專利名稱：一種人c-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析法定量檢測(cè)試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬人C-反應(yīng)蛋白的定量檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及利用膠體金免疫層析法進(jìn) 行人C-反應(yīng)蛋白的定量檢測(cè)。_
背景技術(shù)：
C 反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)是由 Tillet 和 Francis 于 1930 年在一 些急性病患者的血清中發(fā)現(xiàn)，是環(huán)狀五球體蛋白，屬于Oligomeric鈣結(jié)合蛋白，相對(duì)分子 質(zhì)量約120，000，由5個(gè)相同的單體以非共價(jià)鍵構(gòu)成，是炎性淋巴因子白介素-6、白介素-1、 腫瘤壞死因子刺激肝臟上皮細(xì)胞合成的。因?yàn)樗芎头窝祖溓蚓那v膜C多糖起沉淀反應(yīng) 而得名。CRP主要用作細(xì)菌感染和疾病活動(dòng)性的指針。當(dāng)體內(nèi)有急性炎癥、細(xì)菌感染、大面 積組織破壞、惡性腫瘤時(shí)，很快就會(huì)出現(xiàn)CRP升高，而治愈時(shí)，又很快就降低到正常范圍，這 是一禾中急性其月反應(yīng)蛋白(acute phase reactant protein)。目前，臨床上檢測(cè)CRP主要用免疫濁度法、單向免疫擴(kuò)散法、膠乳凝集法等方法。 中國(guó)專利申請(qǐng)CN1040438提供了一種快速檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的試劑，是由羊抗人CRpZgCT、聚 苯乙烯乳膠、甘氨酸緩沖液、蒸餾水、疊氮鈉配制的一種膠乳凝集法檢測(cè)試劑。該膠乳凝集 法快速簡(jiǎn)單，但只是半定量，敏感性低，不適合大部分需要定量的臨床檢測(cè)。中國(guó)專利申請(qǐng) CN1769894公開了一種高敏C反應(yīng)蛋白測(cè)定試劑盒，包含試劑R — 1為結(jié)合有羊抗人C 一反 應(yīng)蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液，膠乳顆粒直徑為200 - 240nm，置于適當(dāng)?shù)木彌_液中；試劑 R - 2為結(jié)合有羊抗人C 一反應(yīng)蛋白抗體的苯乙烯膠乳溶液，膠乳顆粒直徑為30 - 70nm, 置于適當(dāng)?shù)木彌_液中。該膠乳凝集反應(yīng)法提高了靈敏度，可進(jìn)行低含量水平的測(cè)定。由于上述方法都需要特殊的儀器設(shè)備，故操作人員和環(huán)境有一定的要求，而且檢 測(cè)費(fèi)時(shí)，繁瑣，不利于廣泛普及。基于免疫層析法的CRP檢測(cè)試紙或檢測(cè)卡不需要特殊的儀 器設(shè)備，便于攜帶運(yùn)輸，操作簡(jiǎn)便，層析試劑比液體的檢測(cè)試劑容易保存。其中，比較適合于 臨床快速檢測(cè)且方法穩(wěn)定的是膠體金免疫層析技術(shù)，以其簡(jiǎn)便快速的優(yōu)勢(shì)在臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn) 中占據(jù)一席之地。中國(guó)實(shí)用新型專利CN201096787涉及一種C-反應(yīng)蛋白顏色顆粒診斷試 紙，通過利用快速免疫層析法，定性地檢測(cè)臨床標(biāo)本(全血/血清/血漿)中的CRP。該實(shí) 用新型是由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、顏色顆粒固定墊、樣品吸液層、MAX線組成，底板中 部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條C-反應(yīng)蛋白單克隆抗體試驗(yàn)線和一條羊抗鼠 多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩 端分別與吸水板與顏色顆粒固定墊相互交疊連接，在顏色顆粒固定墊上壓有樣品吸液層。 但是，該方法無法實(shí)現(xiàn)CRP的定量檢測(cè)。中國(guó)專利申請(qǐng)CN101320041《一種快速定量檢測(cè)C 一反應(yīng)蛋白的膠體金法及其應(yīng) 用》提供了一種膠體金免疫滲濾法來定量檢測(cè)CRP的方法。反應(yīng)原理為固相雙抗體夾心法
3的金標(biāo)免疫斑點(diǎn)滲濾試驗(yàn)，待測(cè)樣品經(jīng)40 - 480倍稀釋后與免疫膠體金在液相均質(zhì)介質(zhì) 中混和均勻，再轉(zhuǎn)加到反應(yīng)板上，其中所含的、已與免疫膠體金在一起的待測(cè)物能為膜上固 定的抗待測(cè)物另一決定簇的單抗或多抗特異性地捕獲，呈紅色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)色澤與樣品中CRP 濃度呈正比。但是，由于該專利所公開的檢測(cè)方法為膠體金免疫滲濾法，而非膠體金免疫層 析法，故配套的試劑盒需要由CRP金標(biāo)液凍干品、反應(yīng)板、樣品稀釋液、封閉液和塑料滴管 等組成，組分較多，造成檢測(cè)操作比較繁瑣。由于含有金標(biāo)液凍干品，該試劑須在檢測(cè)前室 溫平衡30分鐘，耗費(fèi)了等候檢測(cè)的時(shí)間，使檢測(cè)報(bào)告的及時(shí)性較差。此外，更為關(guān)鍵的是， 該試劑盒的檢測(cè)范圍相對(duì)有限，在檢測(cè)高濃度CRP樣品中容易出現(xiàn)HOOK效應(yīng)，必須將待測(cè) 樣品進(jìn)行僉適的稀釋，如其所公開的，稀釋40 - 480倍，但是，往往在初次檢測(cè)時(shí)，無法知道 究竟該稀釋多少倍，即在樣品的初始濃度無法知道的情況下，容易產(chǎn)生高濃度樣品稀釋倍 數(shù)不夠的情況，于是，檢測(cè)結(jié)果可能因?yàn)镠OOK效應(yīng)而偏低。這樣的缺陷使該方法在定量檢 測(cè)中的可靠性降低。常規(guī)CRP免疫層析定性檢測(cè)試紙由兩條線組成，沿樣品走向由下端至上端分別為 檢測(cè)線、質(zhì)控線。測(cè)定時(shí)，若檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色可判定為陽(yáng)性，若僅質(zhì)控線出現(xiàn)紅 色為陰性，質(zhì)控線不顯色則為無效。這樣布置的檢測(cè)試紙一般很難用于定性檢測(cè)，要在同類 的檢測(cè)試紙上實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，必須通過特殊的設(shè)計(jì)，才能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。_

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析法定量檢測(cè)試紙， 以克服現(xiàn)有的人C-反應(yīng)蛋白膠體金定量檢測(cè)技術(shù)試劑復(fù)雜、操作繁瑣、報(bào)告速度相對(duì)較慢 的缺陷。
技術(shù)方案
本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析法定量檢測(cè)試紙， 該檢測(cè)試紙包括依次在帶有粘合劑的底板上相互搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和 吸水紙，其中，所述的結(jié)合墊上涂有膠體金標(biāo)記的CRP抗體復(fù)合物，所述的硝酸纖維素膜上 結(jié)合有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述的檢測(cè)線和質(zhì)控線均為免疫抗體；檢測(cè)時(shí)，將待測(cè)樣品與所述 檢測(cè)試紙的下端接觸并沿試紙層析，若質(zhì)控線不顯色為無效，若只有質(zhì)控線顯色則表示CRP 濃度小于最低檢測(cè)濃度，若質(zhì)控線和定量線均出現(xiàn)紅色，則通過一種定量檢測(cè)裝置判讀CRP 的含量；其中，沿樣品層析方向由該檢測(cè)試紙的下端至上端分別為質(zhì)控線和定量線。上述的定量檢測(cè)試紙的優(yōu)選方式之一為，所述的膠體金標(biāo)記的CRP抗體復(fù)合物為 標(biāo)記膠體金顆粒的鼠抗CRP單克隆抗體。上述的定量檢測(cè)試紙的優(yōu)選方式之二為，所述的質(zhì)控線和定量線包被抗體為CRP 抗體。本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析法定量檢測(cè)試 劑盒，由包含上述的定量檢測(cè)試紙的檢測(cè)卡、樣品稀釋液和塑料滴管組成。上述的定量檢測(cè)試紙 以成為CRP檢測(cè)卡的一部分，所述的檢測(cè)卡由上述的定量檢測(cè)試紙和硬質(zhì)塑料卡組成。本發(fā)明的技術(shù)方案之三是提供一種人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析法定量檢測(cè)卡 的制備方法，依次包括以下步驟
(1)將鼠抗CRP單克隆抗體標(biāo)記于膠體金顆粒表面，低溫離心，用硼酸緩沖液重懸，離 心濃縮，獲得膠體金-CRP抗體復(fù)合物，冷藏保存；
(2)選用玻璃纖維素膜作為樣品墊材料，將其放入含BSA、蔗糖、PVP和吐溫的PBS樣品 墊處理液中浸泡，烘干備用；
(3)選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊材料，將上述的膠體金-CRP抗體復(fù)合物重新分散 于含蔗糖、BSA、PEG2000和吐溫的Tris緩沖稀釋液中，并噴于結(jié)合墊上烘干；
(4)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣用點(diǎn)膜儀在硝酸纖維素膜的不同位置噴點(diǎn)抗體，自下端至 上端依次為質(zhì)控線、定量線，烘干；
(5)組裝將吸水紙、硝酸纖維素膜、結(jié)合墊、樣品墊依次貼在帶有粘合劑的底板上，切 成試紙條，與硬質(zhì)塑料卡一起裝配成檢測(cè)卡。本發(fā)明的技術(shù)方案之四是提供一種人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析定量檢測(cè)方 法，依次包括如下步驟
(1)用上述的檢測(cè)試紙檢測(cè)系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，利用定量檢測(cè)裝置讀出檢測(cè)值和質(zhì) 控值之間的比值；
(2)將所述的比值對(duì)所述的標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)曲線輸入到定量檢測(cè) 裝置中；
(3)用上述的檢測(cè)試紙檢測(cè)含CRP的待測(cè)樣品，并利用定量檢測(cè)裝置中的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲 得所述待測(cè)樣品的CRP濃度值。本發(fā)明的技術(shù)方案之五是提供一種人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析定量檢測(cè)的專 用裝置，包括打印機(jī)、顯示屏、鍵盤、固定于儀器底板上的電路板和光學(xué)部件。本發(fā)明的技術(shù)方案之六是提供一種上述的人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析法定量 檢測(cè)試紙?jiān)跈z測(cè)人血清中的C-反應(yīng)蛋白中的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明的CRP定量檢測(cè)試紙可以應(yīng)用于如下幾方面中的CRP濃度測(cè) 定
1.感染的診斷和鑒別由于CRP在感染發(fā)生后6 8h即開始升高，24 48h達(dá)到高 峰，高峰值可達(dá)正常的數(shù)百倍，在感染消除后其含量急驟下降，一周內(nèi)可恢復(fù)正常。而CRP 在病毒感染時(shí)無顯著升高，這為疾病早期感染類型的鑒別提供了極其重要的依據(jù)。2.確定抗生素的療效CRP在確定抗生素的療效方面也發(fā)揮了作用。挪威的一個(gè) 研究小組對(duì)感染A型溶血性鏈球菌的11例咽炎確診病例進(jìn)行了抗生素治療，并同時(shí)記錄其 治療前、治療后l、2、3d的CRP水平、體溫和咽痛減輕程度等指標(biāo)。結(jié)果顯示，與治療前相比， 治療后的1、2、3天CRP分別下降34. 1%、60· 1%和75. 3%，并且，CRP降低的程度與癥狀的減 輕和治療后的天數(shù)明顯相關(guān)(P<0. 01)。3.與心血管疾病的關(guān)系低水平的CRP (0. 1 10mg/L)與心血管疾病的發(fā)生有 著密切的關(guān)系，是心血管炎癥病變的生物標(biāo)志物。這個(gè)水平的C反應(yīng)蛋白又被稱為較高的 超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)。個(gè)體的CRP基礎(chǔ)水平和未來心血管疾病的發(fā)病關(guān)系密切。CRP 可能是比低密度脂蛋白膽固醇更有效的獨(dú)立的心血管疾病預(yù)測(cè)指標(biāo)，可以增加血脂檢查、
5代謝綜合癥和Framingham危險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)后價(jià)值。4.病情的監(jiān)測(cè)CRP炎性疾病發(fā)作6h含量即迅速升高，持續(xù)時(shí)間與病程相當(dāng)，一 旦疾病恢復(fù)，CRP含量迅速下降，對(duì)臨床有一個(gè)先驅(qū)的預(yù)報(bào)作用。若CRP持續(xù)升高或再度回 升，提示必須予以重視。5.新生兒疾病的早期診斷和監(jiān)測(cè)有研究顯示hs-CRP在早期新生兒，尤其有異 常分娩史者進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，并觀察動(dòng)態(tài)變化，對(duì)新生兒疾病的早期診斷、判定療效有重要意 義。早產(chǎn)兒24h、72h的hsCRP均值有顯著性差異，足月兒也有類似變化，可能提示新生兒 72h的免疫功能與24h比較可能有了顯著變化，尤其在產(chǎn)生IL-6等因子方面。早產(chǎn)兒與足 月兒的CRP升高與感染明顯相關(guān)。故認(rèn)為新生兒出生3d內(nèi)測(cè)CRP仍有非常重要的意義。6.其他疾病血液系統(tǒng)惡性淋巴瘤(何杰金氏病得多)、白血病等；膠原病、過敏 性及自身免疫性疾病的活動(dòng)期(風(fēng)濕熱、SLE、類風(fēng)濕等)、傳染病、敗血病及其他惡性腫瘤。
有益效果
本發(fā)明提供一種CRP定量的檢測(cè)試紙，該檢測(cè)試紙的特征是沿樣品層析方向由下端至 上端分別為質(zhì)控線和定量線。檢測(cè)時(shí)，將待測(cè)樣品滴加到檢測(cè)卡的加樣孔中，若質(zhì)控線不顯 色為無效，若質(zhì)控線和定量線均出現(xiàn)紅色，通過定量檢測(cè)裝置，利用基于反射光度計(jì)原理的 光學(xué)生物傳感器和預(yù)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線直接判讀CRP的含量?，F(xiàn)有技術(shù)中的CRP定量檢測(cè)試紙 是通過膠體金免疫斑點(diǎn)法來實(shí)現(xiàn)的，該方法操作步驟相對(duì)繁瑣，試劑盒還需配套多種試劑， 檢測(cè)效率不高。本發(fā)明的檢測(cè)試紙的檢測(cè)方法屬于免疫層析干法，檢測(cè)時(shí)無需其他試劑，只 需直接將待測(cè)樣品按固定的倍數(shù)稀釋后取0. 05mL滴入加樣孔，十分鐘后即可出結(jié)果，操作 過程簡(jiǎn)單快捷，相比斑點(diǎn)法檢測(cè)試紙其檢測(cè)效率明顯提高。該檢測(cè)試紙可供醫(yī)院和個(gè)人進(jìn) 行定性、定量測(cè)定，其檢測(cè)范圍為5-200mg/mL，在實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，做出的曲線線性良好，R2 值可達(dá)0.99以上。定量檢測(cè)裝置讀出值和實(shí)際樣品的真實(shí)值之間誤差均在0.5%以內(nèi)，穩(wěn) 定性和特異性均良好，有效期可達(dá)一年以上。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)CN101320041的區(qū)別在于該文獻(xiàn)中用的是膠體金免疫滲 濾法，本發(fā)明用的是膠體金免疫層析法。目前尚未有膠體金免疫層析法定量檢測(cè)CRP的方 法。具體而言，該文獻(xiàn)檢測(cè)方法的配套試劑盒由CRP金標(biāo)液凍干品、反應(yīng)板、樣品稀釋液、封 閉液和塑料滴管等組成，組分較多，造成檢測(cè)操作繁瑣。而本發(fā)明配套的試劑盒只需要CRP 檢測(cè)卡、配套樣品稀釋液和塑料滴管，沒有其他復(fù)雜組分，這樣，檢測(cè)時(shí)要節(jié)省幾個(gè)步驟，所 以更加簡(jiǎn)單快捷。由于該文獻(xiàn)的方法中含有金標(biāo)液凍干品，須在檢測(cè)前室溫平衡30分鐘， 耗費(fèi)了等候檢測(cè)的時(shí)間，使檢測(cè)報(bào)告的及時(shí)性相對(duì)較差，本發(fā)明的檢測(cè)試紙沒有該缺陷。此 外，更為關(guān)鍵的是，該試劑盒的檢測(cè)范圍有限，在檢測(cè)高濃度CRP樣品中容易出現(xiàn)HOOK效 應(yīng)，必須將待測(cè)樣品進(jìn)行僉適的稀釋，如其所公開的，稀釋40 - 480倍，但是，往往在初次檢 測(cè)時(shí)，無法知道究竟該稀釋多少倍，即在樣品的初始濃度無法知道的情況下，容易產(chǎn)生高濃 度樣品稀釋倍數(shù)不夠的情況，于是，檢測(cè)結(jié)果可能因?yàn)镠OOK效應(yīng)而偏低。這樣的缺陷使該 方法在定量檢測(cè)中的可靠性降低，而本發(fā)明的檢測(cè)試紙可適用于高濃度的樣品而無需預(yù)先 確定稀釋倍數(shù)，檢測(cè)樣品直接按固定比例稀釋后，檢測(cè)范圍更寬。本檢測(cè)試紙適用于配套的 定量檢測(cè)裝置，輕巧便攜、靈敏度高、穩(wěn)定性好且可輸出檢測(cè)結(jié)果，使該項(xiàng)檢測(cè)操作簡(jiǎn)單快 捷、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、易于記錄保存。
在本說明書中，除非有其他說明，各個(gè)優(yōu)選技術(shù)方案和更優(yōu)選技術(shù)方案的技術(shù)特 征可以相互組合形成新的技術(shù)方案。為了簡(jiǎn)要目的，申請(qǐng)人在說明書中省略了這些組合的 具體描述，然而，所有這些技術(shù)特征組合后的技術(shù)方案均應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為以明確的方式書面記 載于本說明書中。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如膠體金檢測(cè)試 劑操作手冊(cè)，或按照制造廠商所建議的條件。本發(fā)明所述的“定量檢測(cè)裝置”為利用反射分 光光度計(jì)原理在膠體金顯色的相應(yīng)光譜上對(duì)光強(qiáng)度進(jìn)行記錄的裝置，優(yōu)選地，該裝置還可 以配備計(jì)算程序?qū)z測(cè)值(T)和對(duì)照值(C)的比值進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算和記錄，并且按照輸入或 設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)檢測(cè)值所對(duì)應(yīng)的CRP濃度進(jìn)行直接判讀。
實(shí)施例1
膠體金-CRP抗體復(fù)合物的制備
將鼠抗CRP單克隆抗體標(biāo)記于制備好的20nm膠體金顆粒表面，低溫離心，用硼酸緩沖 液重懸至原體積，再次離心濃縮至原體積的1/10，4°C保存。 實(shí)施例2
人C-反應(yīng)蛋白(CRP)免疫層析檢測(cè)卡的制備
(1)樣品墊的制備選用玻璃纖維素膜作為樣品墊材料，將其放入樣品墊處理液(PBS， 含BSA，蔗糖，PVP，吐溫)中浸泡，37 °C烘干備用。(2)結(jié)合墊的制備選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊材料，將上述制備的膠體 金-CRP抗體復(fù)合物重新分散于膠體金稀釋液(Tris緩沖溶液，含蔗糖，BSA, PEG20000，吐 溫)中，并噴于結(jié)合墊上，37°C烘干。(3)硝酸纖維素膜(NC膜)的點(diǎn)樣用點(diǎn)膜儀在NC膜的不同位置噴點(diǎn)相應(yīng)的抗體， 自下端至上端依次為質(zhì)控線、定量線，37 °C烘干。(4)組裝將吸水紙、NC膜、結(jié)合墊、樣品墊依次貼在帶有粘合劑的底板上，并切成 4cm寬的試紙條，裝配成品檢測(cè)卡。 實(shí)施例3
人CRP血清的定量檢測(cè)
(1)將CRP抗原標(biāo)準(zhǔn)品用正常人血清作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品0mg/mL，5mg/ mL，10mg/mL，20mg/mL，30mg/mL，50mg/mL，80mg/mL，100mg/mL，120mg/mL，160mg/mL，200mg/ mL0
7
(2)將如上各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品按固定比例稀釋，取0. 05mL滴加到檢測(cè)卡的加樣孔 中，IOmin后通過定量檢測(cè)裝置讀出定量線與質(zhì)控線信號(hào)強(qiáng)度的比值，即T/C值(每個(gè)樣品 分別用3個(gè)檢測(cè)卡測(cè)定3次，取平均值)，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)利用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)臨床樣品，將繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=ax+b中的a，b值輸入 定量檢測(cè)裝置即可在測(cè)定實(shí)際樣品時(shí)直接得出實(shí)際樣品中CRP的含量。
實(shí)施例4
臨床CRP樣品的定量檢測(cè)
(1)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)備取若干個(gè)濃度的含CRP人血清作為標(biāo)準(zhǔn)抗原，并保證各濃度 在監(jiān)測(cè)范圍內(nèi)有梯度的均勻分布。用上述CRP金標(biāo)檢測(cè)卡分別檢測(cè)各個(gè)濃度的血清抗原， 用配套定量檢測(cè)裝置分別檢測(cè)每個(gè)濃度的檢測(cè)卡的T/C值，各檢測(cè)三次。將檢測(cè)的三組T/ C值分別取平均值，以所述血清樣品的濃度對(duì)T/C平均值做圖，得到一個(gè)曲線。結(jié)果顯示，利 用本發(fā)明的檢測(cè)卡所制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，在監(jiān)測(cè)范圍內(nèi)沒有出現(xiàn)HOOK效應(yīng)。R2達(dá)到 0. 99以上。(2)利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)臨床CRP血清樣品進(jìn)行定量檢測(cè)用上述檢測(cè)卡檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)抗 原，用定量檢測(cè)裝置讀出T/C值。將所得結(jié)果繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的a，b值。將a， b值輸入到定量檢測(cè)裝置中。取150份含CRP人血清臨床抗原樣品并使其濃度在5-200mg/ mL范圍之內(nèi)。用定量檢測(cè)裝置分別檢測(cè)各個(gè)濃度的樣品，記錄定量檢測(cè)裝置給出的CRP濃 度數(shù)值。將定量檢測(cè)裝置得到的CRP濃度值跟標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度值進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示兩組 數(shù)值相互一致。用SPSS13.0對(duì)兩組數(shù)值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果為兩組數(shù)值無明顯差異。對(duì) 兩組濃度數(shù)值進(jìn)行誤差分析，獲得了實(shí)測(cè)濃度和實(shí)際濃度的誤差均在0. 5%以內(nèi)的結(jié)果。(3)檢測(cè)卡穩(wěn)定性測(cè)試將制備好的檢測(cè)卡放在37°C環(huán)境中進(jìn)行加速試驗(yàn)。7天 后取出檢測(cè)卡，并用其檢測(cè)實(shí)際樣品中CRP的濃度。對(duì)實(shí)測(cè)濃度和實(shí)際樣品濃度數(shù)值進(jìn)行 誤差分析，得到CV值在5%以內(nèi)的結(jié)果。
權(quán)利要求
一種人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析法定量檢測(cè)試紙，該檢測(cè)試紙包括依次在帶有粘合劑的底板上相互搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，其中，所述的結(jié)合墊上涂有膠體金標(biāo)記的CRP抗體復(fù)合物，所述的硝酸纖維素膜上結(jié)合有定量線和質(zhì)控線，所述的定量線和質(zhì)控線是用CRP抗體包被的；檢測(cè)時(shí)，將待測(cè)樣品與所述檢測(cè)試紙的下端接觸并沿試紙層析，若質(zhì)控線不顯色為無效，若只有質(zhì)控線顯色則表示CRP濃度小于最低檢測(cè)濃度，若質(zhì)控線和定量線均出現(xiàn)紅色，則通過一種定量檢測(cè)裝置判讀CRP的含量；其特征在于，沿樣品層析方向由該檢測(cè)試紙的下端至上端分別為質(zhì)控線和定量線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)試紙，其特征在于，所述的膠體金標(biāo)記的CRP抗體復(fù) 合物為標(biāo)記膠體金顆粒的鼠抗人CRP單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測(cè)試紙，其特征在于，所述的包被抗體為CRP抗體。
4.一種人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析法定量檢測(cè)試劑盒，由包含權(quán)利要求1所述的定 量檢測(cè)試紙的檢測(cè)卡、樣品稀釋液和塑料滴管組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測(cè)卡由權(quán)利要求1所述的定量 檢測(cè)試紙和硬質(zhì)塑料卡組成。
6.一種人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析法定量檢測(cè)卡的制備方法，依次包括以下步驟(1)將鼠抗人CRP單克隆抗體標(biāo)記于膠體金顆粒表面，低溫離心，用硼酸緩沖液重懸， 離心濃縮，獲得膠體金-CRP抗體復(fù)合物，冷藏保存；(2)選用玻璃纖維素膜作為樣品墊材料，將其放入含BSA、蔗糖、PVP和吐溫的PBS樣品 墊處理液中浸泡，烘干備用；(3)選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊材料，將上述的膠體金-CRP抗體復(fù)合物重新分散于 含蔗糖、BSA、PEG2000和吐溫的Tris緩沖稀釋液中，并噴于結(jié)合墊上烘干；(4)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣用點(diǎn)膜儀在硝酸纖維素膜的不同位置噴點(diǎn)抗體，自下端至上 端依次為質(zhì)控線、定量線，烘干；(5)組裝將吸水紙、硝酸纖維素膜、結(jié)合墊、樣品墊依次貼在帶有粘合劑的底板上，切 成試紙條，與硬質(zhì)塑料卡一起裝配成檢測(cè)卡。
7.—種人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析定量檢測(cè)方法，依次包括如下步驟(1)用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試紙檢測(cè)系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，利用定量檢測(cè)裝置讀出 檢測(cè)值和質(zhì)控值之間的比值；(2)將所述的比值對(duì)所述的標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)曲線輸入到定量檢測(cè) 裝置中；(3)用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試紙檢測(cè)含CRP的待測(cè)樣品，并利用定量檢測(cè)裝置中的標(biāo) 準(zhǔn)曲線獲得所述待測(cè)樣品的CRP濃度值。
8.—種人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析定量檢測(cè)的專用裝置，包括打印機(jī)、顯示屏、鍵 盤、固定于儀器底板上的電路板和光學(xué)部件。
9.權(quán)利要求1所述的人C-反應(yīng)蛋白膠體金免疫層析法定量檢測(cè)試紙?jiān)跈z測(cè)人血清中 C-反應(yīng)蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人C-反應(yīng)蛋白(CRP)膠體金免疫層析法定量檢測(cè)試紙，包括依次在帶有粘合劑的底板上相互搭接的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，其中，所述的結(jié)合墊上涂有膠體金標(biāo)記的CRP抗體復(fù)合物，所述的硝酸纖維素膜上結(jié)合有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述的檢測(cè)線和質(zhì)控線為抗體包被線；檢測(cè)時(shí)，將待測(cè)樣品與所述檢測(cè)試紙的下端接觸并沿試紙層析，若質(zhì)控線和定量線不顯色為無效，若只有質(zhì)控線顯色則表示CRP濃度小于最低檢測(cè)濃度，若質(zhì)控線和定量線均出現(xiàn)紅色，則通過一種定量檢測(cè)裝置判讀CRP的含量；其特征在于，沿樣品層析方向由該檢測(cè)試紙的下端至上端分別為質(zhì)控線和定量線。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101887063SQ20101023607
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者沈鶴柏, 邢國(guó)杰 申請(qǐng)人:沈鶴柏