專利名稱：魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙及其制備方法，其屬于免疫學(xué)和病毒 學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus, LCDV)，隸屬虹彩病毒科 (Iridoviridae)，淋巴囊腫病毒屬(Lymphocystivirus)，可引起世界各地的34科140種以 上的淡水、半咸水和海水魚(yú)類發(fā)生淋巴囊腫病。1997年魚(yú)類淋巴囊腫病在我國(guó)山東牙鲆養(yǎng) 殖場(chǎng)首次大規(guī)模暴發(fā)，隨后在河北、廣東、浙江等地均發(fā)生過(guò)，其感染率可高達(dá)80%，死亡率 可達(dá)30%，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。患病魚(yú)的表皮、鰭、鰓和尾部等處出現(xiàn)大小 不一的囊腫物，一旦淋巴囊腫細(xì)胞破裂，病毒粒子釋放出來(lái)，可引起全身性感染，還易形成 開(kāi)放式潰瘍面，導(dǎo)致寄生蟲(chóng)、細(xì)菌等其他病原體的繼發(fā)性感染。與其他的病毒病一樣，魚(yú)類 淋巴囊腫病缺乏有效的治療藥物。因此，養(yǎng)殖生產(chǎn)中急需IXDV的快速檢測(cè)技術(shù)，以期達(dá)到 早發(fā)現(xiàn)早預(yù)防的目的。目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)魚(yú)類IXDV的方法大致包括組織病理及透射電鏡觀察、細(xì)胞培養(yǎng) 法、免疫熒光技術(shù)、斑點(diǎn)免疫印跡技術(shù)、PCR法及核酸雜交法等。這些方法操作較復(fù)雜且耗 時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)技術(shù)人員要求較高，需要一定的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備，不適用在基層養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢 測(cè)，因此研制一種簡(jiǎn)便快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)魚(yú)類LCDV的方法勢(shì)在必行。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙。本發(fā)明提供的魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙，包括載體板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖 維素膜檢測(cè)層和吸水墊，所述樣品墊和吸水墊位于載體板的兩端，硝酸纖維素膜檢測(cè)層位 于載體板的中部，其特征在于樣品墊與硝酸纖維素膜檢測(cè)層交界處設(shè)有載有金標(biāo)單抗A的 結(jié)合墊，結(jié)合墊一端邊緣重疊在樣品墊之下，另一端邊緣重疊在硝酸纖維素膜檢測(cè)層之上； 硝酸纖維素膜檢測(cè)層上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線靠近樣品墊包被有單抗B，質(zhì)控線靠近 吸水墊包被有羊抗小鼠IgG。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的制備方法。本發(fā)明提供的魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的制備方法如下(1)單抗A和單抗B 的制備復(fù)蘇并培養(yǎng)保藏號(hào)為CCTCC-C200419和CCTCC-C200420的雜交瘤細(xì)胞株，腹腔注射 BALB/c小鼠，采集腹水，辛酸_硫酸銨法提純獲得單抗A和單抗B。(2)結(jié)合墊的制備①膠體金的制備采用微波爐_檸檬酸三鈉還原法制得顆粒大 小為20 30nm的膠體金。②金標(biāo)單抗A的制備將單抗A按合適的比例加入上述①步制成的膠體金中，再加 入牛血清白蛋白，離心純化后用金標(biāo)保存液懸起，即為金標(biāo)單抗A液體。③載有金標(biāo)單抗A的結(jié)合墊的制備將上述②步制成的金標(biāo)單抗A液體噴涂到玻
3璃纖維上，冷凍干燥。(3)硝酸纖維素膜檢測(cè)層的制備將調(diào)整好濃度的單抗B和羊抗小鼠IgG噴涂于硝 酸纖維素膜檢測(cè)層上，分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線，晾干后封閉液中浸泡。(4)魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的制作在載體板上順次貼上硝酸纖維素膜檢測(cè) 層、吸水墊、結(jié)合墊和樣品墊，再用切條機(jī)切成3mm寬的試紙，即成本發(fā)明試紙。本發(fā)明采用雙抗體夾心免疫層析原理，即若檢測(cè)樣品中含有IXDV，金標(biāo)單抗A與 LCDV結(jié)合，形成金標(biāo)單抗A-LCDV復(fù)合物，當(dāng)該復(fù)合物層析至硝酸纖維素膜檢測(cè)層的檢測(cè) 線時(shí)，預(yù)先包被在此處的單抗B識(shí)別復(fù)合物中IXDV，形成金標(biāo)單抗A-LCDV-單抗B的夾心 結(jié)構(gòu)，單抗A上標(biāo)記的膠體金顆粒在此處固定并累積顯現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅色，未與IXDV反應(yīng) 的游離金標(biāo)單抗A繼續(xù)前行，到達(dá)預(yù)先包被在質(zhì)控線上的羊抗小鼠IgG處時(shí)，抗體類型為 IgG的金標(biāo)單抗A與其結(jié)合，形成金標(biāo)單抗A-羊抗小鼠IgG復(fù)合物，在質(zhì)控線處也出現(xiàn)由 膠體金顆粒固定并累積顯現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅色，其結(jié)果是檢測(cè)線和質(zhì)控線處均顯現(xiàn)紅色，表 示IXDV陽(yáng)性；若檢測(cè)樣品中不含IXDV，檢測(cè)線處不顯現(xiàn)紅色，只在質(zhì)控線處顯現(xiàn)紅色，表示 LCDV陰性；若質(zhì)控線處不顯現(xiàn)紅色，說(shuō)明試紙失效，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)檢測(cè)快速，5 IOmin可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)結(jié)果；(2)操作簡(jiǎn) 便，不需要專業(yè)人員；(3)檢測(cè)成本低，無(wú)需專業(yè)儀器設(shè)備，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；(4)靈敏度高，特 異性強(qiáng)，具可重復(fù)性；(5)儲(chǔ)存方便，穩(wěn)定性好，室溫下有效期6個(gè)月，4°C下有效期12個(gè)月。


圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果示意圖。圖3是本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果實(shí)物圖。其中，1、載體板；2、樣品墊；3、結(jié)合墊；4、硝酸纖維素膜檢測(cè)層；5、吸水墊；6、檢測(cè) 線；7、質(zhì)控線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明所用儀器及試劑倒置顯微鏡(購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司)；高速冷凍離心機(jī) (SIGMA公司)；噴膜儀(購(gòu)自BIODOT公司)；氯金酸(購(gòu)自中國(guó)上海試劑一廠，分析純)；梓 檬酸三鈉(購(gòu)自中國(guó)上海試劑一廠，分析純)；RPMI 1640 (購(gòu)自HYCL0NE公司)；羊抗小鼠 IgG(購(gòu)自SIGMA公司)；牛血清白蛋白(購(gòu)自SIGMA公司)；Tween-20 (購(gòu)自SIGMA公司)； 硝酸纖維素膜(購(gòu)自WHATMAN公司)。實(shí)施例1.魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的制備。(1)單抗A和單抗B的制備復(fù)蘇并培養(yǎng)保藏號(hào)為CCTCC-C200419和CCTCC-C200420 的雜交瘤細(xì)胞株，腹腔注射液體石蠟于8 10周齡健康BALB/c小鼠，每只0. 5mL, 7天后腹 腔注射培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的雜交瘤細(xì)胞，每只1 X IO6個(gè)細(xì)胞。10 15天后收集腹水，3000rpm, 4°C離心lOmin，去除沉淀取上清液，上清液經(jīng)辛酸-硫酸銨法提純獲得單抗A和單抗B。(2)膠體金標(biāo)記單抗A的制備①膠體金的制備取0. 01 %氯金酸溶液IOOmL,放入微 波爐中，高檔火沸騰2min，迅速一次性加入一定量的檸檬酸三鈉溶液，放入微波爐中，中低檔火繼續(xù)加熱3min，冷卻至室溫補(bǔ)足失水，制成顆粒大小為20 30nm的膠體金。用 0. lmol/L碳酸鉀溶液調(diào)節(jié)pH值為8. 2，4°C保存。②目測(cè)法確定膠體金與單抗A的最佳標(biāo)記量取7只試管各加入ImL膠體金，再分 別加入0、5、10、15、20、25、3(^8的待標(biāo)記單抗4，震蕩混合20min，室溫靜置IOmin0接著向 每管加入100 L 10%氯化鈉溶液，震蕩混合lOmin，室溫靜置2h以上觀察結(jié)果。未加單 抗或者單抗量不足的試管，膠體金不穩(wěn)定形成由紅色變成藍(lán)紫色的聚沉現(xiàn)象，加入單抗的 量到達(dá)或超過(guò)最低穩(wěn)定量的試管，膠體金顏色保持紅色不變。使膠體金保持紅色的最小單 抗量即為標(biāo)記膠體金所需要的最小單抗量，在此基礎(chǔ)上加上20%的單抗量即為標(biāo)記膠體金 的單抗實(shí)際使用量。③金標(biāo)單抗A的制備取膠體金按合適的比例加入單抗A，緩慢攪動(dòng)30min后，再向 其中加入牛血清白蛋白(BSA)至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌20min。將上述溶液經(jīng)3000rpm， 4°C離心20min，去除沉淀取上清液，再將上清液經(jīng)13500rpm，4°C離心30min，棄去上清液得 沉淀，沉淀用金標(biāo)抗體洗滌液(含BSA的0. 01mol/L pH 7. 4PBS)洗滌，再次離心，吸去 上清液得到的沉淀即為金標(biāo)單抗A。將沉淀懸浮于金標(biāo)抗體保存液(含蔗糖，1%BSA， 0. 1% Tween-20 和 0. 02%疊氮鈉的 0. 01mol/L pH 7. 4PBS)中，4°C保存。(3)結(jié)合墊3的制備將金標(biāo)單抗A液體均勻噴涂到玻璃纖維上，冷凍干燥。(4)硝酸纖維素膜檢測(cè)層4的制備用0. 01mol/L pH 7. 4PBS調(diào)整單抗B的濃度 為lmg/mL，用噴膜儀將其噴涂于硝酸纖維素膜檢測(cè)層上，作為檢測(cè)線6。同樣，調(diào)整羊抗小 鼠IgG的濃度為500 ？ g/mL,將其噴涂于硝酸纖維素膜檢測(cè)層上，作為質(zhì)控線7，兩線相 距5mm，質(zhì)控線7靠近吸水墊5，檢測(cè)線6靠近樣品墊2。將包被好的硝酸纖維素膜檢測(cè)層 干燥后，于 37°C封閉液(含 2% BSA 的 0. 01mol/L pH 7. 4PBS)中浸泡 lh，PBST(含 0. 05% Tween-20 的 0. 01mol/L pH 7. 4PBS)漂洗，干燥。(5)本發(fā)明的魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的制作①魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙板 的組裝戴上手套，在載體板1的一側(cè)順次粘貼上硝酸纖維素膜檢測(cè)層4、結(jié)合墊3、樣品墊2 和吸水墊5，組裝成試紙板。在試紙板的吸水墊5表面貼上彩色不干膠紙，樣品墊2和結(jié)合 墊3表面貼上帶有MAX線標(biāo)簽的不干膠紙。其中硝酸纖維素膜檢測(cè)層4的上邊緣重疊在吸 水墊5下邊緣之下，硝酸纖維素膜檢測(cè)層4下邊緣重疊在結(jié)合墊3上邊緣之下，樣品墊2的 上邊緣重疊在結(jié)合墊3下邊緣之上。(見(jiàn)圖1)②魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的制作將貼有 不干膠紙的試紙板放入切條機(jī)槽內(nèi)切割成3mm寬的試紙，將切好的試紙放入裝有干燥劑的 鋁箔袋內(nèi)封口，即成本發(fā)明試紙。實(shí)施例2.魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的使用方法(1)檢測(cè)樣品的制備取待檢魚(yú) 類組織(表皮、鰓、鰭、胃、腸等)，按1 10 (W/V)與TNE緩沖液混合，加入適量石英砂用研 缽研磨，7000 SOOOrpm冰浴勻漿，取上清液作為檢測(cè)樣品。(2)魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的使用手持試紙的吸水墊5 —端將樣品墊4 一端 浸入檢測(cè)樣品中，液面不要超過(guò)標(biāo)志線“MAX”，平放試紙，5 IOmin內(nèi)觀察結(jié)果。(3)結(jié)果判斷①陽(yáng)性結(jié)果硝酸纖維素膜檢測(cè)層4質(zhì)控線6和檢測(cè)線7均出現(xiàn)紅 色，表示有IXDV感染。②陰性結(jié)果硝酸纖維素膜檢測(cè)層4只質(zhì)控線6出現(xiàn)紅色，表示無(wú)LCDV感染。③無(wú)效結(jié)果硝酸纖維素膜檢測(cè)層4質(zhì)控線6無(wú)紅線出現(xiàn)，表示操作有問(wèn)題或試紙
5失效(見(jiàn)圖2)。實(shí)施例3.魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙靈敏度的測(cè)定(1)免疫層析法測(cè)試靈敏度 試驗(yàn)用試紙檢測(cè)梯度稀釋的魚(yú)類LCDV提純液。結(jié)果可以檢測(cè)到的最低病毒量為1 μ g/mL。(2)免疫金銀染色法增強(qiáng)靈敏度試驗(yàn)免疫層析法檢測(cè)完畢后，將待加強(qiáng)的試紙用 洗滌液(含 0. 5%氯化鈉，0. 5%Tween-20 的 0. 05mol/L pH 8. 2Tris_ 鹽酸)洗滌 2 3min， 再于0.05mol/L pH 3. 8的檸檬酸鹽緩沖液中平衡5min。放入銀顯影液中避光顯色10 20min，蒸餾水洗滌。移入定影液(20%硫代硫酸鈉，15%亞硫酸鈉)中l(wèi)min，蒸餾水洗滌， 自然干燥。結(jié)果免疫金銀染色可以將試紙的靈敏度提高至0. 01 μ g/mL。表1最低病毒量的測(cè)定結(jié)果
++表示較強(qiáng)陽(yáng)性；+表示陽(yáng)性；-表示檢測(cè)線無(wú)色為陰性。實(shí)施例4.魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性測(cè)試(1)特異性 試驗(yàn)選擇3組樣品，第1組樣品魚(yú)類LCDV粗提液。第2組樣品患淋巴囊腫病魚(yú)類的組織 勻漿上清液。第3組樣品正常魚(yú)類的組織勻漿上清液。用試紙檢測(cè)以上3組樣品并與PCR 法比較。檢測(cè)結(jié)果一致第1、2組樣品為陽(yáng)性，第3組樣品為陰性。(見(jiàn)圖3)(2)重復(fù)性試 驗(yàn)用不同批次的試紙檢測(cè)以上3組樣品，每個(gè)批次試紙重復(fù)檢測(cè)5次，結(jié)果無(wú)明顯差異。(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)將試紙放入室溫與4°C下，每15天用試紙檢測(cè)以上3組樣品一次。 結(jié)果室溫下保存時(shí)有效期為6個(gè)月，4°C下保存時(shí)有效期為12個(gè)月。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行 修改，添加和替換都是可能的，其都沒(méi)有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙，包括載體板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜檢測(cè)層和吸水墊，所述樣品墊和吸水墊位于載體板的兩端，硝酸纖維素膜檢測(cè)層位于載體板的中部，其特征在于樣品墊與硝酸纖維素膜檢測(cè)層交界處設(shè)有載有金標(biāo)單抗A的結(jié)合墊，結(jié)合墊一端邊緣重疊在樣品墊之下，另一端邊緣重疊在硝酸纖維素膜檢測(cè)層之上；硝酸纖維素膜檢測(cè)層上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線靠近樣品墊包被有單抗B，質(zhì)控線靠近吸水墊包被有羊抗小鼠IgG。
2.一種如權(quán)利要求1所述魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的制備方法，其特征在于它包括 如下步驟(1)單抗A和單抗B的制備復(fù)蘇并培養(yǎng)保藏號(hào)為CCTCC-C200419和CCTCC-C200420的雜交瘤細(xì)胞株，腹腔注射 BALB/c小鼠，采集腹水，辛酸-硫酸銨法提純獲得單抗A和單抗B ；(2)結(jié)合墊的制備①膠體金的制備采用微波爐-檸檬酸三鈉還原法制得顆粒大小為20 30nm的膠體②金標(biāo)單抗A的制備將單抗A按合適的比例加入上述①步制成的膠體金中，再加入牛 血清白蛋白，離心純化后用金標(biāo)保存液懸起，即為金標(biāo)單抗A液體；③載有金標(biāo)單抗A的結(jié)合墊的制備將上述②步制成的金標(biāo)單抗A液體噴涂到玻璃纖 維上，冷凍干燥；(3)硝酸纖維素膜檢測(cè)層的制備將調(diào)整好濃度的單抗B和羊抗小鼠IgG噴涂于硝酸纖維素膜檢測(cè)層上，分別作為檢測(cè) 線和質(zhì)控線，晾干后封閉液中浸泡；(4)魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙的制作在載體板上順次貼上硝酸纖維素膜檢測(cè)層、吸水墊、結(jié)合墊和樣品墊，再用切條機(jī)切成 3mm寬的試紙，即成本發(fā)明試紙。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種魚(yú)類淋巴囊腫病毒檢測(cè)試紙，包括載體板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜(NC膜)檢測(cè)層和吸水墊，所述樣品墊和吸水墊位于載體板的兩端，硝酸纖維素膜檢測(cè)層位于載體板的中部，其特征在于樣品墊與硝酸纖維素膜檢測(cè)層交界處設(shè)有載有金標(biāo)單抗A的結(jié)合墊，該層一端邊緣重疊在樣品墊之下，另一端邊緣重疊在硝酸纖維素膜檢測(cè)層之上；硝酸纖維素膜檢測(cè)層上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線靠近樣品墊包被有單抗B，質(zhì)控線靠近吸水墊包被有羊抗小鼠IgG。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需專業(yè)人員及儀器設(shè)備，結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確，可常溫下運(yùn)輸、保存等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK101893632SQ20101023908
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者宋佳蕾, 戰(zhàn)文斌, 繩秀珍, 邢婧 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)