專利名稱：果汁中耐熱菌的酶標(biāo)葡萄球菌a蛋白-酶聯(lián)免疫吸附檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及到果汁中耐熱菌的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋 白-酶聯(lián)免疫吸附快速檢測方法。
背景技術(shù)：
耐熱菌是引起濃縮蘋果汁變質(zhì)的主要微生物之一，耐熱菌超標(biāo)也是蘋果汁生產(chǎn)企 業(yè)最急需解決的問題。目前，生產(chǎn)企業(yè)多采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計數(shù)法檢測耐熱菌，平板培養(yǎng)計 數(shù)法主要包括美國KFL方法(美國庫克實(shí)驗室法)和澳大利亞Berri公司方法。KFL方法 主要是采用濾膜過濾，將耐熱菌截留在濾膜上，再將濾膜置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)計數(shù)，果汁廠多 采用此方法檢測耐熱菌。平板培養(yǎng)計數(shù)法最大的缺點(diǎn)是耗時長，一般檢測周期為4 5天。 目前也有用PCR法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法)檢測耐熱菌，基于PCR的耐熱菌檢測方法具有快 速、特異的優(yōu)點(diǎn)，但對設(shè)備、實(shí)驗室條件以及操作人員要求高，步驟較繁鎖，且試驗中有些試 劑對人體有一定的毒性，限制了 PCR檢測法的廣泛使用，推廣應(yīng)用也較困難。另一種方法是由本申請專利發(fā)明人所在的課題組提出的耐熱菌的ELISA快速檢 測方法，已申請了中國專利，專利申請?zhí)枮?00910022897. 7，這種方法簡便易行，檢測限達(dá) 國際標(biāo)準(zhǔn)，可滿足蘋果濃縮汁中耐熱菌不超過1個/IOmL的檢測標(biāo)準(zhǔn)，操作過程可在24小 時內(nèi)完成，達(dá)到快速檢測的效果。但該方法的加酶標(biāo)抗體步驟中，采用酶標(biāo)羊抗兔抗體，操 作步驟較繁瑣，靈敏度相對較低，操作時間仍然較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述耐熱菌檢測方法的缺點(diǎn)，提供一種操作 簡便、檢測時間短、靈敏度高、檢測成本低的果汁中耐熱菌的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白-酶聯(lián)免 疫吸附檢測方法。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是它由下述步驟組成1、捕集樣品中耐熱菌取待檢果汁樣品，用無菌水稀釋10倍，用針筒式濾器過濾捕集耐熱菌，濾膜直徑 為25mm，膜孔徑為0. 22 μ m，將耐熱菌截留于濾膜表面。2、耐熱菌的增菌培養(yǎng)將截留有耐熱菌的濾膜轉(zhuǎn)入裝有50mL402培養(yǎng)基的三角瓶中增菌培養(yǎng)至少13小 時，得到增菌培養(yǎng)液。上述的402 培養(yǎng)基配制方法為取 0. 2g (NH4)2SO4^O. 25g CaCl2 ·2Η20、0· 5g MgSO4, 2. Og酵母粉、5. Og葡萄糖、5. Og KH2PO4,溶于IOOOmL蒸餾水中，混勻均勻，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的H2SO4調(diào)節(jié)pH值至4. 0。3、包被酶標(biāo)板取ImL增菌培養(yǎng)液10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，傾去上層清液，沉淀用ImL包被緩沖液稀釋制備成待測樣品懸液，向酶標(biāo)板孔內(nèi)加待測樣品懸液，每孔加IOOyL;同時設(shè) 陽性對照和陰性對照，用包被緩沖液稀釋人工培養(yǎng)的耐熱菌至濃度為IX IO5 1乂108個/ mL為陽性對照耐熱菌菌懸液，用包被緩沖液作為陰性對照液，置于烘箱中60°C烘干2小時， 用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖 溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。上述的包被緩沖液為物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖液或生 理鹽水或物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液或物質(zhì)的量濃度為 0. 05mol/L pH值為8. 5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液。4、封閉酶標(biāo)板向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入200 μ L封閉液，置于恒溫箱中37°C保溫封閉30 75分 鐘，取出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷 酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。上述的封閉液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的脫脂奶或質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0. 5 %的牛血清蛋白或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的牛血清蛋白。5、酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白與底物反應(yīng)向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量濃度為0. 3125 160μ g/mL的耐熱菌多克隆抗體與 稀釋至1000 8000倍的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白按體積比1 1混合的混合物200 μ L，置于 恒溫箱中37V反應(yīng)30 120分鐘，取出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度 為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡， 在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入100 μ L底物工作液，在恒溫箱中37。C反應(yīng) 5 20分鐘，加入50 μ L物質(zhì)的量濃度為2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)。上述的耐熱菌多克隆抗體的制備方法采用王峰，李建科等報道的《蘋果濃縮汁中 嗜酸耐熱菌多克隆抗體的制備及純化》(食品與發(fā)酵工業(yè)，2009年第35卷第4期，33-36頁) 的方法。上述的底物工作液的配制方法為稱取7. 16g Na2HPO4加蒸餾水定容至IOOmL, 配制成物質(zhì)的量濃度為0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液；稱取2. Ig檸檬酸加蒸餾水定容 至IOOmL,配制成物質(zhì)的量濃度為0. lmol/L的檸檬酸溶液；取25. 7mL物質(zhì)的量濃度為 0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液和24. 3mL物質(zhì)的量濃度為0. lmol/L的檸檬酸溶液，加蒸餾水 定容至IOOmL,搖勻，配制成底物緩沖液；將0. Ig 3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺用IOOmL無水 乙醇溶解，加入IOOmL底物緩沖液中，再加入400 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液，搖勻，配 制成底物工作液，底物工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。6、酶標(biāo)儀測定用酶標(biāo)儀在450nm波長測定加入待測樣品懸液的酶標(biāo)板孔即待測樣品孔、加入陽 性對照耐熱菌菌懸液的酶標(biāo)板孔即陽性對照孔、加入陰性對照液的酶標(biāo)板孔即陰性對照孔 的光密度值，即OD值，按⑴式計算P/N值P/N =(樣品孔或陽性對照孔OD值-陰性對照孔OD值)/陰性對照孔OD值⑴ 式中P為樣品孔OD值或陽性對照孔OD值與陰性對照孔OD值的差值，N為陰性對照孔的OD 值，P/N > 2. 1檢出結(jié)果判定為陽性，表明樣品中有耐熱菌存在，P/N < 2. 1檢測結(jié)果判定為 陰性，表明樣品中無耐熱菌存在。
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在酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白與底物反應(yīng)步驟5中，優(yōu)選選擇向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì) 量濃度為2. 5 μ g/mL 80 μ g/mL的耐熱菌多克隆抗體與稀釋至1000 4000倍的酶標(biāo)葡 萄球菌A蛋白按體積比1 1混合的混合物200 μ L，置于恒溫箱中優(yōu)選37V反應(yīng)30 90 分鐘，取出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的 磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶 標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入100 μ L底物工作液，在恒溫箱中優(yōu)選37°C反應(yīng)10 20分鐘，加入50 μ L 物質(zhì)的量濃度為2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白與底物反應(yīng)步驟5中，最佳選擇向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì) 量濃度為 ο μ g/mL的耐熱菌多克隆抗體與稀釋至2000倍的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白按體積比 1 1混合的混合物200 μ L，置于恒溫箱中最佳37°C反應(yīng)60分鐘，取出，用吐溫-20的質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3 次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入100μ L底 物工作液，在恒溫箱中最佳37。C反應(yīng)10分鐘，加入50 μ L物質(zhì)的量濃度為2mol/L的硫酸溶 液，終止反應(yīng)。本發(fā)明與耐熱菌的ELISA快速檢測方法相比，檢測時間由24小時縮短到19小時， 提高了靈敏度，耐熱菌< 1個/10g，減少了檢測所需步驟，降低了檢測成本，可用于檢測果 汁中的耐熱菌。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1以檢測pH值為3. 5 4. 5、可溶性固形物含量為71 士 1° Brix的蘋果濃縮汁IOmL 為例，其檢測方法如下1、捕集樣品中耐熱菌取待檢的pH值為3. 5 4. 5、可溶性固形物含量為71 士 1° Brix的蘋果濃縮汁樣 品10mL，用無菌水稀釋10倍，用針筒式濾器過濾捕集耐熱菌，濾膜直徑為25mm，膜孔徑為 0. 22 μ m,將耐熱菌截留于濾膜表面。2、耐熱菌的增菌培養(yǎng)將截留有耐熱菌的濾膜轉(zhuǎn)入裝有50mL 402培養(yǎng)基的三角瓶中增菌培養(yǎng)13小時， 得到增菌培養(yǎng)液。上述的402 培養(yǎng)基的配制方法為取 0. 2g(NH4)2SO4^O. 25g CaCl2 · 2Η20、0· 5g MgSO4,2. Og酵母粉、5. Og葡萄糖、5. Og KH2PO4，溶于IOOOmL蒸餾水中，混合均勻，用質(zhì)量分 數(shù)為10^WH2SO4調(diào)節(jié)pH值至4. O03、包被酶標(biāo)板取ImL增菌培養(yǎng)液10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，傾去上層清液，沉淀用ImL包被緩 沖液稀釋制備成待測樣品懸液，向酶標(biāo)板孔內(nèi)加待測樣品懸液，每孔加IOOyL;同時設(shè)陽 性對照和陰性對照，用包被緩沖液稀釋人工培養(yǎng)的耐熱菌至濃度為1X IO7個/mL的陽性對 照耐熱菌菌懸液，用包被緩沖液作為陰性對照液，置于烘箱中60°C烘干2小時，用吐溫-20 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。上述的包被緩沖液為物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖液，也可 用生理鹽水。也可用物質(zhì)的量濃度為0. Olmol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液，還可用物 質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為8. 5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液。4、封閉酶標(biāo)板向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入200 μ L封閉液，置于恒溫箱中37°C保溫封閉60分鐘，取 出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩 沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。上述的封閉液是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶，也可用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的脫脂奶，也可 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5 %的牛血清蛋白，還可用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的牛血清蛋白。 5、酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白與底物反應(yīng)向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量濃度為10 μ g/mL的耐熱菌多克隆抗體與稀釋至2000 倍的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白按體積比1 1混合的混合物200 μ L，置于恒溫箱中37。C反應(yīng)60 分鐘，取出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的 磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶 標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入100 μ L底物工作液，在恒溫箱中37。C反應(yīng)10分鐘，加入50 μ L物質(zhì)的量 濃度為2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)。上述的底物工作液的配制方法為稱取7. 16g Na2HPO4加蒸餾水定容至IOOmL, 配制成物質(zhì)的量濃度為0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液；稱取2. Ig檸檬酸加蒸餾水定容 至IOOmL,配制成物質(zhì)的量濃度為0. lmol/L的檸檬酸溶液；取25. 7mL物質(zhì)的量濃度為 0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液和24. 3mL物質(zhì)的量濃度為0. lmol/L的檸檬酸溶液，加蒸餾水 定容至IOOmL,搖勻，配制成底物緩沖液；將0. Ig 3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺用IOOmL無水 乙醇溶解，加入IOOmL底物緩沖液中，再加入400 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液，搖勻，配 制成底物工作液，底物工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。6、酶標(biāo)儀測定用酶標(biāo)儀在450nm波長測定加入待測樣品懸液的酶標(biāo)板孔即待測樣品孔、加入陽 性對照耐熱菌菌懸液的酶標(biāo)板孔即陽性對照孔、加入陰性對照液的酶標(biāo)板孔即陰性對照孔 的光密度值，即OD值，按⑴式計算P/N值P/N =(樣品孔或陽性對照孔OD值-陰性對照孔OD值)/陰性對照孔OD值(1) 式中P為樣品孔OD值或陽性對照孔OD值與陰性對照孔OD值的差值，N為陰性對照孔的OD 值，P/N > 2. 1檢出結(jié)果判定為陽性，表明樣品中有耐熱菌存在，P/N < 2. 1檢測結(jié)果判定為 陰性，表明樣品中無耐熱菌存在。實(shí)施例2以檢測pH值為3. 5 4. 5、可溶性固形物含量為71 士 1° Brix的蘋果濃縮汁IOmL 為例，其檢測方法如下在本實(shí)施例的封閉酶標(biāo)板步驟4中，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入200 μ L封閉液，置于 恒溫箱中37°C保溫封閉30分鐘，取出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為 0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在 紗布上倒扣輕輕拍干。
在酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白與底物反應(yīng)步驟5中，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量濃度為 0.3125yg/mL的耐熱菌多克隆抗體與稀釋至8000倍的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白按體積比1 1 混合的混合物200 μ L，置于恒溫箱中37°C反應(yīng)20分鐘，取出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次 2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入100 μ L底物工作液， 在恒溫箱中37°C反應(yīng)5分鐘，加入50 μ L物質(zhì)的量濃度為2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)。 該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。其它步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3以檢測pH值為3. 5 4. 5、可溶性固形物含量為71 士 1° Brix的蘋果濃縮汁IOmL 為例，其檢測方法如下在本實(shí)施例的封閉酶標(biāo)板步驟4中，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入200 μ L封閉液，置于 恒溫箱中37°C保溫封閉75分鐘，取出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為 0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在 紗布上倒扣輕輕拍干。在酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白與底物反應(yīng)步驟5中，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量濃度為 160 μ g/mL的耐熱菌多克隆抗體與稀釋至1000倍的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白按體積比1 1 混合的混合物200 μ L，置于恒溫箱中37°C反應(yīng)120分鐘，取出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次 2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入100 μ L底物工作液， 在恒溫箱中37。C反應(yīng)20分鐘，加入50 μ L物質(zhì)的量濃度為2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)。 該步驟的其它步驟與實(shí)施例1相同。其它步驟與實(shí)施例1相同。為了確定本發(fā)明檢測步驟中的各最佳條件，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗室研究試 驗，每種實(shí)驗重復(fù)三次，實(shí)驗結(jié)果為三次重復(fù)試驗的平均值，各種試驗情況如下試驗材料與試劑濃縮蘋果汁，pH值3. 5 4. 5，可溶性固形物含量為 71 士 Γ Brix，由陜西恒興果汁有限公司以及國投中魯果汁股份有限公司提供；耐熱菌，由 發(fā)明人所在的實(shí)驗室從陜西恒興果汁飲料有限公司蘋果汁中分離并保存的菌種；耐熱菌多 克隆抗體，由發(fā)明人所在的實(shí)驗室制備及保存；大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、巨 大芽孢桿菌、黑曲霉菌及金黃色葡萄球菌，均由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗室 提供；硫酸銨(SAS)，由北京鼎國生物公司提供；酶標(biāo)牛血清蛋白，由北京博奧森生物技術(shù) 有限公司提供。試驗儀器BX41-12P02奧林巴斯顯微鏡，由澤仕光電科技(上海)有限公司生 產(chǎn)；UNICO WFJ2000型可見分光光度計，由上海龍尼柯儀器有限公司生產(chǎn)；U-3010型紫外 可見分光光度計，由日本HITACHI公司生產(chǎn)；GSP-9080-MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，由上海 博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；TGL-16G型臺式離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)； SW-CJ-IF型超凈操作臺，由蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)；HHW-21⑶-600型電熱恒溫水槽，由上 海?，攲?shí)驗設(shè)備有限公司生產(chǎn)；XW-80A漩渦混合儀，由海門市其林貝爾儀器制造有限公司 生產(chǎn)；KQ3200B型超聲波清洗機(jī)，由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；TDL-4型離心機(jī)，由上海 醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)；伯樂680型酶標(biāo)儀，由美國伯樂公司生產(chǎn)；微孔板振蕩器，由杭州奧 盛儀器有限公司生產(chǎn)；D25mm透析袋，由北京鼎國生物技術(shù)有限公司；德國Eppendorf精密微量移液器(10 100 μ L，0. 1 10 μ L，30 300 μ L)。1、確定耐熱菌的增菌培養(yǎng)時間將濃度為1個/IOmL的耐熱菌蘋果濃縮汁用無菌水稀釋至10倍，用針筒式濾器 過濾捕集耐熱菌，濾膜直徑為25mm，膜孔徑為0. 22 μ m,將耐熱菌截留于濾膜表面，將截留 有耐熱菌的濾膜轉(zhuǎn)入裝有50mL402培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)，在不同培養(yǎng)時間取增菌培養(yǎng)液lmL， 10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，傾去上層清液，沉淀分別用ImL物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH 值為9. 6的碳酸緩沖溶液制備成耐熱菌菌懸液，每孔加100 μ L，同時設(shè)陰性對照，陰性對照 用物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液，按照實(shí)施例1中步驟3至步驟 6進(jìn)行操作，并按式(1)計算P/N值，實(shí)驗及計算結(jié)果見表1。表1不同增菌培養(yǎng)時間的耐熱菌檢測結(jié)果 由表1可見，將濃度為1個/IOmL的耐熱菌培養(yǎng)13小時以上，檢測所得P/N值均 大于2. 1，培養(yǎng)時間越長，所得P/N值越大，即在實(shí)際檢測中從果汁樣品捕集耐熱菌后至少 增菌培養(yǎng)13小時以上即可檢出耐熱菌。2、確定包被緩沖液取耐熱菌，分別以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液、生 理鹽水、物質(zhì)的量濃度為O.Olmol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液、物質(zhì)的量濃度為 0. 05mol/L pH值為8. 5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖溶液制備成濃度為 1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液各100 μ L，同時設(shè)陰性對照，陰性對照分別用物質(zhì)的量濃度 為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液、生理鹽水、物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液、物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為8. 5的Tris-HCl緩沖溶液，置 于烘箱中60°C烘干2小時，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/LPH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣 輕輕拍干。按照實(shí)施例1中步驟4至步驟6進(jìn)行操作，并按式(1)計算P/N值。實(shí)驗及計算結(jié)果見表2。表2不同包被緩沖液的耐熱菌檢測結(jié)果 由表2可見，以物質(zhì)的量濃度為0.05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液或生 理鹽水或物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液或物質(zhì)的量濃度為 0. 05mol/L pH值為8. 5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液制備的耐熱菌菌懸液，P/N值均 大于2. 1，其中以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖液制備的耐熱菌菌懸 液，P/N值最大。本發(fā)明選擇以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液或 生理鹽水或物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液或物質(zhì)的量濃度為 0. 05mol/L pH值為8. 5的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液作為包被緩沖液制備耐熱菌菌 懸液，最佳為物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖液。3、陽性對照耐熱菌菌懸液濃度的選擇取耐熱菌，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液制備成濃度 分別為1 X IO5個/mL、1 X IO6個/mL、1 X IO7個/mL、1 X IO8個/mL的耐熱菌菌懸液400 μ L ； 取4塊酶標(biāo)板，分別將4份耐熱菌菌懸液加入4塊酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔加100 μ L，同時設(shè)陰 性對照，陰性對照用物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液，置于烘箱中 60°C烘干2小時，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液(PBST)沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣 輕輕拍干。按照實(shí)施例1中步驟4至步驟6進(jìn)行操作，并按式(1)計算P/N值。實(shí)驗及計 算結(jié)果見表3。表3陽性對照耐熱菌菌懸液濃度的選擇 由表3可見，耐熱菌菌懸液濃度為IX IO5 IX IO8個/mL時，P/N值均大于2. 1， 即當(dāng)耐熱菌菌懸液濃度為IXio5個/mL以上時均可檢測出樣品中存在耐熱菌。本發(fā)明選 擇陽性對照耐熱菌菌懸液濃度為IX IO5 IX IO8個/mL，最佳為lX107f/mL。4、封閉液的選擇取耐熱菌，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液制備成濃度 為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液4份每份100 μ L，取4塊酶標(biāo)板，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入 100 μ L濃度為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液，同時設(shè)陰性對照，陰性對照用物質(zhì)的量濃度 為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液，置于烘箱中60°C烘干2小時，用PBST沖洗酶標(biāo) 板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，再在紗布上倒扣輕輕拍干，再分別向酶標(biāo)板孔內(nèi)加入質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的脫脂奶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%的牛血清蛋白(BSA)、 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的牛血清蛋白作為封閉液，每孔加入200yL，置于恒溫箱中37°C保溫封閉 60分鐘，取出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4 的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。按 照實(shí)施例1中步驟5至步驟6進(jìn)行操作，并按式(1)計算P/N值，實(shí)驗及計算結(jié)果見表4。表4封閉液的選擇 由表4可見，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %的脫脂奶或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的脫脂奶或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.5%的牛血清蛋白或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的牛血清蛋白作為封閉液，P/N值均大于2. 1，其中以 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶為封閉液時P/N值最大。本發(fā)明選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶或 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的脫脂奶或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5 %的牛血清蛋白或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的牛血清蛋 白作為封閉液，最佳為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶。5、封閉時間的選擇取耐熱菌，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液制備成濃度 為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液4份每份100 μ L，取4塊酶標(biāo)板，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入 100 μ L濃度為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液，同時設(shè)陰性對照，陰性對照用物質(zhì)的量濃度 為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液，置于烘箱中60°C烘干2小時，用PBST沖洗酶標(biāo) 板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，再向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶200 μ L，分別置于恒溫箱中37°C保溫封閉30、45、60、75分鐘，取出，用 吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶 液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。按照實(shí)施例1中 步驟5至步驟6進(jìn)行操作，并按式(1)計算P/N值，實(shí)驗及計算結(jié)果見表5。表5封閉時間的選擇 由表5可見，封閉時間為30 75分鐘時，P/N值均大于2. 1，封閉60分鐘P/N值 最大，封閉效果最好。本發(fā)明選擇封閉時間為30 75分鐘，最佳為60分鐘。6、耐熱菌多克隆抗體濃度的選擇取耐熱菌，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液制備成濃度 為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液10份每份100 μ L，取10塊酶標(biāo)板，分別向酶標(biāo)板孔內(nèi)每 孔加入100 μ L濃度為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液，同時設(shè)陰性對照，陰性對照用物質(zhì)的 量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液，置于烘箱中60°C烘干2小時，用PBST沖 洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，再向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加 入200 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶，置于恒溫箱中37°C保溫封閉60分鐘，取出，用PBST沖 洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，分別向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量濃度為160、80、40、20、10、 5,2. 5、1. 25,0. 625,0. 3125 μ g/mL的耐熱菌多克隆抗體與稀釋至2000倍的酶標(biāo)葡萄球菌A 蛋白按體積比1 1混合的混合物200 μ L，置于恒溫箱中37°C保溫反應(yīng)60分鐘，其他步驟 按照實(shí)施例1中步驟5至步驟6進(jìn)行操作，并按式(1)計算P/N值。實(shí)驗及計算結(jié)果見表 6。表6耐熱菌多克隆抗體濃度的選擇 由表6可見，耐熱菌多克隆抗體的質(zhì)量濃度為0. 3125 160 μ g/mL時，Ρ/Ν值均大 于2. 1。本發(fā)明選擇質(zhì)量濃度為0.3125 160 μ g/mL的耐熱菌多克隆抗體，最佳為IOyg/
mLo7、酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白稀釋倍數(shù)的選擇取耐熱菌，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液制備成濃度 為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液4份每份100 μ L，取4塊酶標(biāo)板，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入 100 μ L濃度為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液，同時設(shè)陰性對照，陰性對照用物質(zhì)的量濃度 為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液，置于烘箱中60°C烘干2小時，用PBST沖洗酶標(biāo) 板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，再向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶200 μ L，置于恒溫箱中37°C保溫封閉60分鐘，取出，用PBST沖洗酶標(biāo) 板3次，分別向酶標(biāo)板孔內(nèi)加入質(zhì)量濃度為10 μ g/mL的耐熱菌多克隆抗體與稀釋至1000、 2000、4000、8000倍的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白按體積比1 1混合的混合物，每孔加入200 μ L， 置于恒溫箱中37°C保溫反應(yīng)60分鐘，其他步驟按照實(shí)施例1中步驟5至步驟6進(jìn)行操作， 并按式(1)計算P/N值，實(shí)驗及計算結(jié)果見表7。表7酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白稀釋倍數(shù)的選擇 由表7可見，酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白稀釋1000 8000倍時，P/N值均大于2. 1，稀釋 2000倍時P/N值最大。本發(fā)明選擇酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白稀釋1000 8000倍，最佳為2000倍。8、耐熱菌與耐熱菌多克隆抗體反應(yīng)時間的選擇取耐熱菌，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液制備成濃度
12為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液4份每份100 μ L，取4塊酶標(biāo)板，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入 100 μ L濃度為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液，同時設(shè)陰性對照，陰性對照用物質(zhì)的量濃度 為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液，置于烘箱中60°C烘干2小時，用PBST沖洗酶 標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，再向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶200 μ L，置于恒溫箱中37°C保溫封閉60分鐘，取出，用PBST沖洗酶 標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量濃度為10 μ g/mL的耐熱菌多克隆 抗體與稀釋至2000倍的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白按體積比1 1混合的混合物200 μ L，分別 置于恒溫箱中37°C保溫反應(yīng)30、60、90、120分鐘，其他步驟按照實(shí)施例1中步驟5至步驟6 進(jìn)行操作，并按式(1)計算P/N值，實(shí)驗及計算結(jié)果見表8。表8耐熱菌與耐熱菌多克隆抗體反應(yīng)時間的選擇 由表8可見，耐熱菌與耐熱菌多克隆抗體反應(yīng)30 120分鐘，P/N值均大于2. 1， 60分鐘時P/N值最大。本發(fā)明選擇耐熱菌與耐熱菌多克隆抗體反應(yīng)30 120分鐘，最佳為 60分鐘。9、底物工作液反應(yīng)時間的選擇取耐熱菌，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液制備成濃度 為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液4份每份100 μ L，取4塊酶標(biāo)板，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入 100 μ L濃度為1 X IO7個/mL的耐熱菌菌懸液，同時設(shè)陰性對照，陰性對照用物質(zhì)的量濃度 為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液，置于烘箱中60°C烘干2小時，用PBST沖洗酶標(biāo) 板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，再向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶200 μ L，置于恒溫箱中37°C保溫封閉60分鐘，取出，用PBST沖洗酶標(biāo) 板3次，每次2 3分鐘，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量濃度為10 μ g/mL的耐熱菌多克隆抗 體與稀釋至2000倍的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白按體積比1 1混合的混合物200 μ L，置于恒溫 箱中37°C保溫反應(yīng)60分鐘，取出，用PBST沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，向酶標(biāo)板孔內(nèi) 每孔加入100 μ L底物工作液，分別置于37°C恒溫箱中保溫反應(yīng)5、10、15、20分鐘，向酶標(biāo)板 孔內(nèi)每孔加入50 μ L物質(zhì)的量濃度為2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波 長測定OD值，按式⑴計算P/N值。實(shí)驗及計算結(jié)果見表9。表9底物工作液反應(yīng)時間的選擇 由表9可見，底物工作液反應(yīng)時間5 20分鐘，P/N值均大于2. 1，10分鐘時P/N 值最大。本發(fā)明選擇底物反應(yīng)時間為5 20分鐘，最佳為10分鐘。為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用本發(fā)明實(shí)施例1的方法測試蘋果汁中耐 熱菌的檢出限、特異性試驗以及重復(fù)性試驗，并與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計數(shù)法(KFL法)的測試結(jié) 果進(jìn)行了比較，各種試驗情況如下1、特異性試驗分別取耐熱菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、黑曲霉菌、金黃色葡萄球 菌，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液制備成濃度為1 X IO7個/mL 的菌懸液，按照實(shí)施例1中步驟3至步驟6進(jìn)行操作，并按式(1)計算P/N值。實(shí)驗及計算結(jié)果見表10。表10特異性試驗 由表10可見，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、黑曲霉菌及金黃色葡萄 球菌制備的菌懸液，ρ/Ν值均低于2. 1，為陰性；而以耐熱菌制備的菌懸液，P/N值為27，呈 強(qiáng)陽性，說明本發(fā)明與果汁中除耐熱菌之外的其他常見菌無交叉反應(yīng)，特異性良好。2、重復(fù)性試驗(1)板內(nèi)重復(fù)試驗按照實(shí)施例1的方法，重復(fù)實(shí)驗4次，測試4塊用耐熱菌包被的酶標(biāo)板，計算板內(nèi) 變異系數(shù)，實(shí)驗及計算結(jié)果見表11。
表11板內(nèi)重復(fù)性試驗 (2)板間重復(fù)性試驗按照實(shí)施例1的方法，重復(fù)實(shí)驗5次，測試5塊用耐熱菌包被的酶標(biāo)板，計算板間 變異系數(shù)，實(shí)驗及計算結(jié)果見表12所示。表12板間重復(fù)性試驗 由表10和11可見，本發(fā)明板內(nèi)變異系數(shù)及板間變異系數(shù)均小于10%，說明本發(fā)明
重復(fù)性較好。3、對耐熱菌人工培養(yǎng)樣品的檢出限驗證取人工培養(yǎng)的耐熱菌，以物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液 分別制備成濃度為 5 X IO3 個 /mL、1 X IO4 個 /mL、5 X IO4 個 /mL、1 X IO5 個 /mL、1 X IO6 個 / mL、1 X IO7個/mL、1 X IO8個/mL、1 X IO9個/mL的耐熱菌菌懸液，同時設(shè)陰性對照，陰性對照 用物質(zhì)的量濃度為0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖溶液，按照實(shí)施例1步驟3至步驟6 進(jìn)行操作，并按式(1)計算P/N值，每個濃度設(shè)兩個平行孔，實(shí)驗及計算結(jié)果見表13。表13耐熱菌人工培養(yǎng)樣品檢出限的確定 由表13可見，當(dāng)耐熱菌菌懸液濃度高于1 X IO4個/mL時，檢測所得P/N值均大于 2. 1，呈陽性，低于1 X IO4個/mL時，P/N值均小于2. 1，呈陰性，即本發(fā)明對耐熱菌人工培養(yǎng) 樣品的檢出限為IXlO4個/mL。4、對耐熱菌人工回添果汁樣品的檢出限驗證將濃度為1 X IO4個/mL、5 X IO4個/mL、IX IO5個/mL的耐熱菌菌懸液分別回添入
滅菌果汁中，按照本發(fā)明實(shí)施例1中步驟3至步驟6進(jìn)行操作，并按式(1)計算P/N值，實(shí) 驗及計算結(jié)果見表14。表14耐熱菌人工回添果汁樣品的檢測結(jié)果 由表14可知，將濃度為1 X IO4個/mL、5 X IO4個/mL、1 X IO5個/mL的耐熱菌菌懸
液分別回添入滅菌果汁中后，采用本發(fā)明檢測，所得P/N值均大于2. 1，呈陽性，說明本發(fā)明 方法可檢測出人工回添果汁中1 X104f/mL以上含量的耐熱菌。5、對實(shí)際果汁樣品中耐熱菌的檢測限確定按照本發(fā)明實(shí)施例1中的方法和傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計數(shù)法(KFL法)檢測果汁中的耐 熱菌，實(shí)驗結(jié)果見表15。表15實(shí)際果汁樣品中耐熱菌的檢測結(jié)果 *檢測結(jié)論按< 1個/IOgAJC為合格的標(biāo)準(zhǔn)，“ + ”表示陽性，即有耐熱菌，“_”表 示陰性，即無耐熱菌。由表15可見，其中4份果汁樣品采用本發(fā)明檢測結(jié)果的P/N值分別為4. 41,5. 2、16. 13,25. 32，均大于2. 1，為陽性；而采用傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)檢測結(jié)果分別為4、9、18、29 ；另外1 份樣品傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)檢測結(jié)果為耐熱菌< 1個/10g，本發(fā)明檢測結(jié)果P/N值為0. 23，為陰 性。5份樣品采用本發(fā)明方法檢測結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)計數(shù)法完全符合，說明本發(fā)明建立的檢測 體系結(jié)果可靠，在實(shí)踐中可推廣使用。
權(quán)利要求
一種果汁中耐熱菌的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白 酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，由捕集樣品中耐熱菌、耐熱菌的增菌培養(yǎng)、包被酶標(biāo)板、封閉酶標(biāo)板、加酶標(biāo)抗體與底物反應(yīng)、酶標(biāo)儀測定組成，其特征在于所說的加酶標(biāo)抗體與底物反應(yīng)步驟為向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量濃度為0.3125～160μg/mL的耐熱菌多克隆抗體與稀釋至1000～8000倍的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白按體積比1∶1混合的混合物200μL，置于恒溫箱中37℃反應(yīng)30～120分鐘，取出，用吐溫 20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％的物質(zhì)的量濃度為0.01mol/L pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2～3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入100μL底物工作液，在恒溫箱中37℃反應(yīng)5～20分鐘，加入50μL物質(zhì)的量濃度為2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)。
2.按照權(quán)利要求1所述的果汁中耐熱菌的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白-酶聯(lián)免疫吸附檢測方 法，其特征在于在酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白與底物反應(yīng)步驟中，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量濃 度為2. 5 μ g/mL 80 μ g/mL的耐熱菌多克隆抗體與稀釋至1000 4000倍的酶標(biāo)葡萄球 菌A蛋白按體積比1 1混合的混合物200μ L，置于恒溫箱中37°C反應(yīng)30 90分鐘，取 出，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩 沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶標(biāo)板孔內(nèi) 每孔加入100 μ L底物工作液，在恒溫箱中37°C反應(yīng)10 20分鐘，加入50 μ L物質(zhì)的量濃 度為2mol/L的硫酸溶液，終止反應(yīng)。
3.按照權(quán)利要求1所述的果汁中耐熱菌的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白-酶聯(lián)免疫吸附檢測 方法，其特征在于在酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白與底物反應(yīng)步驟中，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入質(zhì)量 濃度為 ο μ g/mL的耐熱菌多克隆抗體與稀釋至2000倍的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白按體積比 1 1混合的混合物200 μ L，置于恒溫箱中37°C反應(yīng)60分鐘，取出，用吐溫_20的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為0. 05%的物質(zhì)的量濃度為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗酶標(biāo)板3次，每 次2 3分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入100 μ L底物工作 液，在恒溫箱中37。C反應(yīng)10分鐘，加入50 μ L物質(zhì)的量濃度為2mol/L的硫酸溶液，終止反 應(yīng)。
全文摘要
一種果汁中耐熱菌的酶標(biāo)葡萄球菌A蛋白-酶聯(lián)免疫吸附檢測方法，由捕集樣品中耐熱菌、耐熱菌的增菌培養(yǎng)、包被酶標(biāo)板、封閉酶標(biāo)板、加酶標(biāo)抗體與底物反應(yīng)、酶標(biāo)儀測定組成。本發(fā)明與耐熱菌的ELISA快速檢測方法相比，檢測時間由24小時縮短到19小時，提高了靈敏度，耐熱菌＜1個/10g，減少了檢測所需步驟，降低了檢測成本，可用于檢測果汁中的耐熱菌。
文檔編號G01N33/569GK101900732SQ20101024978
公開日2010年12月1日 申請日期2010年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月3日
發(fā)明者余朝舟, 李建科 申請人:陜西師范大學(xué)