專利名稱：一種基于流式熒光編碼微球的禽流感病毒多型同步檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于流式微球技術(shù)的禽流感亞型病毒的同步免疫檢測(cè)方法，特別 是涉及一種以量子點(diǎn)為熒光標(biāo)記物、聚苯乙烯熒光編碼微球?yàn)楣滔噍d體的多靶標(biāo)同步免疫 檢測(cè)法及所使用的試劑盒。
背景技術(shù)：
禽流感是禽流行性感冒的簡(jiǎn)稱，它是一種由禽流感病毒引起的傳染性疾病，被國(guó) 際獸疫局定為甲類傳染病，又稱真性雞瘟或歐洲雞瘟。按病原體類型的不同，禽流感可分為 高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大類。非致病性禽流感不會(huì)引起明顯癥狀，僅使染 病的禽鳥體內(nèi)產(chǎn)生病毒抗體。低致病性禽流感可使禽類出現(xiàn)輕度呼吸道癥狀，食量減少，產(chǎn) 蛋量下降，出現(xiàn)零星死亡。高致病性禽流感最為嚴(yán)重，發(fā)病率和死亡率均高，人感染高致病 性禽流感死亡率約是60 %，家禽雞感染的死亡率幾乎是100 %，無(wú)一幸免。最早的人禽流感病例出現(xiàn)在1997年的香港。那次H5W型禽流感病毒感染導(dǎo)致12 人發(fā)病，其中6人死亡。其后，本病一直在亞洲區(qū)零星爆發(fā)，但在2003年12月開始，禽流 感在東亞多國(guó)——主要在越南、韓國(guó)、泰國(guó)——嚴(yán)重爆發(fā)，并造成越南多名病人喪生。直到 2005年中，疫癥不單未有平息的跡象，而且還不斷擴(kuò)散。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，到目前 為止全球共有15個(gè)國(guó)家和地區(qū)的393人感染，其中248人死亡，死亡率63%。流式微球技術(shù)(eytometric bead array, CBA)是近年來(lái)剛剛興起的一種檢測(cè)技 術(shù)；它利用球形基質(zhì)作為載體，以流式細(xì)胞術(shù)作為檢測(cè)平臺(tái)，可以在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)核酸、蛋 白質(zhì)等生物分子進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)；該技術(shù)集中了分子生物學(xué)、免疫學(xué)、高分子化學(xué)、激光檢 測(cè)技術(shù)、微流體技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等方面的先進(jìn)技術(shù)。而該系統(tǒng)主要基于流式熒光編碼微球 為載體和熒光探針進(jìn)行免疫檢測(cè)，檢測(cè)通量大、靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)多靶標(biāo)。該技術(shù) 最先被應(yīng)用在細(xì)胞、基因、抗體、病毒檢測(cè)等基因研究與生物醫(yī)療診斷領(lǐng)域，后來(lái)延伸到動(dòng) 植物中病毒等的檢測(cè)與監(jiān)控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于流式微球技術(shù)的多靶標(biāo)同步免疫檢測(cè)法，實(shí)現(xiàn)用不 同的編碼微球和同一種熒光探針可同時(shí)檢測(cè)同一樣品中多種禽流感亞型病毒成分或者同 時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品中的不同種禽流感亞型病毒。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供了一種在此檢測(cè)方法過(guò)程中使用的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明是以量子點(diǎn)進(jìn)行熒光標(biāo)記，應(yīng)用于抗原抗體特異性反應(yīng)的一種熒光免疫檢 測(cè)法，根據(jù)微球內(nèi)部包埋熒光染料比例的不同進(jìn)行光學(xué)編碼，選用不同編碼的微球作為固 相載體同步檢測(cè)不同樣品中的單種或多種待測(cè)禽流感亞型病毒，旨在提高檢測(cè)通量，提高 檢測(cè)速度。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下
首先，將禽流感亞型抗體包被在聚苯乙烯微球上，形成微球_包被抗體偶聯(lián)物，在 96孔濾膜板上，微球_包被抗體偶聯(lián)物與待測(cè)物中禽流感亞型病毒和檢測(cè)抗體發(fā)生特異性 反應(yīng)，其中，多余的檢測(cè)抗體經(jīng)洗滌抽濾而被從反應(yīng)體系中去除，而與微球-包被抗體偶聯(lián) 物反應(yīng)的檢測(cè)抗體與后續(xù)加入的熒光探針(如量子點(diǎn)標(biāo)記二抗)進(jìn)行特異性結(jié)合形成微 球_包被抗體偶聯(lián)物_病毒_檢測(cè)抗體_ 二抗_量子點(diǎn)的熒光免疫復(fù)合體，經(jīng)儀器檢測(cè)熒 光信號(hào)便可完成檢測(cè)過(guò)程。所述包被抗體是指抗禽流感亞型病毒的多克隆抗體或者單克隆抗體。所述微球-包被抗體偶聯(lián)物是指使用碳二亞胺法，1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基 碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)活化微球表面的羧基官能團(tuán)，然后 與包被抗體上的氨基反應(yīng)，從而以共價(jià)鍵方式形成微球-包被抗體偶聯(lián)物。所述檢測(cè)抗體是指抗禽流感病毒抗體，檢測(cè)抗體可與微球_包被抗體偶聯(lián)物發(fā)生 特異性反應(yīng)。所述量子點(diǎn)標(biāo)記二抗是指用量子點(diǎn)作為熒光探針標(biāo)記的二抗。所述微球_包被抗體偶聯(lián)物_病毒-檢測(cè)抗體_ 二抗-量子點(diǎn)熒光免疫復(fù)合體， 是指在待測(cè)樣品中禽流感病毒與檢測(cè)抗體發(fā)生反應(yīng)結(jié)束后，加入的量子點(diǎn)標(biāo)記二抗與微 球_包被抗體偶聯(lián)物_病毒_檢測(cè)抗體復(fù)合物繼續(xù)發(fā)生特異性反應(yīng)生成的復(fù)合物，而多余 的量子點(diǎn)標(biāo)記二抗則通過(guò)在96孔濾膜板洗滌、抽濾而離開反應(yīng)體系。所述96孔濾膜板是指框架與常規(guī)酶標(biāo)板一致，板底使用親水性濾膜進(jìn)行替代的 反應(yīng)板，使用的濾膜孔徑小于微球粒徑，未與微球_多抗偶聯(lián)物結(jié)合的熒光免疫復(fù)合物則 可以透過(guò)濾膜，經(jīng)真空抽濾后從反應(yīng)體系中被去除。所述熒光檢測(cè)是指用流式分析系統(tǒng)中的兩束熒光，定性區(qū)分不同的編碼微球從而 確定存在何種禽流感亞型病毒。本發(fā)明的同步免疫檢測(cè)法，所說(shuō)的流式分析系統(tǒng)激光光源發(fā)射波長(zhǎng)為488nm和 635nm。目前，美國(guó)Luminex公司、Bio-Rad公司、Beckman公司可提供滿足測(cè)試要求的檢測(cè) 儀器及編碼微球。上述待測(cè)病毒可以是任何一種亞型禽流感病毒，使用不同的單克隆抗體或多克隆 抗體就可檢測(cè)不同的相應(yīng)亞型的禽流感病毒。一種量子點(diǎn)為熒光標(biāo)記物、聚苯乙烯微球?yàn)楣滔噍d體的同步免疫檢測(cè)法診斷試劑 盒，包括以下試劑(1)基于聚苯乙烯熒光編碼微球包被有禽流感亞型抗體的微球-包被抗體偶聯(lián) 物；(2)量子點(diǎn)標(biāo)記的抗小鼠(或抗兔、抗雞等)二抗；(3)檢測(cè)抗體；(4)陽(yáng)性對(duì)照；(5)陰性對(duì)照；(6) pH 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液。包被有禽流感亞型抗體的聚苯乙烯熒光編碼微球是幾種禽流感亞型特異性抗體 結(jié)合在不同編碼微球的混合物，檢測(cè)抗體是抗禽流感病毒的抗體。使用方法將試劑按說(shuō)明書稀釋后按以下流程操作。
(1)制備熒光免疫復(fù)合體在96孔濾膜板中同時(shí)加入包被有禽流感亞型抗體的 聚苯乙烯熒光編碼微球、待測(cè)樣品，37oC避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)后抽濾掉孔內(nèi)反應(yīng)液，再 加檢測(cè)抗體，37oC避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，抽濾掉孔內(nèi)反應(yīng)液，后加入量子點(diǎn)標(biāo)記二抗， 37oC避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，形成微球-包被抗體偶聯(lián)物_病毒-檢測(cè)抗體-二抗-量 子點(diǎn)熒光免疫復(fù)合體；(2)熒光強(qiáng)度檢測(cè)用流式分析系統(tǒng)進(jìn)行激光激發(fā)并檢測(cè)熒光免疫復(fù)合體的熒光 強(qiáng)度。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的檢測(cè)步驟如下
1、微球-包被抗體偶聯(lián)取1. 25X106個(gè)微球?yàn)橐慌?，?.5mL離心管中，使用EDC、sulfo_NHS溶液 在pH6. 2條件下對(duì)微球表面羧基進(jìn)行常溫活化20分鐘，然后將微球置換到磷酸鹽緩沖液 (PBS，0.01M，pH7. 4)中，加入優(yōu)化量的包被抗體，避光振搖常溫反應(yīng)2小時(shí)，離心洗掉未結(jié) 合的包被抗體，用含1 % BSA的PBS重懸，避光振搖常溫反應(yīng)0. 5小時(shí)，封閉微球表面未與包 被抗體結(jié)合的剩余位點(diǎn)，最后，用含0. 1% BSA的PBS儲(chǔ)存微球-多抗偶聯(lián)物。2、量子點(diǎn)-二抗標(biāo)記首先將量子點(diǎn)和EDC溶液混合，室溫避光旋轉(zhuǎn)反應(yīng)30min ；將二抗按優(yōu)化比例滴加 到量子點(diǎn)中，室溫避光反應(yīng)3小時(shí)，用Si^phadex GlOO層析介質(zhì)將游離的量子點(diǎn)去除，后用 含0. 05%疊氮化鈉的PBS保存。3、微球_包被抗體偶聯(lián)物_病毒-檢測(cè)抗體_ 二抗-量子點(diǎn)復(fù)合體形成在96孔濾膜板中，同時(shí)加入微球_包被抗體偶聯(lián)物、待測(cè)病毒，37oC避光振搖反 應(yīng)0. 5-1小時(shí)，抽濾掉板上孔中反應(yīng)液，與微球_多抗偶聯(lián)物結(jié)合的待測(cè)病毒留在孔中；再 加入檢測(cè)抗體，37°C避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，抽濾掉板上孔中反應(yīng)液，其中多余的檢測(cè)抗 體隨反應(yīng)液被抽濾掉；然后加入量子點(diǎn)標(biāo)記二抗，37oC避光振搖反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，二抗與孔 中檢測(cè)抗體特異性結(jié)合，形成微球_包被抗體偶聯(lián)物_病毒_檢測(cè)抗體_ 二抗_量子點(diǎn)復(fù) 合體。4、定性熒光檢測(cè)該檢測(cè)方法的測(cè)定原理是通過(guò)檢測(cè)溶液中結(jié)合到微球上的包被抗體偶聯(lián)物_病 毒_檢測(cè)抗體_ 二抗-量子點(diǎn)免疫復(fù)合體的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)待側(cè)物的檢測(cè)。結(jié)合到微球上 的檢測(cè)病毒量不同，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度不同。檢測(cè)樣本的同時(shí)，將三個(gè)空白樣本作為陰性對(duì) 照。計(jì)算陰性對(duì)照平均熒光強(qiáng)度的均值，將樣本平均熒光強(qiáng)度與之比較并計(jì)算比率。臨界 值計(jì)算臨界值=陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度值X2. 1。測(cè)定樣本熒光強(qiáng)度值>臨界值，樣本中禽流 感亞型病毒陽(yáng)性；測(cè)定樣本熒光強(qiáng)度值<臨界值時(shí)，樣本中禽流感亞型病毒陰性。根據(jù)不同 的編碼微球上對(duì)應(yīng)的禽流感不同亞型抗體，來(lái)判斷待測(cè)樣本中禽流感病毒為何種亞型。
權(quán)利要求
一種基于流式熒光編碼微球的用于禽流感病毒多亞型同步檢測(cè)的雙抗體夾心免疫檢測(cè)方法，其特征在于以具有功能化基團(tuán)的聚苯乙烯熒光編碼微球作為固相載體，將禽流感病毒亞型特異性抗體以形成共價(jià)鍵方式包被到固相載體上，形成微球 包被抗體偶聯(lián)物，與不同亞型禽流感病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，再與熒光標(biāo)記的禽流感病毒抗體反應(yīng)或者與禽流感病毒抗體反應(yīng)后再與熒光標(biāo)記的二抗反應(yīng)，使用流式分析系統(tǒng)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物中逐一通過(guò)檢測(cè)區(qū)的微球所負(fù)載的多種熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)與陰性樣本對(duì)比，判斷樣本是否為陽(yáng)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于微球-包被抗體偶聯(lián)物的形成過(guò)程， 在96孔濾膜板內(nèi)的微球_包被抗體偶聯(lián)物的體系中加入待測(cè)病毒與檢測(cè)抗體，待測(cè)病毒與 檢測(cè)抗體發(fā)生雙抗體夾心形式的特異性反應(yīng)，檢測(cè)抗體再與量子點(diǎn)標(biāo)記二抗特異性結(jié)合而 形成基于微球的熒光免疫復(fù)合體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于基于微球的熒光免疫復(fù)合體的形成 是以量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物，用量子點(diǎn)標(biāo)記二抗，加入的微球_包被抗體偶聯(lián)物、待測(cè)病毒 與檢測(cè)抗體反應(yīng)完后，加入量子點(diǎn)標(biāo)記二抗反應(yīng)形成微球_包被抗體偶聯(lián)物_病毒-檢測(cè) 抗體_量子點(diǎn)標(biāo)記二抗的熒光免疫復(fù)合體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于根據(jù)內(nèi)部包埋熒光染料比例的不同 對(duì)微球進(jìn)行編碼，不同的熒光編碼微球連接抗禽流感病毒不同型的包被抗體，加入可特異 性結(jié)合的檢測(cè)抗體，可同步檢測(cè)同一樣品中多型禽流感病毒，或者同步檢測(cè)多個(gè)樣品中不 同型禽流感病毒。
5.一種在權(quán)利要求1所述的基于熒光編碼微球的禽流感病毒多亞型同步檢測(cè)試劑盒， 其特征在于包括(1)包被禽流感各亞型抗體的不同熒光編碼微球；(2)量子點(diǎn)標(biāo)記的二抗； ⑶檢測(cè)抗體；⑷陽(yáng)性對(duì)照；(5)陰性對(duì)照；(6)pH 7. 2-7. 4的磷酸鹽緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所說(shuō)的用流式系統(tǒng)對(duì)逐一流過(guò)檢 測(cè)區(qū)的微球所負(fù)載的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，是指檢測(cè)系統(tǒng)的兩束激光光源發(fā)射波長(zhǎng)分別為 488nm和635nm，一束通過(guò)判定微球內(nèi)包埋的染料比例從而對(duì)待測(cè)物進(jìn)行種類定性分析，另 一束通過(guò)測(cè)定微球上反應(yīng)連接的熒光探針強(qiáng)度從而判斷待測(cè)物含量多少。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于定性檢測(cè)使用陰性、陽(yáng)性對(duì)照樣本為 參照，根據(jù)待測(cè)病毒的平均熒光強(qiáng)度比率來(lái)定性，平均熒光強(qiáng)度比率大于或等于陰性檢測(cè) 值的2. 1倍時(shí)為陽(yáng)性，小于時(shí)為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基于流式微球技術(shù)的用于不同亞型禽流感病毒同步免疫檢測(cè)法及試劑盒，是以聚苯乙烯熒光編碼微球作為固相載體，以量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物，用于不同亞型禽流感病毒同步檢測(cè)的一種流式液相免疫檢測(cè)法。首先，將包被抗體共價(jià)結(jié)合在編碼微球表面，在濾膜板中，經(jīng)包被抗體、病毒、檢測(cè)抗體、二抗特異性結(jié)合形成微球-包被抗體偶聯(lián)物-病毒-檢測(cè)抗體-量子點(diǎn)標(biāo)記二抗(或者微球-包被抗體偶聯(lián)物-病毒-量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)抗體)的熒光免疫復(fù)合體，然后逐一流經(jīng)流式分析系統(tǒng)的檢測(cè)區(qū)，經(jīng)識(shí)別不同編碼微球并檢測(cè)量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度，并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度比率完成檢測(cè)。用不同編碼微球連接不同亞型禽流感單克隆抗體或者多克隆抗體，可同時(shí)檢測(cè)同一樣品中的多種亞型禽流感病毒，或者同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品中不同種亞型禽流感病毒，具有快速、高通量的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101915838SQ201010245668
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月5日
發(fā)明者張帆, 李錦豐, 薛強(qiáng), 鄒明強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院