專利名稱：基于熒光圖像的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的篩選方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗腫瘤藥物篩選與評價方法領(lǐng)域，涉及應(yīng)用熒光探針特異性標記細 胞、細胞顯微圖像自動獲取、熒光圖像識別及數(shù)據(jù)生成，通過分析圖像信息來獲取藥物抑制 腫瘤細胞遷移的相關(guān)指標并用于藥物(化學(xué)合成藥物和天然產(chǎn)物)抗腫瘤細胞遷移作用的 篩選和評價，對于新的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。
背景技術(shù)：
腫瘤已成為人類面臨的一大殺手，死亡率僅次于心血管疾病，而且呈逐年上升的 趨勢。目前腫瘤治療主要以抑制腫瘤細胞的增值為靶點，但有相當一部分腫瘤細胞對于這 種類型的化療藥物并不敏感，并且這些活性化合物多數(shù)是作用于核酸的合成和功能，對正 常組織有較大損傷，易出現(xiàn)惡心，嘔吐等副作用。侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤最基本的生物學(xué)特征， 也是引起腫瘤患者死亡的主要原因，因腫瘤死亡的患者中約有90%是腫瘤轉(zhuǎn)移引起的。腫 瘤細胞的定向遷移是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟。因此，尋找有效的抗腫瘤細胞遷移活性 物質(zhì)對于發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤藥物至關(guān)重要。近年來，基于熒光染色技術(shù)的檢測分析方法是應(yīng)用于藥物高通量、高內(nèi)涵篩選的 重要方法之一。熒光顯微系統(tǒng)的應(yīng)用解決了普通顯微鏡對細胞、細胞器的形態(tài)和活力方面 相對微弱的改變難以觀察的問題，被應(yīng)用于藥物研究的多個方面，如藥物細胞毒測定和藥 物相互作用研究等。但目前基于熒光成像技術(shù)，以腫瘤細胞遷移，侵襲為靶點的抗腫瘤轉(zhuǎn)移 藥物高通量篩選還未見報道。目前，體外測定藥物抗腫瘤細胞遷移能力常用的方法有兩種一種是劃痕法，另 一種是Boyden Chamber或Transwel 1小室法。劃痕法是通過測量創(chuàng)傷邊界的縮窄率和 計數(shù)遷移經(jīng)過初始創(chuàng)傷邊界的細胞，從而對細胞遷移進行量化表征；Boyden Chamber或 Transwell小室法是通過計數(shù)穿過微孔膜的細胞數(shù)量來量化表征細胞遷移。這些方法都是 以細胞計數(shù)作為細胞遷移能力的判斷指標，將所有區(qū)域的細胞進行計數(shù)是非常費時的，但 若僅對一些隨機視野的細胞進行計數(shù)，又會導(dǎo)致結(jié)果不可靠。因此，這些方法都存在通量低 (一塊板只有12個小室)，試劑和藥物消耗量大，實驗結(jié)果易受主觀因素影響的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于熒光圖像的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物評價和篩選方法，是運 用一套篩選和評價硬件系統(tǒng)、圖像采集控制系統(tǒng)和圖像拼接識別系統(tǒng)，通過熒光染料標記 發(fā)生遷移的腫瘤細胞，測量各藥物作用下遷移細胞數(shù)變化來實現(xiàn)對抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的評價 和篩選。該篩選和評價系統(tǒng)主要由控制系統(tǒng)控制高精度可控電動平臺按預(yù)設(shè)參數(shù)精確走 位，由相應(yīng)濾光片過濾得到的激發(fā)光對熒光染料標記后的細胞進行激發(fā)產(chǎn)生熒光，再通過 內(nèi)制冷高分辨率CXD實時采集圖像并同步上傳至電腦，所得圖像通過拼接和識別系統(tǒng)處理 后，將生物信息可視化，并提供相應(yīng)熒光參數(shù)用于抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的評價。硬件系統(tǒng)由熒光 成像系統(tǒng)(包括熒光倒置顯微鏡、包括汞燈控制器、手動操縱桿和調(diào)節(jié)螺旋)、高精度可控電動平臺(包括高精度可控電動平臺和平臺控制器)、高分辨率CCD和電腦組成。具體通過以下步驟實現(xiàn)(I)Hoechst 33342染色法定量細胞數(shù)Hoechst 33342是一種DNA特異性熒光染料，能穿透細胞膜并對細胞沒有太大毒 性，它在細胞中與DNA中的A-T序列富集區(qū)結(jié)合，結(jié)合后能發(fā)出藍色熒光。Hoechst 33342 常用于細胞凋亡檢測和普通的細胞核染色。因此可以通過Hoechst 33342標記細胞來計數(shù) 細胞數(shù)。(a)準確稱取Hoechst 333421mg溶于0. Iml的二甲亞砜(DMSO)中配成濃度為 10mg/ml的儲備液，分裝于0. 5ml離心管中，置于_20°C儲存。臨用前，用PBS稀釋儲備液至 所需濃度。(b)Hoechst 33342染色定量細胞數(shù)法線性范圍取對數(shù)生長期的EAhy926細胞，0. 25%胰酶消化，離心收集細胞，按40000，30000， 20000，10000，5000，3000，1000個/孔(η = 3)的密度梯度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。置于
細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h使貼壁，取出后用H0echst33342溶液(10 μ g/ml溶于PBS中) 對腫瘤細胞進行熒光標記，ΙΟΟμ 1/孔，37°C孵育15min。PBS洗兩遍，吸凈殘余液體。用篩 選系統(tǒng)采集熒光圖片，拍攝參數(shù)為藍色熒光濾光片，曝光時間1200ms，物鏡放大倍數(shù)2.5 倍，每孔攝取6幅圖像。所得圖像經(jīng)熒光圖像拼接、識別系統(tǒng)處理并統(tǒng)計熒光強度等參數(shù)。 以每孔統(tǒng)計得到的熒光強度等指標間接反映每孔的細胞數(shù)，并繪制細胞數(shù)與熒光強度的量 效曲線來確定本方法的線性范圍。(2)基于熒光圖像篩選具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的藥物取對數(shù)生長期的EAhy926細胞，0. 25%胰酶消化后，離心收集細胞，懸浮于無血清 培養(yǎng)基(4 XlOVml)中，接種于96孔Transwell板的上室，50μ 1/孔，下室均加入150μ 1完 全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)一定時間，這個時間可以根據(jù)所用細胞系和接種細胞數(shù)的不同進行選 擇。待篩選組分及陽性藥物在種板同時按實驗設(shè)計終濃度加入上室細胞懸液中。遷移完成 后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用H0echst33342溶液(10 μ g/ml溶于PBS中)對腫瘤細胞進行熒光標 記，150 μ 1/孔，37°C孵育15min。小心擦除微孔膜上層的細胞，上下室均用PBS洗兩遍，吸 凈殘余液體。用篩選系統(tǒng)采集熒光圖片，拍攝參數(shù)為藍色熒光濾光片，曝光時間1200ms， 物鏡放大倍數(shù)2. 5倍。然后使用熒光圖像拼接、識別系統(tǒng)處理圖片并統(tǒng)計熒光強度等參數(shù) 以確定每孔的遷移細胞數(shù)。以藥物的遷移抑制率對藥物濃度作線性回歸，得直線方程，從中 求出抑制半數(shù)腫瘤細胞遷移的化合物濃度(IC5tl)，對腫瘤細胞的遷移抑制率大于50%的藥 物，進一步進行量效關(guān)系研究，計算其抑制腫瘤細胞遷移的IC5tl值，并與陽性對照做比較從 而評估其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的活性。計算公式為藥物對腫瘤細胞的遷移抑制率(％ ) = (1-Fm/Fc) X 100其中Fm為加藥組的熒光強度，F(xiàn)c為對照組的熒光強度。本發(fā)明的篩選和評價硬件系統(tǒng)主要由熒光成像系統(tǒng)(包括熒光倒置顯微鏡、包括 汞燈控制器、手動操縱桿和調(diào)節(jié)螺旋)、高精度可控電動平臺(包括高精度可控電動平臺和 平臺控制器)、高分辨率CCD和電腦組成，其各部分的主要功能分別為(1)熒光成像系統(tǒng)主要部分為熒光倒置顯微鏡，用于放大經(jīng)熒光標記的細胞，達到觀測和成像要求；(2)高精度可控電動平臺能在X-Y兩個方向內(nèi)精確移動，將測定樣本送至顯微鏡 觀測處，并按預(yù)設(shè)程序精確走位；(3)高分辨率CXD用于獲得待測樣本的顯微熒光圖像，并傳送至電腦；(4)電腦用于存儲熒光圖片。本發(fā)明的圖像采集控制系統(tǒng)和圖像拼接識別系統(tǒng)的功能分別為(1)圖像采集控制系統(tǒng)能控制高精度電動平臺按照預(yù)設(shè)參數(shù)進行精確走位；(2)圖像拼接識別系統(tǒng)能夠?qū)Σ杉降臒晒鈭D像進行拼接以得到整孔細胞圖像， 進而識別、統(tǒng)計熒光強度等熒光參數(shù)，輸出報表。本發(fā)明的另一個目的是提供所述方法在基于熒光圖像的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的篩選 中應(yīng)用。本發(fā)明的方法中，使得至少一種具有靶細胞器的腫瘤細胞的至少一種細胞參數(shù)在 藥物存在或不存在時得以通過熒光測量結(jié)果的差異來表征。這些方法可以用于細胞系或原 代細胞。本發(fā)明的有益之處是本發(fā)明能夠在活細胞內(nèi)通過標記靶標或靶細胞器來定量遷 移的細胞數(shù)從而對藥物對腫瘤細胞的遷移抑制作用進行評價。本發(fā)明提供的篩選方法對全 孔細胞進行拍照和統(tǒng)計，克服了傳統(tǒng)方法(依賴于人工計數(shù))通量低(一塊板只有12個小 室)、試劑和藥物消耗量大、實驗結(jié)果易受主觀因素影響的缺點。顯著提高了篩選效率、縮短 了篩選時間，同時具有準確、重現(xiàn)性好和自動化程度高的特點。本發(fā)明設(shè)計合理，提供的篩選和評價系統(tǒng)效率高、結(jié)構(gòu)完善，具有很高的應(yīng)用價 值，能夠用于大規(guī)模組合化學(xué)庫或天然產(chǎn)物庫的篩選，填補了國內(nèi)同類設(shè)備的技術(shù)空白，而 且設(shè)備簡單、經(jīng)濟，適合于國內(nèi)在早期開展對于腫瘤轉(zhuǎn)移治療藥物(包括化學(xué)合成藥以及 天然產(chǎn)物)的篩選和先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤治療藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。


圖1基于熒光圖像的藥物篩選系統(tǒng)整體構(gòu)架示意圖。圖2線性范圍。圖3陽性組與對照組熒光圖片及灰度圖。圖4紫杉醇抗腫瘤細胞遷移量效關(guān)系。
具體實施例方式結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容及效果，該實施例僅用于說明本 發(fā)明而非對本發(fā)明的限制。試劑DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基；胎牛血清(FBS)；硫酸鏈霉素，青霉素鈉；紫杉醇(Paclitaxel)；Hoechst 33342 ；
二甲基亞砜(DMSO)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器Leica DMI 6000B 熒光倒置顯微鏡、DFC 3IOFX CCD 德國 Leica 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱Thermo Forma Series II Water Jacketed C02Incubator ；SB-840-2型單人雙面超凈工作臺上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。實施例1 Hoechst 33342染色定量細胞數(shù)法a)篩選硬件系統(tǒng)本發(fā)明的篩選體系的硬件系統(tǒng)參見圖1，主要包括熒光倒置顯微鏡(包括熒光倒 置顯微鏡、包括汞燈控制器、手動操縱桿和調(diào)節(jié)螺旋)、高精度可控電動平臺(包括高精度 可控電動平臺和平臺控制器)、高分辨率CCD和電腦；b)Hoechst 33342染色定量細胞數(shù)法線性范圍取對數(shù)生長期的EAhy926細胞，0. 25%胰酶消化，離心收集細胞，按40000，30000， 20000，10000，5000，3000，1000個/孔(η = 3)的密度梯度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。置于 細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h使貼壁，取出后用H0echst33342溶液(10 μ g/ml溶于PBS中) 對腫瘤細胞進行熒光標記，100μ 1/孔，37°C孵育15min。PBS洗兩遍，吸凈殘余液體。用篩 選系統(tǒng)采集熒光圖片，拍攝參數(shù)為藍色熒光濾光片，曝光時間1200ms，物鏡放大倍數(shù)2.5 倍，每孔攝取6幅圖像。所得圖像經(jīng)熒光圖像拼接、識別系統(tǒng)處理并統(tǒng)計熒光強度等參數(shù)。 通過繪制細胞數(shù)與熒光強度的量效曲線確定本方法的線性范圍。c)結(jié)果在熒光顯微鏡下攝取不同細胞密度的孔的圖像(每孔6張)。使用熒光圖像拼接 系統(tǒng)將每孔攝取的6張局部視野圖片拼接成全孔圖片，再用熒光圖像識別系統(tǒng)統(tǒng)計其熒光 強度。參見圖2，當接種細胞密度在0 6X IO4個/孔的范圍內(nèi)時，熒光強度與每孔接種細 胞數(shù)線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r = 0. 9756。實施例2基于熒光圖像篩選具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的藥物(1)試驗方法取對數(shù)生長期的EAhy926細胞，0. 25%胰酶消化，離心收集細胞，懸浮于無血清培 養(yǎng)基(4 X105/ml)中，接種于96孔Transwell板的上室，50μ 1/孔，下室加入150μ 1含10% FBS的培養(yǎng)基，37°C，5% CO2，常規(guī)培養(yǎng)16h。陽性藥物(紫杉醇)在種板同時按實驗設(shè)計終 濃度加入上室細胞懸液中，并以未加藥的細胞懸液作為陰性對照。遷移完成后，用Hoechst 33342溶液(10 μ g/ml溶于PBS中)替換下室的培養(yǎng)液對細胞進行熒光標記，150 μ 1/孔， 37°C孵育15min。小心擦除微孔膜上層的細胞，上下室均用PBS洗兩遍，吸凈殘余液體后立 即在顯微鏡下掃描。熒光拍攝參數(shù)為藍色熒光濾光片(激發(fā)光320-400nm、發(fā)射光400nm)， 曝光時間1200ms，物鏡放大倍數(shù)2. 5倍。掃描所得圖像經(jīng)熒光圖像拼接、識別處理并統(tǒng)計熒 光強度。按照以下公式計算藥物對腫瘤細胞的遷移抑制率藥物對腫瘤細胞的遷移抑制率(％ ) = (1-Fm/Fc) X 100其中Fm為加藥組的熒光強度，F(xiàn)c為對照組的熒光強度。(2)結(jié)果在熒光顯微鏡下分別攝取陰性對照孔和陽性對照孔的圖像(每孔6張)。使用熒光圖像拼接系統(tǒng)將每孔攝取的6張局部視野圖片拼接成全孔圖片參見圖3，再用熒光圖像 識別系統(tǒng)統(tǒng)計其熒光強度，其中陰性對照孔熒光強度為10002362，陽性對照孔熒光強度為 3700639。計算所得加藥孔藥物對EAhy926細胞的遷移抑制率為63. 0%。實施例3篩選系統(tǒng)用于紫杉醇抗腫瘤細胞遷移作用的評價(1)實驗方法取對數(shù)生長期的EAhy926細胞，0. 25%胰酶消化，離心收集細胞，重懸在無血清培 養(yǎng)基(4X105/ml)中，接種于96孔Transwell板上室，50μ1/孔(η = 3)。用已知具有抗 腫瘤細胞遷移活性的化合物紫杉醇為陽性對照，種板同時加入上室細胞懸液中，濃度分別 取1、0. 5,0. 25,0. 125以及0. 0625ηΜ,同時以不加紫杉醇的細胞懸液為陰性對照，下室均加 入150 μ 1完全培養(yǎng)基。置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)16h。遷移結(jié)束后用Hoechst 33342溶 液(10 μ g/ml溶于PBS中)替換下室的培養(yǎng)液對細胞進行熒光標記，150 μ 1/孔，37°C孵育 15min。小心擦除膜上層的細胞，上下室均用PBS洗兩遍，吸凈殘余液體后立即在顯微鏡下 掃描。所得圖像經(jīng)過熒光圖像拼接、識別系統(tǒng)處理并進行統(tǒng)計。以遷移抑制率對紫杉醇濃 度作線性回歸，得直線方程，從中求出抑制半數(shù)腫瘤細胞遷移的化合物濃度(IC5tl)。計算公 式為紫杉醇對腫瘤細胞的遷移抑制率(％ ) = (1-Fm/Fc) X 100其中Fm為加藥組的熒光強度，F(xiàn)c為對照組的熒光強度。(2)結(jié)果參見圖4，臨床使用的抗腫瘤藥紫杉醇對于腫瘤細胞EAhy926的遷移有抑制作用， 在0.0625 InM范圍內(nèi)抑制作用呈濃度依賴性。以遷移抑制率對紫杉醇濃度作線性回歸， 得直線方程，計算得到IC5tl為0. 717nM。實驗結(jié)果表明，應(yīng)用本方法夠準確定量待篩選藥物的遷移抑制率，從而預(yù)測和評 價藥物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，為腫瘤轉(zhuǎn)移治療藥物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
一種基于熒光圖像的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物評價和篩選方法，其特征在于，包括由熒光成像系統(tǒng)、高精度可控電動平臺、高分辨率CCD和電腦組成的硬件系統(tǒng)，通過熒光染料標記發(fā)生遷移的腫瘤細胞，測量各藥物作用下遷移細胞數(shù)變化來實現(xiàn)，具體通過以下步驟實現(xiàn)(1)Hoechst 33342染色法定量細胞數(shù)(a)準確稱取Hoechst 333421mg溶于0.1ml的二甲亞砜中配成濃度為10mg/ml的儲備液，分裝于0.5ml離心管中，置于 20℃儲存，臨用前，用PBS稀釋儲備液至所需濃度，(b)Hoechst 33342染色定量細胞數(shù)法線性范圍取對數(shù)生長期的EAhy926細胞，0.25％胰酶消化，離心收集細胞，按40000，30000，20000，10000，5000，3000，1000個/孔(n＝3)的密度梯度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h使貼壁，取出后用Hoechst33342溶液(10μg/ml PBS中)對腫瘤細胞進行熒光標記，100μl/孔，37℃孵育15min，PBS洗兩遍，吸凈殘余液體，用評價和篩選的硬件系統(tǒng)采集熒光圖片，拍攝參數(shù)為藍色熒光濾光片，曝光時間1200ms，物鏡放大倍數(shù)2.5倍，每孔攝取6幅圖像，所得圖像經(jīng)熒光圖像拼接、識別軟件處理并統(tǒng)計熒光強度等參數(shù)，以每孔統(tǒng)計得到的熒光強度等指標間接反映每孔的細胞數(shù)，通過繪制細胞數(shù)與熒光強度的量效曲線確定線性范圍；(2)基于熒光圖像篩選具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的藥物取對數(shù)生長期的EAhy926細胞，0.25％胰酶消化后，離心收集細胞，懸浮于4×105/ml的無血清培養(yǎng)基中，接種于96孔Transwell板的上室，50μl/孔，下室均加入150μl完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)，待篩選組分及陽性藥物在種板同時按實驗設(shè)計終濃度加入上室細胞懸液中，遷移完成后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用Hoechst 33342溶液(10μg/ml溶于PBS中)對腫瘤細胞進行熒光標記，150μl/孔，37℃孵育15min，小心擦除微孔膜上層的細胞，上下室均用PBS洗兩遍，吸凈殘余液體，用評價和篩選的硬件系統(tǒng)采集熒光圖片，拍攝參數(shù)為藍色熒光濾光片，曝光時間1200ms，物鏡放大倍數(shù)2.5倍，然后使用熒光圖像拼接、識別軟件處理圖片并統(tǒng)計熒光強度等參數(shù)，以藥物的遷移抑制率對藥物濃度作線性回歸，得直線方程，從中求出抑制半數(shù)腫瘤細胞遷移的化合物濃度(IC50)，對腫瘤細胞的遷移抑制率大于50％的藥物，計算其抑制腫瘤細胞遷移的IC50值，并與陽性對照做比較從而評估其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的活性，計算公式為藥物對腫瘤細胞的遷移抑制率(％)＝(1 Fm/Fc)×100其中Fm為加藥組的熒光強度，F(xiàn)c為對照組的熒光強度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熒光圖像的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物評價和篩選方法，其特 征在于，熒光成像系統(tǒng)主要部分為具有放大經(jīng)熒光標記的細胞的熒光倒置顯微鏡。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熒光圖像的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物評價和篩選方法，其特 征在于，步驟(b)所用的是10 μ g/ml PBS的Hoechst 33342溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熒光圖像的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物評價和篩選方法在抗 腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于熒光圖像的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物評價和篩選方法，是運用一套篩選和評價硬件系統(tǒng)、圖像采集控制系統(tǒng)和圖像拼接識別系統(tǒng)，通過熒光染料標記發(fā)生遷移的腫瘤細胞，測量各藥物作用下遷移細胞數(shù)變化來實現(xiàn)對抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的評價和篩選。該篩選和評價系統(tǒng)主要由控制系統(tǒng)控制高精度可控電動平臺按預(yù)設(shè)參數(shù)精確走位，由相應(yīng)濾光片過濾得到的激發(fā)光對熒光染料標記后的細胞進行激發(fā)產(chǎn)生熒光，再通過內(nèi)制冷高分辨率CCD實時采集圖像并同步上傳至電腦，所得圖像通過拼接和識別系統(tǒng)處理后，將生物信息可視化，并提供相應(yīng)熒光參數(shù)用于抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的評價和篩選，具有篩選效率高、時間短、準確、重現(xiàn)性好和自動化程度高的特點。
文檔編號G01N15/10GK101923037SQ20101023789
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者王毅, 程翼宇, 趙筱萍 申請人:浙江大學(xué)