下實施例中用到的市售試劑，除非特別說明，都按照廠家建議使用。以下實施例 以及說明書全文中用ATCC保藏號定義的細胞都來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VTV0實施例1 Northern印跡分析為了闡明BvS的表達模式，用來自人、小鼠和大鼠的各種組織的RNA進行Northern 印跡分析。人RNA印跡與32P-標記的基于人Bv8cDNA的DNA探針雜交，小鼠和大鼠RNA印 跡與32P-標記的基于鼠Bv8 cDNA的DNA探針雜交。Northern印跡分析按照本領域已知方法進行。例如，用30_50ng人或小鼠cDNA 片段，Redi-Prime II 試劑盒(Amersham)，32P_dCTP 3000 μ Ci/mmol (Amersham)制備 cDNA探針。探針在S印hadex G50旋轉(zhuǎn)柱(Pharmacia)上純化，在ExpressHyb雜交溶液 (Stratagene)中68°C進行雜交。在另一實施例中，將印跡與探針在雜交緩沖液(5X SSPE ； 2X Denhardt溶液；100mg/mL變性并剪切的鮭精DNA ；50%甲酰胺；20Z0 SDS)中42°C孵育60 個小時。印跡在2X SSC ;0. 05% SDS中室溫洗滌1小時，共數(shù)次，然后在0. IX SSC ；0. 1% SDS中50°C洗滌30分鐘。將印跡用phosphorimager analysis (Fuji)曝光過夜進行顯色。 等量的RNA加載量通過與對照肌動蛋白探針雜交來評估。檢測Bv8mRNA的轉(zhuǎn)錄子。圖9顯示，用人Bv8探針在人睪丸中檢測到1. 8kb的單 一 mRNA類型。在所分析的任何其它人類組織中都沒有檢測到表達。圖10A顯示，在小鼠睪 丸和心臟中檢測到單一的mRNA類型。圖10B顯示，在大鼠睪丸中檢測到1. 8kb和0. 8kb的 轉(zhuǎn)錄子，在其它的大鼠組織中未發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)總體上表明，睪丸是BvSmRNA表達的主要部 位。實施例2細胞增殖分析為了確定具體類型的細胞對BvS的應答，分析了牛腎上腺皮質(zhì)毛細管內(nèi)皮細胞 (ACE)和牛腦毛細管內(nèi)皮細胞(BBC)的增殖應答。簡言之，將ACE(腎上腺皮質(zhì)毛細管內(nèi)皮細胞)和BBC(牛腦毛細管)內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 在補加了 10%小牛血清的低葡萄糖DMEM中。為了進行細胞增殖分析，將6000個細胞鋪在 12孔板的每一個含有上述培養(yǎng)基的孔中，不添加對照(圖11中的“C”)，10ng/ml VEGF(圖 11中的“V”)，50，10或InM BvS (Fe-標記的重組蛋白)。1周后用Coulter計數(shù)器獲得細胞總計數(shù)。將對照條件隨機設置為1，獲得相對于它的細胞數(shù)增加倍數(shù)。培養(yǎng)基和其它細 胞培養(yǎng)試劑從Life Technolgies, Inc.公司獲得。所述分析的進行可參見Aravind and Koonin, Curr. Biol. 8 :477_478 (1998)。初步結(jié)果見圖IlA和11B，這些圖顯示了相對于對照的細胞數(shù)增加情況。BvS在所 有測試濃度下都使細胞增殖增加，最大效應發(fā)生在濃度為50nM時。陽性對照VEGF誘導的 ACE和BCC細胞增殖是未處理對照的將近3倍。實施例3細胞存活分析檢測BvS對內(nèi)皮細胞存活的影響。將大約2xl05個牛腦毛細管(BBC)細胞鋪在 6孔板上含有完全培養(yǎng)基(見實施例2)的每一孔中。次日，吸出完全培養(yǎng)基，將細胞培養(yǎng) 在不含任何添加劑的培養(yǎng)基中，或者培養(yǎng)在含有以下一種成分的培養(yǎng)基中2% FCS, 10% FCS，20ng/ml VEGF(圖 12 的 “V”)，5nM Bv8,25nM Bv8,20ng/ml VEGF+25nM Bv8 (圖 12 的 “V+Bv8”)，或25nM EG-VEGF。孵育48小時后，細胞經(jīng)胰蛋白酶處理后取出，在70%冷乙醇 中固定數(shù)小時。然后將細胞用5 μ g/ml碘化丙啶和20ng/ml RNase的PBS溶液室溫染色 2-4個小時。亞-Gl期的細胞用FACS分析來確定。將該細胞群體的百分比作為圖12中縱 軸上的凋亡細胞百分比來作圖。如圖12所示，BvS增強了 BBC內(nèi)皮細胞的存活。具體地，在任一濃度的BvS存在 時，比在2% FCS或25nM EG-VEGF存在時，培養(yǎng)中凋亡細胞的數(shù)量少。Bv8和VEGF顯示協(xié) 同效應，這兩種化合物組合使細胞存活增加的程度高于它們各自或者10% FCS0實施例4體內(nèi)誘導血管牛成檢測BvS誘導血管生成應答的能力。在一組實驗中，測定BvS對雄性Beige裸鼠 睪丸中血管增殖的影響。編碼LacZ，VEGF,和 EG-VEGF 腺病毒有文獻描述(LeCouter, Nature, 412 :877_84， 2001)。為了制備編碼Bv8的腺病毒，將編碼人Bv8的81個氨基酸的同工型的cDNA克隆 到CMV穿梭載體(Stratagene)中，按照廠家建議制備重組腺病毒載體和重組病毒。病毒用 Virapur的大規(guī)模試劑盒(Carlsbad，CA)純化，并測定其效價。為了進行體內(nèi)研究，將腺病毒載體(LacZ，VEGF, EG-VEGF和Bv8)以IO7 108pfu 注射到Beige裸鼠的睪丸中(n = 5)。7日后，處死動物，將睪丸固定并進行處理，以備組織 學分析。如圖13所示，BvS與VEGF和EG-VEGF類似，都增加了裸鼠睪丸細胞中的間質(zhì)毛細 管的體內(nèi)形成。在PBS或LacZ腺病毒對照組中，都沒有觀察到間質(zhì)毛細管形成或血管生成。 在多個經(jīng)處理的動物中，觀察到管萎縮。這種管萎縮可能源于誘導血管生成應答所導致的 間質(zhì)壓力的增加。以上說明書足以使本領域技術人員實施本發(fā)明。但，除了本文顯示和描述的以外， 對本發(fā)明的各種修改都是本領域技術人員根據(jù)上述說明顯而易見的，并且都落在所附的權 利要求范圍內(nèi)。
權利要求
誘導腎上腺皮質(zhì)毛細管內(nèi)皮(ACE)細胞增殖且包含與SEQ ID NO2或SEQ ID NO4具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽或編碼該多肽的核酸分子在制備用于誘導生成類固醇組織的內(nèi)皮細胞增殖、促進生成類固醇的組織的內(nèi)皮細胞存活、或誘導生成類固醇的組織中血管生成的藥物中的用途。
2.誘導ACE細胞增殖且包含與SEQID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的 氨基酸序列的多肽的拮抗劑在制備用于抑制生成類固醇的組織的內(nèi)皮細胞增殖、生成類固 醇的組織的內(nèi)皮細胞存活、或生成類固醇的組織中血管生成的藥物中的用途。
3.誘導ACE細胞增殖且包含與SEQID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的 氨基酸序列的多肽的拮抗劑在制備用于治療生成類固醇的組織中的癌癥的藥物中的用途。
4.權利要求3的用途，其中所述癌癥是激素依賴性癌癥。
5.權利要求2-4之一的用途，其中所述藥物還包含VEGF拮抗劑。
6.權利要求1-4之一的用途，其中所述藥物用于治療人。
7.在體外誘導生成類固醇的組織的內(nèi)皮細胞增殖、促進生成類固醇的組織的內(nèi)皮細胞 存活、或誘導血管生成的方法，包括將所述細胞與誘導腎上腺皮質(zhì)毛細管內(nèi)皮(ACE)細胞 增殖且包含與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽或 編碼該多肽的核酸分子接觸。
8.在體外抑制生成類固醇的組織的內(nèi)皮細胞增殖、生成類固醇的組織的內(nèi)皮細胞存 活、或生成類固醇的組織中的血管生成的方法，包括將所述細胞或組織與誘導腎上腺皮質(zhì) 毛細管內(nèi)皮(ACE)細胞增殖且包含與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性 的氨基酸序列的多肽的拮抗劑接觸。
9.鑒定BvS拮抗劑的方法，包括a)使候選化合物與誘導腎上腺皮質(zhì)毛細管內(nèi)皮(ACE)細胞增殖且包含與SEQID NO 2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽接觸，其中所述多肽誘導內(nèi)皮 細胞增殖、內(nèi)皮細胞存活或血管生成；和b)測定該候選化合物抑制生成類固醇的組織的內(nèi)皮細胞增殖、生成類固醇的組織的內(nèi) 皮細胞存活、或生成類固醇的組織中血管生成的能力。
10.權利要求1-4之一的用途或權利要求7-9之一的方法，其中所述多肽是天然序列Bv8。
11.權利要求10的用途或方法，其中所述多肽包含氨基酸序列SEQID NO :6。
12.權利要求10的用途或方法，其中所述多肽是天然人BvS多肽。
13.權利要求12的用途或方法，其中所述天然人BvS包含氨基酸序列SEQID NO :2或 氨基酸序列SEQ ID NO :4ο
14.權利要求1-4之一的用途或權利要求7-9之一的方法，其中所述多肽能與肝素結(jié)合。
15.權利要求1-4之一的用途或權利要求7-9之一的方法，其中所述多肽是嵌合的Bv8。
16.權利要求15的用途或方法，其中所述嵌合的BvS是免疫粘附素。
17.權利要求1的用途或權利要求7的方法，其中所述核酸分子包含核酸序列SEQID NO :1，SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO :5。
18.權利要求1的用途或權利要求7的方法，其中所述藥物還包含VEGF或編碼VEGF的 核酸分子。
19.權利要求1或2的用途或權利要求7-9之一的方法，其中所述內(nèi)皮細胞是內(nèi)分泌腺 內(nèi)皮細胞。
20.權利要求1-4之一的用途或權利要求7-9之一的方法，其中所述生成類固醇的組織 包括腎上腺、生殖器官、消化道或呼吸道組織。
21.權利要求20的用途或方法，其中所述生殖器官包括睪丸，卵巢，宮頸或子宮。
22.權利要求2-4之一的用途或權利要求8或9的方法，其中所述拮抗劑是抗體，抗體 片段或免疫粘附素。
23.權利要求22的用途或方法，其中所述抗體片段是Fab、Fab，、F(ab，)2或？￥片段。
24.權利要求22的用途或方法，其中所述抗體或抗體片段是單克隆的。
25.權利要求22的用途或方法，其中所述抗體或抗體片段是嵌合的。
26.權利要求22的用途或方法，其中所述抗體或抗體片段是人源化的。
27.一種制品，包含容器；誘導腎上腺皮質(zhì)毛細管內(nèi)皮(ACE)細胞增殖且包含與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4具 有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽的拮抗劑；和如何用所述拮抗劑治療生成類固醇的組織中癌癥的說明。
28.權利要求27的制品，其中所述生成類固醇的組織是睪丸組織或卵巢組織。
29.權利要求27的制品，其中所述拮抗劑是結(jié)合BvS多肽的抗體或其抗原結(jié)合片段，或 者與編碼BvS多肽的多核苷酸雜交的反義分子。
30.權利要求5的用途，其中所述VEGF拮抗劑是結(jié)合VEGF多肽的抗體或其抗原結(jié)合片 段，或者與編碼VEGF多肽的多核苷酸雜交的反義分子。
31.一種用于誘導內(nèi)皮細胞血管生成、誘導內(nèi)皮細胞增殖或促進內(nèi)皮細胞存活的組合 物，其包含BvS或編碼BvS的核酸分子。
32.一種用于治療生成類固醇的組織的病癥的組合物，其包含BvS或編碼BvS的核酸分子。
33.權利要求32的組合物，其中所述生成類固醇的組織包括內(nèi)分泌腎上腺、生殖器官、 消化道或呼吸道。
34.權利要求32的組合物，其中所述生成類固醇的組織的病癥包括先天性脂樣腎上腺 增生，不育，性成熟，依賴雄性激素的腫瘤，性早熟，McCime-Albright綜合征，先天性腎上腺 發(fā)育不全，或低促性腺激素型性腺功能衰退。
35.一種用于抑制內(nèi)皮細胞增殖、內(nèi)皮細胞存活、或內(nèi)皮細胞血管生成的組合物，其包 含BvS拮抗劑。
36.一種用于調(diào)節(jié)不育的組合物，其包含BvS拮抗劑。
37.權利要求31-34中任一項的組合物，其中所述組合物還包含VEGF或編碼VEGF的核 酸分子。
38.權利要求31或35的組合物，其中所述內(nèi)皮細胞包括血管內(nèi)皮細胞。
39.權利要求31或35的組合物，其中所述內(nèi)皮細胞包括生成類固醇的組織的細胞或內(nèi)分泌腺細胞。
40.權利要求39的組合物，其中所述生成類固醇的組織包括腎上腺、生殖組織、消化 道、或呼吸道組織。
41.權利要求40的組合物，其中所述生殖組織包括睪丸、卵巢、子宮或?qū)m頸。
42.權利要求35-36中任一項的組合物，其中所述組合物還包含VEGF拮抗劑。
43.權利要求35-36中任一項的組合物，其中所述拮抗劑包括抗體、抗原結(jié)合性抗體片 段、或反義分子。
44.權利要求43的組合物，其中所述抗原結(jié)合性抗體片段包括Fab、Fab，、F(ab，)2或 Fv片段。
45.權利要求43的組合物，其中所述抗體是人源化的，或者所述抗原結(jié)合性抗體片段 是人源化抗體的片段。
46.權利要求31-36中任一項的組合物，其中所述Bv8包含與SEQID NO :2或SEQ ID NO 4的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，并且誘導內(nèi)皮細胞增殖。
47.權利要求46的組合物，其中所述BvS是天然序列Bv8。
48.權利要求47的組合物，其中所述Bv8包含SEQID NO 6的氨基酸序列。
49.權利要求47的組合物，其中所述BvS是天然人Bv8。
50.權利要求47的組合物，其中所述Bv8包含SEQID NO :2或SEQ ID NO 4的氨基酸 序列。
51.權利要求46的組合物，其中所述BvS結(jié)合肝素。
52.權利要求46的組合物，其中所述BvS包括嵌合Bv8。
53.權利要求46的組合物，其中所述嵌合BvS包括免疫粘附素。
54.權利要求46的組合物，其中所述Bv8包含由SEQID NO 1的核酸11-400、SEQ ID NO 3的核酸10-336、或SEQ ID NO 5的核酸57-484編碼的多肽。
55.權利要求31-34中任一項的組合物，其中所述多核苷酸包含SEQID N0:1的核酸 11-400、SEQ ID NO 3 的核酸 10-336、或 SEQ ID NO 5 的核酸 57-484。
56.誘導ACE細胞增殖且包含與SEQID NO :2或SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的 氨基酸序列的多肽或編碼該多肽的核酸分子在制備用于治療糖尿病的藥物中的用途。
57.一種用于治療糖尿病的組合物，其包含誘導ACE細胞增殖且包含與SEQ ID N0:2或 SEQ ID NO :4具有至少90%同一性的氨基酸序列的多肽或編碼該多肽的核酸分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有促細胞分裂活性的Bv8的核酸和多肽，更具體地本發(fā)明提供了用Bv8多肽誘導內(nèi)皮細胞增生和促進內(nèi)皮細胞存活的方法。本發(fā)明還提供了篩選Bv8活性調(diào)節(jié)物的方法。本發(fā)明還提供了利用Bv8多肽進行治療的方法。
文檔編號G01N33/15GK101884784SQ20101022753
公開日2010年11月17日 申請日期2002年8月27日 優(yōu)先權日2001年8月29日
發(fā)明者納波利奧恩·弗拉拉, 詹妮弗·利考特 申請人:杰南技術公司