專利名稱：促甲狀腺激素定量檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外免疫檢測技術(shù)，尤其是涉及一種將酶促化學發(fā)光技術(shù)與磁分離技 術(shù)相結(jié)合的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
促甲狀腺激素(thyrotropin, thyroid stimulating hormone, TSH)是腺垂體分泌、 的促進甲狀腺生長和機能的激素。人類的TSH為一種糖蛋白，是由垂體前葉分泌的一種糖 蛋白激素，含211個氨基酸，糖類約占整個分子的15%，整個分子由兩條肽鏈——α鏈和β 鏈組成，分子量為28000D。TSH分子α亞基的氨基酸序列與其他的糖蛋白激素如促黃體素 (LH)、促卵泡素(FSH)和人絨毛膜促性腺素(HCG)的α亞基基本相同。β亞基為TSH所特 有的，決定TSH的特異性。血清中除有生物活性的整分子TSH外，還有無生物活性的α及 β亞基。TSH全面促進甲狀腺的機能，稍早出現(xiàn)的是促進甲狀腺激素的釋放，稍晚出的為促 進Τ4、Τ3的合成，包括加強碘泵活性，增強過氧化物酶活性，促進甲狀腺球蛋白合成及酪氨 酸碘化等各個環(huán)節(jié)。TSH促進甲狀腺上皮細胞的代謝及胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)合成，使細胞呈高 柱狀增生，從而使腺體增大。腺垂體分泌TSH，一方面受下丘腦分泌的促甲狀腺激素釋放激 素(TRH)的促進性影響，另方面又受到Τ3、Τ4反饋性的抑制性影響，二者互相拮抗，它們組 成下丘腦-腺垂體-甲狀腺軸。正常情況下，下丘腦分泌的TRH量，決定腺垂體甲狀腺軸反 饋調(diào)節(jié)的水平。TRH分泌多，則血中Τ3、Τ4水平的調(diào)定點高，當血中Τ3、Τ4超過此調(diào)定水平 時，則反饋性抑制腺垂體分泌TSH，并降低腺垂體對TRH的敏感性，從而使血中Τ3，Τ4水平保 持相對恒定。驟冷等外界刺激經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)促進下丘腦釋放TRH，再經(jīng)腺垂體甲狀腺軸， 提高血中Τ3、Τ4水平。血清中TSH從各方面控制甲狀腺的功能從吸碘作用，甲狀腺球蛋白的合成和分 泌，直至甲狀腺素的釋放等。因此，整分子TSH的準確測定，是判斷甲狀腺和下丘腦-垂 體-甲狀腺軸的功能是否正常的首選指標。從檢測技術(shù)上來講，過去以放免為代表的第一代TSH診斷試劑盒，因其最低檢測 限接近正常值下限，臨床價值受到很大限制，已基本上退出市場，目前應(yīng)用較多的為酶聯(lián)免 疫技術(shù)和化學發(fā)光技術(shù)?；瘜W發(fā)光技術(shù)興起于上個世紀80年代，是繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免 技術(shù)之后發(fā)展起來的新興技術(shù)，由于其較高的靈敏度和特異性，同時方法也簡便、快速，標 記結(jié)合物穩(wěn)定，無放射性同位素損傷和污染等特點，在近些年得到了飛速發(fā)展。免疫磁微粒 技術(shù)是近幾年新興技術(shù)，它是利用高分子合成一定粒度大小的磁性固相微粒做載體，載體 表面修飾有一定數(shù)量的化學功能團，可通過化學偶聯(lián)等方法包被上具有特異性親和力的免 疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，具有分離速度快、效率高、可重復性好、反應(yīng)均相等諸多優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，該試劑盒將酶促化學 發(fā)光技術(shù)與磁分離技術(shù)相結(jié)合，成本低廉、簡便快速且結(jié)果準確；本發(fā)明還提供該試劑盒的制備方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案本發(fā)明所述的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，它包括包被有抗促甲狀腺激素單克 隆抗體的磁微?；鞈乙?、促甲狀腺激素系列校準品、辣根過氧化物酶標記的抗促甲狀腺激 素單克隆抗體、發(fā)光底物A液、發(fā)光底物B液及濃縮洗液。所述磁微?；鞈乙褐械拇盼⒘Ａ綖?. 8-1. 5um,表面含有濃度為20-30ueq/g的 羧基活性基團。采用活化劑對其羧基進行活化，然后與抗促甲狀腺激素單克隆抗體上的氨 基進行連接；所述促甲狀腺激素系列校準品是采用PH為7. 4的Tris-NaCl緩沖液(三(羥甲 基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液)基質(zhì)，加入促甲狀腺激素純品、牛血清白蛋白及穩(wěn)定劑配制而 成。所述辣根過氧化物酶標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體采用的標記方法為碳二 亞胺法。所述發(fā)光底物A液由0.2M TriS-Hcl (三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液)、 0. 15mM Luminol (魯米諾)、0.59mM羥基香豆素、0.35mM沒食子酸組成；發(fā)光底物B液由 0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8% tween 20 (表面活性劑)、0. 5mM DTPA (二乙烯三胺五乙酸)、 0. 12mM維生素C組成。所述濃縮洗液為含有穩(wěn)定劑和表面活性劑的磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)。本發(fā)明所述的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒的制備方法，它包括下述步驟第一步，包被有抗促甲狀腺激素單克隆抗體的磁微?；鞈乙旱闹苽涓鶕?jù)使用量取羧基磁微粒，用過量的EDC(l-(3_ 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞 胺)和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)在酸性條件下進行活化，活化完成后，加磁場，靜置使磁 微粒與液體分開，棄去上清，用PH7. 6的0. OlM的PBS緩沖液洗滌以洗去多余的活化劑；加 入抗促甲狀腺激素單克隆抗體，使其濃度為2ug/mg磁微粒，在酸性條件下震蕩反應(yīng)；反應(yīng) 結(jié)束后加磁場，靜置使磁微粒與液體分開，棄去上清，用含有1 %牛血清白蛋白的0. OlM的 PBS緩沖液進行封閉，并加入封閉液以保存磁微粒，使磁微粒的最終濃度為0. 5mg/ml ；將該 磁微?；鞈乙褐糜?-8度保存，以備使用；第二步，促甲狀腺激素系列校準品的制備用含有-3% BSA(牛血清白蛋白)和 0. 1-0. 3% PC300 (防腐劑)^Tris-NaCl 緩沖液將促甲狀腺激素純品配制成標示濃度為ο μ IU/ml、0. 1 μ IU/ml、0. 5 μ IU/ml、2 μ IU/ ml UO μ IU/ml,50 μ IU/ml UOO μ IU/ml 的一系列校準品；第三步，辣根過氧化物酶標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體的制備將鼠抗促甲狀腺激素單克隆抗體上的羧基與辣根過氧化物酶分子的氨基經(jīng)EDC 的作用縮合為酰胺化合物，透析后既得促甲狀腺激素酶標抗體；在標記好的溶液中，等比加 入甘油-20度保存?zhèn)溆茫坏谒牟?，發(fā)光底物A液、發(fā)光底物B液及濃縮洗液的配制發(fā)光底物A 液由 0. 2M Tris-Hcl.O. 15mM Luminol、0. 59mM 羥基香豆素、0. 35mM 沒 食子酸配制而成；發(fā)光底物B液由0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8% tween 20,0. 5mM DTPA、0. 12mM維生
4素C配制而成；濃縮洗液由NaH2P04 · 2H20 4. 06g, Na2HP04 · 12H20 62. 32g, Tween202_10ml，蒸 餾水1000ml配制而成。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用雙抗體夾心的一步法反應(yīng)模式，從大量的活性材料中優(yōu)選 出一對特異性較高、親和力較強的單克隆抗體分別作為本試劑盒的包被抗體和酶標記抗 體，使得本試劑盒的診斷靈敏度明顯優(yōu)于同類試劑盒。本發(fā)明的主要創(chuàng)新之處在于1、研制了一種新的定量檢測血清中促甲狀腺激素含量的試劑盒，該試劑盒將化學 發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，使得TSH檢測性能大大 提高(靈敏度、精密性、檢測范圍等)，反應(yīng)時間大大縮短(從開始加樣到檢測結(jié)果，時間少 于 25min)；2、發(fā)明了一種新的抗促甲狀腺激素單克隆抗體與免疫磁微粒的偶聯(lián)方法，該方法 偶聯(lián)效率較高，結(jié)合牢固，且工藝穩(wěn)定，在提高產(chǎn)品性能的同時，大大降低了產(chǎn)品成本；3、試劑盒中的校準品、酶結(jié)合物、濃縮洗液、及發(fā)光底物配方均是該反應(yīng)體系下的 最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。


圖1是本發(fā)明試劑盒的標準曲線線形圖。圖2是本發(fā)明試劑盒與同類產(chǎn)品對照圖。
具體實施例方式本發(fā)明所述的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，它包括包被有抗促甲狀腺激素單克 隆抗體的磁微?；鞈乙海龃盼⒘；鞈乙褐械拇盼⒘Ａ綖?. 8-1. 5um，表面含有濃度 為20-30ueq/g的羧基活性基團，采用活化劑對其羧基進行活化，然后與抗促甲狀腺激素 單克隆抗體上的氨基進行連接；采用PH為7. 4的Tris-NaCl緩沖液基質(zhì)，加入促甲狀腺 激素純品、牛血清白蛋白及穩(wěn)定劑配制而成的促甲狀腺激素系列校準品；辣根過氧化物酶 標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體，標記方法采用碳二亞胺法；由0. 2M Tris-HcUO. 15mM LuminoUO. 59mM羥基香豆素、0. 35mM沒食子酸組成的發(fā)光底物A液，由0. 85mM氨基酸氧化 酶、0. 8% Tween-20,0. 5mM DTPA、0. 12mM維生素C組成的發(fā)光底物B液及加有穩(wěn)定劑和表 面活性劑的PBS緩沖濃縮洗液。本發(fā)明所述的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒的制備方法，它包括下述步驟第一步，包被有抗促甲狀腺激素單克隆抗體的磁微?；鞈乙旱闹苽涓鶕?jù)使用量取適量的羧基磁微粒，用過量的EDC和NHS在酸性條件下 (PH4. 5-PH5. 5)進行活化，活化緩沖液為0. 05M-0. IM的MES (2-(N-嗎啉代)乙磺酸)緩沖 液，活化時間為30min，活化完成后，加磁場，靜置5min使磁微粒與液體分開，棄去上清，用 PH為7. 6的0. OlM的PBS緩沖液洗滌兩遍以洗去多余的活化劑；加入適量的抗促甲狀腺激 素單克隆抗體，使其濃度為2ug/mg磁微粒，在0. 05M-0. IM的MES緩沖液中(PH4. 5-PH5. 5) 震蕩反應(yīng)Ih ；反應(yīng)結(jié)束后加磁場，靜置5min使磁微粒與液體分開，棄去上清，用含有1 %牛 血清白蛋白(BSA)的0. OlM的PBS緩沖液(PH7. 6)進行封閉，反復封閉5次，每次IOmin ；封閉結(jié)束后，加入適量的封閉液以保存磁微粒，使磁微粒的最終濃度為0. 5mg/ml ；將該磁 微?；鞈乙褐糜?-8度保存，以備使用；第二步，促甲狀腺激素系列校準品的制備依據(jù)WHO的促甲狀腺激素標準品，用含有1 % -3 % BSA和0. 1-0. 3 % PC300的Tri S-NaCl緩沖液將促甲狀腺激素純品配制成標示濃度為0μ IU/ml、0. 1μ IU/ml、0. 5μ IU/ ml、2y υ/πι1、10μ IU/ml、50y υ/πι1、100μ IU/ml的一系列校準品，瓶蓋顏色依次為白、黃、 綠、藍、紅、紫、黑；第三步，辣根過氧化物酶標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體的制備將鼠抗促甲狀腺激素單克隆抗體上的羧基與辣根過氧化物酶(HRP)分子的氨基 經(jīng)EDC的作用縮合為酰胺化合物，透析后既得促甲狀腺激素酶標抗體；在標記好的溶液中， 等比加入甘油-20度保存?zhèn)溆茫粚擞浐玫拿笜丝贵w按照1 2000—1 5000的比例加入到含有20%—50%小 牛血清和Pc300 (0. 15% -0. 25% )的PH 7. 4Tris_NaCl緩沖液中，混合均勻，即得到該試劑 盒的酶結(jié)合物；第四步，發(fā)光底物A液、發(fā)光底物B液及濃縮洗液的配制發(fā)光底物A 液由 0. 2M Tris-Hcl.O. 15mM Luminol、0. 59mM 羥基香豆素、0. 35mM 沒 食子酸配制而成；發(fā)光底物B液由0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8% tween 20,0. 5mM DTPA、0. 12mM維生 素C配制而成；濃縮洗液由NaH2P04 · 2H20 4. 06g, Na2HP04 · 12H20 62. 32g, Tween202_10ml，蒸 餾水1000ml配制而成。本發(fā)明促甲狀腺激素定量檢測試劑盒的使用操作程序如下1、樣本采集采用正確醫(yī)用技術(shù)收集血清(嚴重溶血或脂血的樣本不能用于測定)，收集后的 樣本在室溫放置不可超過8小時；如果不在8小時內(nèi)檢測需將樣本放置于2 8°C的冰箱 中；若需72小時以上保存或運輸，則應(yīng)凍存于-20°C以下，避免反復凍融。使用前恢復到室 溫，輕輕搖動混勻。2、實驗前準備①取1瓶濃縮洗液按標簽上標識的稀釋比例要求稀釋備用。②將恒溫箱或水浴鍋溫度調(diào)至37°C，待溫度穩(wěn)定后使用。③將磁微?；鞈乙撼浞只靹蛑翢o肉眼可見沉淀。3、實驗方法①取出一定量的反應(yīng)容器，編號。根據(jù)實驗要求加入50 μ 1校準品/質(zhì)控品/臨 床血清。②搖勻磁微?；鞈乙?，每孔分別加入20 μ 1。③每孔分別加入酶標記物50 μ 1。④將反應(yīng)容器內(nèi)溶液混合均勻，37°C溫育15分鐘。⑤使用磁分離及洗滌設(shè)備，將反應(yīng)容器中磁微粒用洗液洗滌5次。⑥將洗滌后的反應(yīng)容器充分振蕩使磁微粒散開。
⑦每孔加入發(fā)光底物A和發(fā)光底物B各50 μ 1，振蕩混勻后避光室溫反應(yīng)5分鐘。⑧化學發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光強度。⑨采用四參數(shù)擬合方式，以校準品濃度值為X軸，以校準品發(fā)光強度對數(shù)值為Y 軸，建立定標曲線。根據(jù)待測樣本的發(fā)光強度值回算相應(yīng)的濃度值。本發(fā)明促甲狀腺激素定量檢測試劑盒的方法學鑒定結(jié)果按照上述操作方法對該試劑盒進行方法學鑒定，該試劑盒可達到如下指標標準曲線線性R大于0. 999 (如附圖1所示)最低檢出限小于0. 005 μ IU/ml精密性分析內(nèi)變異、分析間變異及批間變異均小于10% (見表1)表1.精密性數(shù)據(jù)表a)、分析內(nèi)和分析間變異數(shù)據(jù)表
權(quán)利要求
一種促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，其特征在于它包括包被有抗促甲狀腺激素單克隆抗體的磁微粒混懸液、促甲狀腺激素系列校準品、辣根過氧化物酶標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體、發(fā)光底物A液、發(fā)光底物B液及濃縮洗液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，其特征在于所述磁微?；?懸液中的磁微粒粒徑為0. 8-1. 5um，表面含有濃度為20-30ueq/g的羧基活性基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，其特征在于所述促甲狀腺 激素系列校準品是采用PH為7. 4的Tris-NaCl緩沖液基質(zhì)，加入促甲狀腺激素純品、牛血 清白蛋白及穩(wěn)定劑配制而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，其特征在于所述辣根過氧 化物酶標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體采用的標記方法為碳二亞胺法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，其特征在于所述發(fā)光底物 A液由0. 2M Tris-Hcl.O. 15mM Luminol、0. 59mM羥基香豆素、0. 35mM沒食子酸組成；發(fā)光底 物B液由0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8% tween 20,0. 5mM DTPA、0. 12mM維生素C組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮洗液 為含有穩(wěn)定劑和表面活性劑的磷酸鹽緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促甲狀腺激素定量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于它 包括下述步驟第一步，包被有抗促甲狀腺激素單克隆抗體的磁微粒混懸液的制備根據(jù)使用量取羧基磁微粒，用過量的EDC和NHS在酸性條件下進行活化，活化完成后， 加磁場，靜置使磁微粒與液體分開，棄去上清，用PH為7. 6的0. OlM的PBS緩沖液洗滌以洗 去多余的活化劑；加入抗促甲狀腺激素單克隆抗體，使其濃度為2ug/mg磁微粒，在酸性條 件下震蕩反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后加磁場，靜置使磁微粒與液體分開，棄去上清，用含有牛血 清白蛋白的0. OlM的PBS緩沖液進行封閉，并加入封閉液以保存磁微粒，使磁微粒的最終濃 度為0. 5mg/ml ；將該磁微粒混懸液置于2_8度保存，以備使用；第二步，促甲狀腺激素系列校準品的制備用含有1 % "3 % BSA和0. 1-0.3% PC300的Tris-NaCl緩沖液將促甲狀腺激素純品 配制成標示濃度為 0μ IU/ml、0. 1 μ IU/ml、0. 5μ IU/ml、2y IU/mlU0y IU/ml、50y IU/ml、 100 μ IU/ml的一系列校準品；第三步，辣根過氧化物酶標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體的制備將鼠抗促甲狀腺激素單克隆抗體上的羧基與辣根過氧化物酶分子的氨基經(jīng)EDC的作 用縮合為酰胺化合物，透析后既得促甲狀腺激素酶標抗體；在標記好的溶液中，等比加入甘 油-20度保存?zhèn)溆?；第四步，發(fā)光底物A液、發(fā)光底物B液及濃縮洗液的配制發(fā)光底物A液由0. 2M Tris-Hcl.O. 15mM Luminol、0. 59mM羥基香豆素、0. 35mM沒食子 酸配制而成；發(fā)光底物B液由0. 85mM氨基酸氧化酶、0. 8% tween 20,0. 5mM DTPA、0. 12mM維生素C 配制而成；濃縮洗液由 NaH2P04 · 2H20 4. 06g, Na2HP04 · 12H20 62. 32g, Tween20 2-lOml，蒸餾水 1000ml配制而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促甲狀腺激素定量檢測試劑盒，它包括包被有抗促甲狀腺激素單克隆抗體的磁微?；鞈乙?、促甲狀腺激素系列校準品、辣根過氧化物酶標記的抗促甲狀腺激素單克隆抗體、發(fā)光底物A液、發(fā)光底物B液及濃縮洗液；本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用雙抗體夾心的一步法反應(yīng)模式，從大量的活性材料中優(yōu)選出一對特異性較高、親和力較強的單克隆抗體分別作為包被抗體和酶標記抗體，使得本試劑盒診斷靈敏度、精密性和檢測范圍明顯優(yōu)于同類試劑盒，反應(yīng)時間大大縮短，同時本發(fā)明采用抗促甲狀腺激素單克隆抗體與免疫磁微粒的偶聯(lián)方法，偶聯(lián)效率較高，結(jié)合牢固，工藝穩(wěn)定，在提高產(chǎn)品性能的同時，大大降低了產(chǎn)品成本。
文檔編號G01N33/535GK101949943SQ201010243049
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者付光宇, 劉保鑫, 吳學煒, 渠海, 苗擁軍, 陳曉玲, 項立紅, 馬建軍, 高曉丹 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司