專利名稱：一種黃曲霉毒素B₁磁分離熒光定量檢測(cè)試劑盒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃曲霉毒素B1免疫磁分離熒光定量 檢測(cè)試劑盒的制備方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin，簡(jiǎn)寫AF)是主要由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的次生代 謝產(chǎn)物，世界各地的玉米、小麥、高粱、甘薯、大豆、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品中均存在黃曲 霉毒素的污染情況。目前發(fā)現(xiàn)的18種黃曲霉毒素中，黃曲霉毒是毒性最大的真菌毒素，其 毒性為砒霜的68倍，它誘發(fā)肝癌的能力是二甲基亞硝胺的75倍，它具有誘導(dǎo)突變、抑制免 疫和致癌的作用，是目前公認(rèn)致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)之一。AFMpAFByAFG1次之。同時(shí)，AF十分 穩(wěn)定，加熱至230°C才能被完全破壞，因此一般烹飪加工不易消除，并且它可以通過(guò)多種途 徑污染食品，直接或間接進(jìn)入人類食物鏈，威脅人類健康和生命安全。目前國(guó)際上對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中AF含量的檢測(cè)，已成為強(qiáng)制性貿(mào)易技術(shù)措施。其中薄層層 析法、高效液相色譜法和免疫化學(xué)法是受人們關(guān)注的幾個(gè)代表性方法。以上三種方法中，薄 層層析法是研究AF初期所使用的主要方法，主要是由于樣品前處理過(guò)程繁瑣、復(fù)雜，較適 合于定性檢測(cè)，不適于大批量樣品的快速檢測(cè)；高效液相色譜法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確等特 點(diǎn)，并且可以用于定性和定量檢測(cè)，但儀器價(jià)格昂貴，不便于操作；免疫分析法操作簡(jiǎn)便、快 速，但也只能用來(lái)進(jìn)行定性檢測(cè)。因此，開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)務(wù)之急。目前， 用納米材料實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)的方法是利用金標(biāo)試紙進(jìn)行檢測(cè)，該方法可以快速的檢測(cè)黃曲霉 毒素的含量達(dá)標(biāo)與否，但不能進(jìn)行定量檢測(cè)。本發(fā)明利用磁性分離和熒光納米材料檢測(cè)技 術(shù)相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素B1的定量檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種黃曲霉毒素B1磁分離熒光定量檢測(cè)試劑盒的制備方法， 主要用于檢測(cè)糧食、食品、飲料、酒類、飼料等中的黃曲霉毒素B1的含量。由于熒光粒子的激發(fā)譜在吸收閾值以上幾乎是連續(xù)的，利于多波長(zhǎng)激發(fā)；高強(qiáng)度 的熒光發(fā)射，發(fā)光穩(wěn)定性好，不容易被光分解和漂白，因此可以用于標(biāo)記物的定量檢測(cè)。磁 性納米材料具有特殊的超順磁性，是被廣泛應(yīng)用的快速磁分離材料。利用磁性材料將被檢 測(cè)物從待檢樣本中分離，并與熒光檢測(cè)試劑結(jié)合形成免疫夾心復(fù)合物，這樣可以利用熒光 粒子進(jìn)行樣本的定量檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案檢測(cè)原理是樣品中的黃曲霉毒素B1首先與磁性納米材料表面 的抗體(復(fù)合物(I))發(fā)生免疫反應(yīng)，偶聯(lián)到磁性分離試劑一復(fù)合物(I)上，再加入偶聯(lián)有 全抗原的熒光粒子溶液(復(fù)合物(II))，復(fù)合物(II)中的黃曲霉毒素B1與復(fù)合物(I)上的 剩余抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成復(fù)合物(ι)--復(fù)合物(II)的免疫夾心復(fù)合物(III)，這樣免疫 夾心復(fù)合物(III)的熒光強(qiáng)度就與黃曲霉毒素B1的量相關(guān)。在測(cè)試范圍內(nèi)，可以看出樣品
3中黃曲霉毒素的濃度與最終被測(cè)溶液的熒光粒子溶液的熒光強(qiáng)度成反比，其具體的黃曲霉 毒素的含量需要從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上獲得。本發(fā)明所述的一種黃曲霉毒素B1磁分離熒光定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其步驟 如下(1)磁性粒子的制備通過(guò)高溫分解法制備粒徑為5 ISnm的Fe3O4磁性粒子，再 利用細(xì)乳液法制備表面功能化的Fe3O4磁性粒子；(2)磁性分離試劑--復(fù)合物(I)的制備利用縮合劑EDC(EDC 乙基_(3_ 二甲 基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)，使Fe3O4磁性粒子與黃曲霉毒素B1抗體(兔源性多克隆抗 黃曲霉毒素B1抗體，購(gòu)買于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)偶聯(lián)形成復(fù)合物(I)；(3)熒光粒子的制備通過(guò)有機(jī)相合成法制備CdSe熒光粒子，所制得的熒光粒子 的尺寸在2. 5 3. Onm (其它熒光納米材料如CdTe熒光粒子、具有核-殼結(jié)構(gòu)的CdSe/ZnS 熒光粒子等也適用于本發(fā)明方法)，然后通過(guò)聚馬來(lái)酸使熒光粒子表面功能化并轉(zhuǎn)移到水 相，得到熒光粒子；(4)熒光檢測(cè)試劑一復(fù)合物(II)的制備利用縮合劑EDC，使熒光粒子與黃曲霉 毒素B1的全抗原(BSA-AFB1 連接黃曲霉毒素B1的牛血清白蛋白，購(gòu)買于西格瑪奧德里奇 (上海)貿(mào)易有限公司)偶聯(lián)形成復(fù)合物(II)；(5)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制取6份磁性分離試劑一復(fù)合物(I)(每份200uL)分 別放入試管中，再依次分別加入不同濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液20uL(黃曲霉毒素B1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制黃曲霉毒素B1首先溶解在甲醇溶液中，配制成lmg/mL甲醇溶液，然后用含 10%甲醇(體積含量)的磷酸緩沖溶液(pH 7.4、0.01mol/L)稀釋一定倍數(shù)，即得到黃曲 霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為0ng/mL、0. lng/mL,0. 5ng/mL、 1. 0ng/mL、2· 0ng/mL、5· Ong/mL。)，在37°C下孵育20分鐘后，在磁場(chǎng)中沉淀；然后倒去上 清液，再分別加入50uL熒光檢測(cè)試劑復(fù)合物(II)溶液，在37°C下孵育20分鐘，在磁場(chǎng)中 沉淀，倒去上清液，得到免疫夾心復(fù)合物(III)。再分別加入200uL的磷酸緩沖溶液(pH = 7. 4,0. Olmol/L)，測(cè)定每個(gè)試管內(nèi)溶液的熒光光譜，記錄其最大熒光強(qiáng)度(熒光分光光度 計(jì)一島津RF5301)；然后以熒光強(qiáng)度與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲 線。(6)在實(shí)際檢測(cè)中，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，再測(cè)定(重復(fù)第5步中的操作過(guò)程) 樣品的熒光強(qiáng)度，通過(guò)工作曲線讀取樣品中AFB1的濃度。免疫磁分離熒光定量檢測(cè)試劑盒用于黃曲霉毒素B1的檢測(cè)，其檢測(cè)限為0. 1 5ng/mL。


圖1 以熒光強(qiáng)度與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。
具體實(shí)施例方式1.磁性粒子的制備(1)參照文獻(xiàn) J.Am· Chem. Soc.，2004，126，273-279，通過(guò)高溫分解方法合成 Fe3O4 磁性粒子。向N2保護(hù)的三頸瓶?jī)?nèi)加入乙酰丙酮鐵[Fe(acac)3] (0. 3532g)，1，2-十二二元醇 (1.0117g)，油酸(1.0220mL)，油胺(0. 99mL)混合，芐醚(IOmL)，磁力攪拌。混合物加熱至 200°C，2h ；然后停止通入氮?dú)?，再加熱至約30(TC，Ih，停止加熱，終止反應(yīng)，冷卻至室溫。冷
4卻后向三頸瓶中加入20mL乙醇，14000rpm離心20min，棄上清；將沉淀分散于25uL油酸、 25uL油胺和5mL正己烷混合溶液中；6000rpm離心IOmin ；棄沉淀，向上清加入IOmL乙醇， IOOOOrpm離心20min，棄上清，即得到Fe3O4磁性粒子，粒徑為5 18nm，沉淀分散于正己烷
中保存。(2)表面功能化的 Fe3O4 磁性粒子，參照文獻(xiàn) J. Nanopart. Res.，2009，11, 289-296 首先超聲將0. 218g Fe3O4磁性粒子分散在ImL苯乙烯和0. ImL環(huán)己烷的溶液中形成油相， 再將0. 08g十二烷基硫酸鈉(SDS)和0. Olg NaHCO3溶解于30mL水中形成水相；將油相和 水相在冰水浴的條件下混合超聲10分鐘形成穩(wěn)定的細(xì)乳液，然后將細(xì)乳液轉(zhuǎn)入到加熱的 四頸瓶中，當(dāng)溫度到達(dá)70°C時(shí)，加入0. ImL的丙烯酸，然后再加入0. 5mL含有0. 015g過(guò)硫酸 鉀(KPS)的水溶液引發(fā)聚合反應(yīng)，在通冷凝水、氮?dú)獗Ｗo(hù)、300rpm攪拌的條件下反應(yīng)12小 時(shí)，即得到表面功能化的Fe3O4磁性粒子的溶液(濃度約為5. Omg/mL)。2.磁性分離試劑一復(fù)合物(I)的制備取上述步驟(2)制備的表面功能化的Fe3O4磁性粒子溶液10uL，加入0. Olmol/L、 PH = 7. 4的磷酸緩沖溶液140uL。再依次加入50 μ LEDC(2mg/mL, 1-乙基_ (3- 二甲基氨基 丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)溶液和IuL抗體溶液(6.7mg/mL，兔源性多克隆抗黃曲霉毒素B1 抗體)，在氣浴恒溫振蕩儀中，37°C條件下反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵將磁性粒子富集在離 心管底部，吸出上清液。將離心管底部的磁性粒子用0. 01mol/L、pH =7.4的磷酸緩沖溶液 200 μ L充分溶解，于4°C保存；即得復(fù)合物(I)的溶液。3.熒光粒子的制備(1)儲(chǔ)備液的制備①儲(chǔ)備液a :氧化鎘(0. 0154g)、油酸(0. IOlg)、5mL十八烯溶 解在25mL三頸瓶中，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下加熱到240°C得到無(wú)色澄清的溶液；②儲(chǔ)備液b 硒粉 (0. 188g)、油酸(1. 94g)、18mL十八烯加入到氮?dú)獗Ｗo(hù)的50mL三頸瓶中，加熱到100°C反應(yīng) 20分鐘，然后在220°C加熱3小時(shí)，最終變?yōu)辄S色溶液；(2)熒光粒子的合成儲(chǔ)備液a(25mL)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱到280°C，加入2mL儲(chǔ)備 液b，反應(yīng)30min，得到亮紅色溶液，通過(guò)甲醇萃取，沉淀溶于氯仿，即得到CdSe熒光粒子的 氯仿溶液，粒徑為2. 5 3. Onm。(3)表面功能化的熒光粒子0. 72g的聚馬來(lái)酸十六烷醇酯(PMAH)溶解在IOOmL 高純水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值到8 10，然后加入IOmL熒光粒子的氯仿溶液(2. OxlO^mol/ L)，常溫?cái)嚢?4小時(shí)，熒光粒子即轉(zhuǎn)移到水相中。將水相溶液再過(guò)0. 22um的濾膜，除去大的 顆粒，產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)離心純化，得到表面功能化的CdSe熒光粒子溶液(濃度約為0. 5mg/mL)。4.熒光檢測(cè)試劑一復(fù)合物(II)的制備取熒光粒子溶液100 μ L，加入0. Olmol/L、pH = 7. 4的磷酸緩沖溶液50uL。再依 次加入50uL EDC(2mg/mL, 1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)溶液和2. 5uL 抗體溶液(5mg/mL，兔源性多克隆抗黃曲霉毒素B1抗體)，在氣浴恒溫振蕩儀中，37°C條件 下反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束后12000rpm離心lOmin，吸出上清液。將離心管底部的熒光粒子用 0. Olmol/L、pH = 7. 4的磷酸緩沖溶液200uL充分溶解，于4°C保存；即得復(fù)合物(II)的溶 液。5.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制取6份磁分離試劑一復(fù)合物⑴(每份200uL)，分別加入黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液20uL(黃曲霉毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為0ng/mL、0. lng/mL,0. 5ng/mL、l. Ong/mL、 2. Ong/mL,5. Ong/mL)，在37°C下孵育20分鐘后，在磁場(chǎng)中沉淀；然后倒去上清液，再加入 50uL熒光檢測(cè)試劑復(fù)合物(II)溶液，在37°C下孵育20分鐘，在磁場(chǎng)中沉淀；倒去上清液， 再加入200uL的磷酸緩沖溶液(pH= 7. 4,0. Olmol/L)，測(cè)定該溶液的熒光光譜，記錄其最大 熒光強(qiáng)度。然后再以熒光強(qiáng)度與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，測(cè) 量數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。表1 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線數(shù)據(jù)表 6.樣品的定量檢測(cè)首先配制樣品液(樣品1、樣品2、樣品3，其黃曲霉毒素Bl的已知含量分別為 0. 2ng/mL、0. 8ng/mL和3ng/mL)。然后通過(guò)步驟5所述的方法和步驟測(cè)定樣品1、2、3的熒 光值如下樣品1 =645. Icps ；樣品2 605. Icps和樣品3 564. 4cps，則通過(guò)步驟5繪制的標(biāo) 準(zhǔn)工作曲線讀取的對(duì)應(yīng)的黃曲霉毒素B1的含量分別為0. 21ng/mL、0. 83ng/mL和3. 02ng/ mL，與已知含量相符合得很好，充分表明本發(fā)明所制備的試劑盒能夠用于黃曲霉毒素B1的 定量檢測(cè)，而且準(zhǔn)確率高。
權(quán)利要求
一種黃曲霉毒素B1磁分離熒光定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其步驟如下(1)磁性粒子的制備通過(guò)高溫分解法制備粒徑為5～18nm的Fe3O4磁性粒子，再利用細(xì)乳液法制備表面功能化的Fe3O4磁性粒子；(2)磁性分離試劑 復(fù)合物(I)的制備利用縮合劑1 乙基 (3 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，使Fe3O4磁性粒子與黃曲霉毒素B1抗體偶聯(lián)形成復(fù)合物(I)；(3)熒光粒子的制備通過(guò)有機(jī)相合成法制備熒光粒子，然后通過(guò)聚馬來(lái)酸使熒光粒子表面功能化并轉(zhuǎn)移到水相，得到熒光粒子；(4)熒光檢測(cè)試劑 復(fù)合物(II)的制備利用縮合劑1 乙基 (3 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，使熒光粒子與黃曲霉毒素B1的全抗原偶聯(lián)形成復(fù)合物(II)；(5)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制取6份體積均為200uL的磁性分離試劑 復(fù)合物(I)分別放入試管中，再依次分別加入不同濃度的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液20uL，在37℃下孵育20分鐘后，在磁場(chǎng)中沉淀；然后倒去上清液，分別加入50uL熒光檢測(cè)試劑復(fù)合物(II)溶液，在37℃下孵育20分鐘，在磁場(chǎng)中沉淀；倒去上清液，再分別加入200uL、pH＝7.4、濃度為0.01mol/L的磷酸緩沖溶液，然后測(cè)定每個(gè)試管內(nèi)溶液的熒光光譜，記錄其最大熒光強(qiáng)度；再以熒光強(qiáng)度與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；(6)對(duì)未知濃度的黃曲霉毒素B1溶液重復(fù)步驟(5)中的操作過(guò)程，得到樣品的最大熒光強(qiáng)度，然后通過(guò)步驟(5)繪制的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線讀取樣品中黃曲霉毒素B1的濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉毒素B1磁分離熒光定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其 特征在于黃曲霉毒素B1的檢測(cè)限為0. 1 5ng/mL。
3.如權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉毒素B1磁分離熒光定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其 特征在于熒光粒子為CdSe熒光粒子、CdTe熒光粒子或具有核_殼結(jié)構(gòu)的CdSe/ZnS熒光 粒子。
4.如權(quán)利要求1所述的一種黃曲霉毒素B1磁分離熒光定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，其 特征在于黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制是將黃曲霉毒素B1首先溶解在甲醇溶液中，配制 成lmg/mL甲醇溶液，然后用體積含量10%甲醇的磷酸緩沖溶液稀釋，稀釋后黃曲霉毒素B1 溶液的濃度分別為 0ng/mL、0. lng/mL、0. 5ng/mL、l. 0ng/mL、2. Ong/mL 和 5. Ong/mL。
全文摘要
本發(fā)明屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃曲霉毒素B1免疫磁分離熒光定量檢測(cè)試劑盒的制備方法。本發(fā)明為免疫檢測(cè)系統(tǒng)與磁性納米材料的快速分離技術(shù)、熒光納米材料的發(fā)光特性相結(jié)合的一種測(cè)定方法，其先是制備磁性分離試劑——復(fù)合物(I)，然后使黃曲霉毒素B1偶聯(lián)到復(fù)合物(I)上，再加入偶聯(lián)有全抗原的熒光粒子溶液(復(fù)合物(II))，復(fù)合物(II)中的黃曲霉毒素B1與復(fù)合物(I)上的剩余抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成復(fù)合物(I)-復(fù)合物(II)的免疫夾心復(fù)合物(III)，這樣黃曲霉毒素的濃度與最終被測(cè)溶液的熒光粒子溶液的熒光強(qiáng)度成反比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、明顯、靈敏度高等。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101923089SQ201010228290
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者呂紹武, 張代輝, 張學(xué)忠, 徐力, 郭軼 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)