專利名稱：一種分子生物傳感器及其對dna或蛋白質(zhì)進(jìn)行單分子檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速高靈敏分子生物傳感器及其對DNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行直接、實(shí)時(shí)單分子檢測的方法。
背景技術(shù)：
建立一種在單分子水平上直接進(jìn)行生物和化學(xué)活性檢測的實(shí)用平臺是工業(yè)和科研領(lǐng)域共同關(guān)注的目標(biāo)之一，因?yàn)檫@對于環(huán)境監(jiān)測、工業(yè)質(zhì)量控制以及臨床診斷等一系列的應(yīng)用都具有重要意義。為了能夠可信地檢測DNA-蛋白質(zhì)的相互作用，目前已經(jīng)發(fā)展了多種直接以及標(biāo)記的技術(shù)如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、表面等離子共振、電化學(xué)、掃描探針顯微鏡、納米粒子、微懸臂梁、碳納米管、阻抗、納米線等。但是很多現(xiàn)有的方法難以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測或者動力學(xué)的分析，一些方法面臨很高的技術(shù)要求，一些則缺乏高的靈敏度以及選擇性。因此需要進(jìn)行策略優(yōu)化，設(shè)計(jì)并且建立一種對于單個(gè)結(jié)合事件能夠進(jìn)行快速實(shí)時(shí)檢測，同時(shí)兼具靈敏度、選擇性、可逆性特征的方法體系。(l:Sander，C. et al. Science, 2000，287，1977. 2 :Liu，J.，Cao, Ζ.，Lu, Y. Chem. Rev.，2009，109，1948. 3 =Drummond, Τ. G.， Hill, Μ. G. ， Barton, J. K. Nat. Biotechnol. ,2003,21,1192. 4 =Patolsky, F. ， Zheng, G.， Lieber, C. Μ. Nat. Protoc. , 2006,1,1711. 5 :Fang, X. H. , Tan, W. H. Accounts of Chemical Research,2010,43,48. 6 :Nam, J. -Μ. , Thaxton, C.S., Mirkin, C.A. Science,2003,301, 1884. 7 Zheng, G. ,Patolsky,F. ，Cui，Y. , Wang, W. U. , Lieber, C. M. Nat. Biotechnol. 2005, 23，1294.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速高靈敏基于核酸適體的分子生物傳感器及其制備方法。本發(fā)明所提供的基于核酸適體的分子生物傳感器，包括a)至少一個(gè)單壁碳納米管晶體管器件，每個(gè)所述單壁碳納米管晶體管器件包括柵極、源極、漏極和導(dǎo)電溝道；所述導(dǎo)電溝道為單壁碳納米管，所述源極和漏極位于所述單壁碳納米管上；其中，所述單壁碳納米管被切割為兩段，形成長度為I-IOnm間隙的兩段單壁碳納米管；b)經(jīng)末端氨基修飾的核酸適體，其通過酰胺鍵與形成所述間隙的碳納米管的兩端連接；所述核酸適體能夠特異性識別待測分子。其中，所述柵極為含有厚度為IOO-IOOOnm 二氧化硅層的硅基底，其電阻率為 5-20ohm · cnf1 ；所述源極和漏極均由Cr電極層和設(shè)于所述Cr電極層上的Au電極層組成， 所述Cr電極層厚度為3-lOnm，所述Au電極層厚度為40-100nm ；所述源極和漏極之間的距離為5-30 μ m ；所述單壁碳納米管的直徑為l-3nm。上述單壁碳納米管晶體管器件既可以是底柵結(jié)構(gòu)也可以是頂柵結(jié)構(gòu)，但是由于底CN 102375007 A
說明書
2/10 頁 柵結(jié)構(gòu)的制備工藝相對簡單方便優(yōu)先選用。制備上述基于核酸適體的生物傳感器的方法，包括下述步驟1)構(gòu)建單壁碳納米管晶體管器件；2)對步驟1)得到的單壁碳納米管晶體管器件中的單壁碳納米管依次進(jìn)行電子束刻蝕、氧化切割，在所述單壁碳納米管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙；3)將步驟2、得到的具有納米間隙的單壁碳納米管末端羧基進(jìn)行活化，然后將經(jīng)活化的單壁碳納米管與經(jīng)末端氨基修飾的核酸適體在PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)中進(jìn)行納米間隙中的單分子共價(jià)連接，得到所述基于核酸適體的生物傳感器。上述步驟1)中單壁碳納米管晶體管器件可按照常規(guī)方法進(jìn)行構(gòu)建，具體方法如下在含有厚度為IOO-IOOOnm 二氧化硅層的高導(dǎo)性硅芯片(基底電阻率為5-20ohm ·cnT1) 基底表面，采用化學(xué)氣相沉積法制備單壁碳納米管陣列，得到的單壁碳納米管的長度為 30-10000 μ m ；在所述單壁碳納米管陣列上間隔5-30 μ m蒸鍍漏極和源極；所述漏極和源極的制備方法為在單壁碳納米管上依次蒸鍍厚度為3-lOnm的Cr電極層、厚度為40-100nm 的Au電極層。步驟幻中對具有納米間隙的單壁碳納米管末端羧基進(jìn)行活化的方法為將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有氨基耦合和活化試劑(Sulfo-NHS，EDCI)的IO-IOOmM MES緩沖溶液中浸泡8-12小時(shí)；所述MES緩沖溶液的pH值為3_10，所述MES緩沖溶液中 Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)的濃度為5-15mM，EDCI (1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)的濃度為3-10mM;步驟3)中所述PBS緩沖液的濃度為lO-lOOmM，pH 值為6-8。步驟2)中電子束刻蝕和氧化切割得到的納米間隙(I-IOnm)由于太小以至于不能通過SEM進(jìn)行表征，但是能夠使用AFM進(jìn)行直接、局域的成像表征。對本發(fā)明制備的基于核酸適體的生物傳感器進(jìn)行電學(xué)信號監(jiān)測，結(jié)果表明碳納米管的最初的半導(dǎo)體或者金屬的性質(zhì)在連接核酸適體后得以保留。另外，可將上述基于核酸適體的生物傳感器在不同的緩沖溶液中進(jìn)行處理，然后進(jìn)行電學(xué)性質(zhì)監(jiān)測，排除連接過程中離子參與導(dǎo)電的干擾。本發(fā)明還提供了上述基于核酸適體的生物傳感器在檢測DNA或蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。利用基于核酸適體的生物傳感器對DNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行單分子檢測的方法如下1)對本發(fā)明制備的基于核酸適體的生物傳感器進(jìn)行DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合與識別的電學(xué)信號檢測，同時(shí)進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)排除干擾因素；2)對本發(fā)明制備的基于核酸適體的生物傳感器進(jìn)行DNA或蛋白質(zhì)檢測的選擇性、 靈敏度以及可逆性的測試；3)根據(jù)步驟1)和幻的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定檢測條件，在微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列上實(shí)現(xiàn)生物相互作用的實(shí)時(shí)檢測。上述1)- 各步驟的確定均使用探針臺對于器件的電學(xué)信號進(jìn)行監(jiān)測，在常溫常壓下測量數(shù)據(jù)結(jié)果。當(dāng)用本發(fā)明的生物傳感器檢測Thrombin時(shí)，所用的核酸適體為 H2N- (CH2) 6-5 ‘ -TTTTTT TGG TTG GTG TGG TTG GTT TTT TT-3' -(CH2)6-NH2GSSApt-A, 其核苷酸序列如序列1所示)。
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當(dāng)用本發(fā)明的生物傳感器檢測免疫球蛋白E(IgE)時(shí)，所用的核酸適體為H2N_(CH 2) 6-5 ‘ -GCGCGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCGCGC-3 ‘ - (CH2) 6_NH2 (Apt-B,其核苷酸序列如序列3所示)。當(dāng)用本發(fā)明的生物傳感器檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)時(shí)，所用的核算適體為吐 N- (CH2) 6-5 ‘ -AUGCAGUUUGAGAAGUCGCGCAU-3 ‘ - (CH2) 6_NH2 (Apt-C,其核苷酸序列如序列 4 所示)在上述檢測方法中，步驟1)是該方法的關(guān)鍵步驟，具體的結(jié)合過程是將待測的 DNA或蛋白質(zhì)的溶液的液滴覆蓋在所述生物傳感器表面10-60min，為達(dá)到器件最大的響應(yīng)性質(zhì)，溶液需確定在最佳的PH值，核酸適體-蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用之后，用緩沖溶液(可以是PBS緩沖溶液或者Tris-HCl的溶液)沖洗干凈，氮?dú)獯蹈珊筮M(jìn)行電學(xué)信號的測量，通過電信號的變化實(shí)現(xiàn)對DNA或蛋白質(zhì)的檢測。對器件的電學(xué)信號進(jìn)行監(jiān)測后，能夠觀察到器件導(dǎo)電性質(zhì)明顯增強(qiáng)，為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性，對不同的連接器件在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明上述實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象具有一致性特征。步驟1)中觀察到的導(dǎo)電性的明顯變化來源于共價(jià)連接在電路中的局域化的單個(gè) DNA或RNA探針分子，而不是源自肖特基勢壘的改變或表面的非特異性吸附過程。為排除潛在的假相，本發(fā)明在相同的處理?xiàng)l件下進(jìn)行了兩種類型的對照實(shí)驗(yàn)。在第一類對照實(shí)驗(yàn)中發(fā)明人對原生的碳管按照上述結(jié)合過程(即按照具有納米間隙的單壁碳納米管與核酸適體的結(jié)合過程)在相同條件下進(jìn)行處理，進(jìn)行電學(xué)性質(zhì)的測量。經(jīng)過蛋白質(zhì)處理的結(jié)合過程之后，所有的SWNT器件都顯示出電阻輕微增加的趨勢，與之前文獻(xiàn)報(bào)道的在未經(jīng)切割的、表面功能化修飾DNA分子的SWNT的器件表面吸附蛋白質(zhì)分子將引起器件電流減弱的現(xiàn)象一致。該現(xiàn)象與上述基于核酸適體的生物傳感器觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反。第二類的對照實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人對于在氧氣等離子體處理階段沒有完全切斷的部分切割的SWNT器件進(jìn)行了相同的處理，依然觀察到的是與第一類對照實(shí)驗(yàn)類似但與所述基于核酸適體生物傳感器變化趨勢相反的電流變化結(jié)果。步驟2)為驗(yàn)證基于核酸適體的生物傳感器的選擇性，發(fā)明人設(shè)計(jì)了 2類重要的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。其一是對于功能化的器件實(shí)施相同的實(shí)驗(yàn)處理，但是用另外一種非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)取代特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，處理過程導(dǎo)致器件電阻明顯增加，待除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)之后，用特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)一步處理器件會觀察到與工作器件電阻減小相同的現(xiàn)象，這可以很好的驗(yàn)證該方法具有很好的選擇性。其二是將連接對照DNA分子的器件用于蛋白質(zhì)相互作用的檢測，對照DNA與待檢測的蛋白質(zhì)不存在相互作用，未發(fā)生工作器件的電阻變化，而是顯示出類似SWNT表面非特異性吸附蛋白質(zhì)引起電阻增加的結(jié)果。步驟幻中是通過改變蛋白質(zhì)的濃度來研究連接器件的靈敏度。多個(gè)基于核酸適體的生物傳感器用來檢測不同濃度的蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液處理前后，通過電學(xué)測量的I-V 曲線監(jiān)測結(jié)合過程，在不同的檢測濃度下可以得到不同器件之間一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再次證明本發(fā)明具有好的可信性與重現(xiàn)性。使用本發(fā)明基于核酸適體的生物傳感器進(jìn)行的單分子器件的生物檢測與之前檢測蛋白質(zhì)的方法相比，具有更高的檢測靈敏度，目前使用aptamer 和Thrombin的模型體系的檢測靈敏度已經(jīng)達(dá)到2. 6aM。而其他方法的檢測限分別是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)( 3pg/mL)，表面等離子共振( 10-100pg/mL)、微懸臂梁( 0. 2ng/mL)、 碳納米管( IpM)、納米線陣列( 0. 9pg/mL)等。最近有文獻(xiàn)報(bào)道(Nam,J. -Μ. ,Thaxton,C. S.，Mirkin, C. A. Science, 2003, 301,1884.)使用磁性和金納米粒子得到蛋白質(zhì)的檢測靈敏度30aM與本發(fā)明生物傳感器靈敏度結(jié)果相近，但是該方法需要標(biāo)記以及多步的化學(xué)以及生物處理。由于本發(fā)明提供的生物傳感器中只含有1個(gè)至多2個(gè)的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)， 本發(fā)明具有檢測DNA-蛋白質(zhì)相互作用的單分子靈敏度(具體見實(shí)例一所述)。步驟2、中選擇性和靈敏度檢測方法建立之后，本發(fā)明將研究器件響應(yīng)的可逆性。 可逆性的實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)DNA(或RNA)-蛋白質(zhì)相互作用的作用力的類型以及作用力的大小選擇最佳的測試方法和條件，如蛋白質(zhì)溶液的PH值等因素。連接器件在蛋白質(zhì)作用之后經(jīng)過處理可以回到初始狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)多次可逆的循環(huán)檢測。以上各步驟的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為實(shí)時(shí)的生物檢測奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。步驟3)中的實(shí)時(shí)檢測是本發(fā)明的核心之處。為了能夠更方便的進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測操作，本發(fā)明還提供了一種結(jié)合微流控技術(shù)制備 SffNT晶體管生物傳感器陣列的方法。該方法是將上述生物傳感器制備成SWNT晶體管生物傳感器陣列并引入微流道組件得到的。具體制備方法如下通過兩次光刻的方法發(fā)明人設(shè)計(jì)并制備了含有若干個(gè)(對陣列的個(gè)數(shù)沒有具體要求，為保證成功率，優(yōu)選至少50個(gè))單獨(dú)的SWNT晶體管的重復(fù)模型 (以制備79個(gè)單獨(dú)的SWNT晶體管為例，見圖5a)。該方法需要生長高密度的、電學(xué)性質(zhì)良好的超長SWNT陣列。第一步光刻是在含有SWNT陣列的硅基底上形成毫米尺寸的電極圖形，顯影后蒸鍍金屬電極(Cr/Au電極層)。為了消除肖特基勢壘改變以及蛋白質(zhì)在金屬電極表面的非特異性結(jié)合的可能性，通過電子束熱蒸鍍的方法在金屬電極表面沉積50-100nm 的二氧化硅鈍化電極。緊接著使用第二次的光刻保護(hù)SWNTs器件的中心區(qū)域電極，其余部分用氧等離子體刻蝕除去(見圖5b)。制得的器件可以通過SEM的手段進(jìn)行表征，圖如顯示的是一根碳管完全穿過電極的SEM照片，按照之前所述的單分子器件的制備步驟(步驟 2)和步驟幻，能夠在每片的79個(gè)單獨(dú)的SWNT晶體管中平均得到2個(gè)工作器件。結(jié)合微流控技術(shù)，便可以實(shí)時(shí)檢測DNA-蛋白質(zhì)的相互作用，圖5c是本發(fā)明大量制備的器件的照片， 5d顯示的是微流控測試過程中PDMS覆蓋在中心電極的微流溝道示意圖。實(shí)時(shí)檢測的操作過程中，根據(jù)步驟2)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的測量條件，首先使用緩沖溶液對器件進(jìn)行穩(wěn)定，然后向上述微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列中注入待檢測的蛋白質(zhì)溶液。在實(shí)時(shí)檢測過程中，器件在不同濃度蛋白質(zhì)溶液的刺激下可以實(shí)現(xiàn)良好的電流變化的可逆性，同時(shí)使用對照蛋白質(zhì)進(jìn)行刺激未觀察到電流的明顯變化；對照DNA分子鏈的連接器件在實(shí)時(shí)測量的條件下當(dāng)待測蛋白質(zhì)溶液通過時(shí)，電流波動可以忽略。值得強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，同一器件在不同濃度蛋白質(zhì)溶液通過時(shí)表現(xiàn)出的可逆的電流變化的數(shù)值幾乎一致，使該發(fā)明有別于之前關(guān)于碳管和納米線在檢測蛋白質(zhì)時(shí)觀察到的變化范圍與濃度有依賴關(guān)系的研究報(bào)道，成為一種獨(dú)特的研究平臺方法。實(shí)時(shí)檢測中缺乏濃度依賴性的事實(shí)證明這些器件是在單分子水平上進(jìn)行的DNA-蛋白質(zhì)相互作用的檢測。本發(fā)明是將分子電子學(xué)與生物體系相結(jié)合，利用功能化的單分子器件通過電學(xué)信號測量實(shí)現(xiàn)對DNA或者蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行直接的、實(shí)時(shí)的、具有專一選擇性與超高靈敏度檢測的可靠、實(shí)用的普適性方法。由于本方明技術(shù)上的獨(dú)特之處，必將擁有廣闊的應(yīng)用前景?？梢愿鶕?jù)特定目的可控地進(jìn)行單分子連接與功能化，在單分子水平上實(shí)現(xiàn)特定的生物活性。這些性質(zhì)有助于本發(fā)明提供的基于核酸適體的生物傳感器從事于臨床中生物活體組織的問題研究以及檢測環(huán)境中痕量的特定化學(xué)或者生物有害物質(zhì)。由于單分子器件的可靠性與重現(xiàn)性，可以在硅基底上將不同的器件集成，與目前的CMOS技術(shù)具有良好的相容性， 可以構(gòu)建對藥物開發(fā)或者其他檢測適用的低噪聲、靈活性強(qiáng)的實(shí)時(shí)檢測陣列。這種快速響應(yīng)、穩(wěn)定、直接、靈活、同時(shí)具有超高靈敏度與選擇性的響應(yīng)器件的制備，證明本發(fā)明可以成為從基因組學(xué)到蛋白質(zhì)組學(xué)中獲取信息的有力工具，成為發(fā)展更加準(zhǔn)確的分子水平上臨床及時(shí)診斷護(hù)理的新技術(shù)。本發(fā)明所提供的直接的、實(shí)時(shí)的單分子器件生物檢測普適性方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明只需將DNA分子(或RNA分子)連接在碳納米管的分子點(diǎn)電極之間得到功能化的單分子器件即可進(jìn)行生物體系中相互作用的測量，在合適的條件下達(dá)到優(yōu)良的檢測結(jié)果，無需進(jìn)行再次標(biāo)記，是一種直接的測量手段；2、本發(fā)明使用的功能化單分子器件具有很好的穩(wěn)定性，在檢測DNA(或RNA)-蛋白質(zhì)相互作用的過程中能夠快速響應(yīng)，通過電學(xué)信號的特征顯示生物體系的識別與結(jié)合作用；3、本發(fā)明的檢測方法利用的是功能化器件中的單分子位點(diǎn)進(jìn)行相互作用的識別， 具有單分子水平檢測的特征，因此與目前現(xiàn)有的方法相比，具有更高的檢測靈敏度和選擇性特征，控制合適的結(jié)合條件，可以實(shí)現(xiàn)器件的可逆性檢測；4、本發(fā)明提供了一種利用單分子器件能夠?qū)崟r(shí)檢測生物體系相互作用的方法，利用實(shí)際樣品的檢測，拓展了其應(yīng)用領(lǐng)域，可以在液相條件下對樣品進(jìn)行檢測，保持樣品天然活性，加快了實(shí)際應(yīng)用的步伐；5、本發(fā)明是一種普適性的方法，可以根據(jù)特定的目的構(gòu)建功能化的單分子器件， 在適宜的條件下進(jìn)行直接、實(shí)時(shí)、超高靈敏度與選擇性的測量，可以用于環(huán)境監(jiān)測、工業(yè)控制、臨場診斷等不同的實(shí)際領(lǐng)域。


圖1為本發(fā)明以aptamer-Thrombin體系為模型的器件檢測示意圖以及器件結(jié)構(gòu)表征以及實(shí)施例1中各步驟的電學(xué)性質(zhì)。圖2為實(shí)施例1中單分子器件檢測的性質(zhì)圖，包括選擇性、靈敏度以及可逆性實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及傳輸機(jī)制。圖3為實(shí)施例1中連接Con-A的單分子器件的對照實(shí)驗(yàn)示意圖。圖4為實(shí)施例1進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測時(shí)的器件結(jié)構(gòu)表征以及實(shí)時(shí)檢測結(jié)果。圖5為實(shí)施例1中實(shí)時(shí)檢測的器件設(shè)計(jì)以及各步驟的光學(xué)顯微鏡照片。圖6為實(shí)施例2和實(shí)施例3中結(jié)合過程的電學(xué)性質(zhì)圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不局限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明， 均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例中所涉及的DNA或RNA序列均由寶生物工程(大連)有限公司按照序列進(jìn)行合成構(gòu)建得到。實(shí)施例一單分子aptamer器件檢測Thrombin的應(yīng)用
1、制備單分子aptamer器件1)在含有厚度為300nm熱氧化層二氧化硅的高導(dǎo)性硅芯片基底上(電阻率為 5-20ohm · cnT1)，使用化學(xué)氣相沉積的方法生長高質(zhì)量的超長的碳納米管陣列，在一根單壁碳納米管(長度為7000 μ m)上間隔約20微米依次蒸鍍Cr (5nm)、Au (50nm)作為器件的源極和漏極，構(gòu)建SWNT晶體管器件；2)將步驟1)得到的SWNT器件進(jìn)行超精細(xì)的電子束刻蝕和氧化切割，在碳管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙，圖1中b圖顯示的是器件的SEM以及AFM圖片，圖中碳管的直徑 1. 2nm，納米間隙的大小是 IOnm ；3)將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有氨基耦合和活化試劑(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES緩沖溶液(pH值為4. 7，Sulfo-NHS的濃度為5mM，EDCI的濃度為IOmM) 中浸泡12小時(shí)，進(jìn)行末端羧基活化；然后將經(jīng)活化的單壁碳納米管與經(jīng)末端氨基修飾的， 濃度為10 μ M的DNA單分子鏈aptamer在PBS緩沖液(10mM，pH值為7. 2)中進(jìn)行納米間隙中的單分子共價(jià)連接，得到連接aptamer的單分子器件。設(shè)計(jì)并使用了 2種不同的DNA單分子鏈，其序列如下DH2N-(CH2) 6-5' -TTT TTT TGG TTG GTG TGG TTG GTT TTT TT-3' - (CH2) 6_NH2 (記為Apt-A，其核苷酸序列如序列1所示)，2) H2N-(CH2) 6-5' -TTT TTT TCC AM CCA ACC ACC ATT TTT TT-3' - (CH2) 6_NH2 (記為Con-A，其核苷酸序列如序列2所示)。其中Apt-A是一種中間含有15個(gè)堿基，在3'和5'進(jìn)行T7修飾，與人的 α -thrombin作用時(shí)可以形成G4結(jié)構(gòu)的單分子鏈；Con-A是中間含有15個(gè)堿基兩端經(jīng)過T7 修飾，不和α -thrombin有相互作用的對照單分子鏈。對Apt-A連接得到的器件在不同的緩沖溶液(PBS緩沖溶液pH 7. 2 ；Tris-HCl溶液，pH 8.3)中進(jìn)行電學(xué)信號測量，均沒有明顯的變化，排除離子導(dǎo)電的影響；Apt-A本身可以形成G4結(jié)構(gòu)，金屬離子K+和Mg2+可以在室溫下穩(wěn)定其構(gòu)象，由于用于連接反應(yīng)的PBS溶液中含有12mM的K+，推測連接后G4結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成，分別使用20mM的K+和Mg2+處理連接器件，未觀察到明顯變化，證實(shí)了推測的合理性?？紤]到Apt-A形成G4后的大小( 2.8nm) 以及碳管的直徑(< 3nm)，在連接器件中至多只含有1個(gè)的DNA分子。2、單分子aptamer器件檢測Hirombin的應(yīng)用1)對制備得到的單分子aptamer連接器件進(jìn)行蛋白質(zhì)Thrombin結(jié)合與識別的電學(xué)信號檢測，在最適宜的結(jié)合條件PH 8. 3下，器件經(jīng)過^OnM Thrombin的處理，電阻發(fā)生了一個(gè)數(shù)量級的明顯減小，從 300ΜΩ降至 30ΜΩ的水平。圖1中的Ic顯示的是上述器件在各狀態(tài)下的電學(xué)性質(zhì)曲線，所有的工作器件均顯示出一致的變化趨勢。同時(shí)進(jìn)行的對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了觀察到的導(dǎo)電性的明顯變化來源于共價(jià)連接在電路中的局域化的單個(gè)DNA探針分子，而不是源自肖特基勢壘的改變和表面的非特異性吸附過程；2)對制備得到的單分子aptamer連接器件進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測的選擇性、靈敏度以及可逆性的測試。器件選擇性的測試其一是使用和Thrombin的等電點(diǎn)以及分子量類似的另一種絲氨酸蛋白質(zhì)Elastase處理器件，觀察到與非特異性表面吸附情形類似的器件電阻明顯增加的現(xiàn)象，待除去Elastase之后，用Thrombin進(jìn)一步處理器件則觀察到相反的現(xiàn)象，圖2中的a圖顯示的是這一過程的電學(xué)測量結(jié)果。器件選擇性的測試其二是將連接對照DNA分子Con-A的器件用于Thrombin的檢測，結(jié)果顯示類似SWNT表面非特異性吸附的影響，如圖3所示。根據(jù)Apt-A與Thrombin結(jié)合過程中的電流變化，推測在結(jié)合過程中，不僅不會破壞G4構(gòu)象，反而使構(gòu)象固定更加穩(wěn)定，增強(qiáng)η電子的堆積，提高DNA分子的電荷傳輸。另一種可能則是G4構(gòu)象中間穩(wěn)定的鳥嘌呤為電荷傳輸提供了一條新的通道，但目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能區(qū)分這兩種結(jié)果的影響，可能是兩者的結(jié)合。圖2中的b圖顯示的是這兩種機(jī)制的示意圖。對不同的DNA單分子器件使用一系列不同濃度的Thrombin進(jìn)行處理(2. 6nM, 2. 6pM, 2. 6fM以及2. 6aM在Tris-HCl PH = 8. 3溶液中)，均顯示出良好的重現(xiàn)性，在該體系下，本發(fā)明的檢測靈敏度是2. 6aM。圖 2的c-f顯示的是這一過程的測量結(jié)果。經(jīng)過多次嘗試，發(fā)明人在pH 8. 3的條件下通過6M 鹽酸胍對于結(jié)合后的器件進(jìn)行處理，實(shí)現(xiàn)了器件的可逆性測量，得到了多次的循環(huán)測量結(jié)果，如圖2的g和h所示。3)根據(jù)以上步驟的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定測量條件，在微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列上實(shí)現(xiàn)生物相互作用的實(shí)時(shí)檢測。制備微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列具體制備方法如下1)在含有厚度為300nm熱氧化層二氧化硅的高導(dǎo)性硅芯片基底上，使用化學(xué)氣相沉積的方法生長高質(zhì)量的超長的單壁碳納米管(SWNT)的陣列；2)在含SWNT陣列的硅基底上光刻形成毫米尺寸且電極之間依次間隔為20 μ m的電極圖形，顯影之后蒸鍍金屬電極(Cr/Au電極層)。為了消除肖特基勢壘改變以及蛋白質(zhì)在金屬電極表面的非特異性結(jié)合的可能性，通過電子束熱蒸鍍的方法在金屬電極表面沉積 50-100nm的二氧化硅鈍化電極。3)緊接著使用第二次的光刻保護(hù)SWNTs器件的中心區(qū)域電極，其余部分用氧等離子體刻蝕除去(見圖5b)。制得的器件可以通過SEM的手段進(jìn)行表征，圖如顯示的是一根碳管完全穿過電極的SEM照片。4)將步驟3)得到的SWNT器件陣列進(jìn)行超精細(xì)的電子束刻蝕和氧化切割，在碳管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙。5)將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有氨基耦合和活化試劑(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES緩沖溶液(pH值為4. 7，Sulfo-NHS的濃度為5mM，EDCI的濃度為IOmM) 中浸泡12小時(shí)，進(jìn)行末端羧基活化；然后將經(jīng)活化的單壁碳納米管與經(jīng)末端氨基修飾的， 濃度為10 μ M的DNA單分子鏈aptamer (Apt-A)在PBS緩沖液(10mM，pH值為7. 2)中進(jìn)行納米間隙中的單分子共價(jià)連接，得到連接aptamer的單分子器件陣列。在每片硅基底上的79 個(gè)單獨(dú)的SWNT晶體管中平均得到2個(gè)工作器件。在上述單分子器件陣列中引入微流控組件，即得到微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列。結(jié)合微流控技術(shù)，便可以實(shí)時(shí)檢測DNA-蛋白質(zhì)的相互作用，圖5c是本發(fā)明大量制備的器件的照片，5d顯示的是微流控測試過程中 PDMS覆蓋在中心電極的微流溝道示意圖。實(shí)時(shí)檢測時(shí)，首先用緩沖溶液(Tris-HCl的溶液)對微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列器件進(jìn)行穩(wěn)定，在pH 8. 3的條件下，通過微流道組件的入口注入Thrombin溶液，對不同濃度的Thrombin (從2. 6fM到2. 6pM到2. 6nM)實(shí)時(shí)測量，得到良好的可逆的電流變化結(jié)果。進(jìn)一步使用Elastase (3. 4nM)處理該器件，未見明顯的電流變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中電流變化缺乏濃度依賴性的事實(shí)證明這些器件是在單分子水平上進(jìn)行的DNA-蛋白質(zhì)相互作用的檢測。不同濃度下電流變化的微小差異可能源于隨著蛋白質(zhì)濃度增加帶來的碳管表面的非特異性結(jié)合的增強(qiáng)以及/或者實(shí)時(shí)測量過程中器件性質(zhì)的衰減。實(shí)時(shí)檢測部分的結(jié)果在圖 4b、c的各圖中顯示。實(shí)施例2、單分子aptamer器件檢測免疫球蛋白E(IgE)的應(yīng)用免疫球蛋白E是一類具有δ鏈的親同種細(xì)胞抗體，是參與過敏性鼻炎、過敏性哮喘和濕疹等發(fā)病機(jī)制調(diào)節(jié)的主要抗體。對于IgE檢測對研究過敏性疾病具有重要的意義。1、制備單分子aptamer器件1)在含有厚度為300nm熱氧化層二氧化硅的高導(dǎo)性硅芯片基底上，使用化學(xué)氣相沉積的方法生長高質(zhì)量的超長的碳納米管陣列，在一根單壁碳納米管(長度為7000微米) 上間隔約20微米先后蒸鍍Cr (5nm)、Au (50nm)作為器件的源極和漏極，構(gòu)建SWNT晶體管器件；2)將步驟1)得到的SWNT器件進(jìn)行超精細(xì)的電子束刻蝕和氧化切割，在碳管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙；3)將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有氨基耦合和活化試劑(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES緩沖溶液(pH值為4. 7，Sulfo-NHS的濃度為5mM，EDCI的濃度為IOmM) 中浸泡12小時(shí)，進(jìn)行末端羧基活化；然后將經(jīng)活化的單壁碳納米管與經(jīng)末端氨基修飾的， 濃度為10 μ M的DNA單分子鏈aptamer在PBS緩沖液(10mM，pH值為7. 2)中進(jìn)行納米間隙中的單分子共價(jià)連接，得到連接aptamer的單分子器件。設(shè)計(jì)并使用的核酸適體的序列如下H2N-(CH2) 6-5‘ -GCGCGGGGCACGTTTATCCGTCCCTCCTAGTGGCGTGCCCCGCGC-3‘ - (CH2) 6 -NH2(Apt-B，其核苷酸序列如序列3所示)。其中Apt-B是一種能夠與免疫球蛋白E發(fā)生相互作用的核酸適體，在3'和5'進(jìn)行氨基修飾。2、單分子aptamer器件檢測免疫球蛋白E(IgE)的應(yīng)用1)對制備得到的單分子aptamer連接器件進(jìn)行蛋白質(zhì)IgE結(jié)合與識別的電學(xué)信號檢測，在最適宜的結(jié)合條件PH 7.4下，器件經(jīng)過160碰IgE的處理，電阻發(fā)生了明顯減小。 所有的工作器件均顯示出一致的變化趨勢，如圖6a所示。同時(shí)進(jìn)行的對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了觀察到的導(dǎo)電性的明顯變化來源于共價(jià)連接在電路中的局域化的單個(gè)DNA探針分子，而不是源自肖特基勢壘的改變和表面的非特異性吸附過程。2)對制備得到的單分子aptamer連接器件進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測的選擇性、靈敏度以及可逆性的測試。器件選擇性的測試是使用與連接的核酸適體無相互作用的牛血清蛋白 (BSA)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示的是與非特異性表面吸附類似的器件電阻明顯增加的現(xiàn)象，待除去 BSA之后，用IgE進(jìn)一步處理器件則觀察到相反的現(xiàn)象。對不同的DNA單分子器件使用一系列不同濃度的IgE進(jìn)行處理QnM，2pM以及2fM在PBS pH = 7. 4溶液中)，均顯示出良好的重現(xiàn)性。經(jīng)過多次嘗試，發(fā)明人在PH 7. 4的條件下通過6M鹽酸胍對于結(jié)合后的器件進(jìn)行處理，也可以實(shí)現(xiàn)如實(shí)施例1中所示的器件的可逆性測量。3)根據(jù)以上步驟的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定測量條件，在微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列上實(shí)現(xiàn)生物相互作用的實(shí)時(shí)檢測。
制備微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列的方法同實(shí)施例1，只需將核酸適體 Apt-A 替換為 Apt-B。實(shí)時(shí)檢測時(shí)，首先用緩沖溶液對器件進(jìn)行穩(wěn)定，在pH 7.4的條件下，使用不同濃度的IgE(從2fM到2pM到2nM)實(shí)時(shí)測量，得到良好的可逆的電流變化結(jié)果。進(jìn)一步使用 BSA(3nM)處理該器件，未見明顯的電流變化，實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明這些器件是在單分子水平上進(jìn)行的DNA-蛋白質(zhì)相互作用的檢測。實(shí)施例3、單分子aptamer器件檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生，在腫瘤生長擴(kuò)散過程中會直接影響VEGF的體內(nèi)含量，對于VEGF的檢測可以應(yīng)用于癌癥的診斷與治療。1、制備單分子aptamer器件1)在含有厚度為300nm熱氧化層二氧化硅的高導(dǎo)性硅芯片基底上，使用化學(xué)氣相沉積的方法生長高質(zhì)量的超長的碳納米管的陣列，在一根單壁碳納米管(長度為7000微米)上間隔約20微米先后蒸鍍Cr (5nm)、Au (50nm)作為器件的源極和漏極，構(gòu)建SWNT晶體管器件；2)將步驟1)得到的SWNT器件進(jìn)行超精細(xì)的電子束刻蝕和氧化切割，在碳管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙，圖1中b圖顯示的是器件的SEM以及AFM圖片，圖中碳管的直徑 1. 2nm，納米間隙的大小是 IOnm ；3)將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有氨基耦合和活化試劑(Sulfo-NHS， EDCI)的50mM MES緩沖溶液(pH值為4. 7，Sulfo-NHS的濃度為5mM，EDCI的濃度為IOmM) 中浸泡12小時(shí)，進(jìn)行氨基活化；然后將經(jīng)氨基活化的單壁碳納米管與經(jīng)末端氨基修飾的， 濃度為10 μ M的RNA單分子鏈aptamer在PBS緩沖液(10mM，pH值為7. 2)中進(jìn)行納米間隙中的單分子共價(jià)連接，得到連接aptamer的單分子器件。設(shè)計(jì)并使用的核酸適體的序列如下H2N- (CH2) 6-5 ‘ -AUGCA⑶UUGAGAA⑶CGCGCAU-3 ‘ - (CH2) 6_NH2 (Apt-C,其核苷酸序列如序列4所示)。其中Apt-C是一種能夠與血管內(nèi)皮生長因子發(fā)生相互作用的核酸適體， 在3'和5'進(jìn)行氨基修飾。2、單分子aptamer器件檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的應(yīng)用1)對制備得到的單分子aptamer連接器件進(jìn)行蛋白質(zhì)VEGF結(jié)合與識別的電學(xué)信號檢測，在最適宜的結(jié)合條件PH 7.4下，器件經(jīng)過104碰VEGF的處理，電阻發(fā)生了明顯減小。所有的工作器件均顯示出一致的變化趨勢，如圖6b所示。同時(shí)進(jìn)行的對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了觀察到的導(dǎo)電性的明顯變化來源于共價(jià)連接在電路中的局域化的單個(gè)RNA探針分子， 而不是源自肖特基勢壘的改變和表面的非特異性吸附過程。2)對制備得到的單分子aptamer連接器件進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測的靈敏度測試。對不同的RNA單分子器件使用一系列不同濃度的VEGF進(jìn)行處理(1. 04nM, 104pM以及1. 04fM在 PBS pH = 7. 4溶液中)，均顯示出良好的重現(xiàn)性。3)根據(jù)以上步驟的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定測量條件，在微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列上實(shí)現(xiàn)生物相互作用的實(shí)時(shí)檢測。制備微流控SWNT晶體管生物傳感器陣列的方法同實(shí)施例1，只需將核酸適體
12Apt-A替換為Apt-C。實(shí)時(shí)檢測時(shí)，首先用緩沖溶液對器件進(jìn)行穩(wěn)定，在pH 7. 4的條件下， 使用2nM的VEGF進(jìn)行實(shí)時(shí)測量，可以觀察到器件明顯的電流增加的變化趨勢。
綜上所述，本發(fā)明是一種實(shí)時(shí)的、直接的、具有良好選擇性與單分子靈敏度的，能夠可逆檢測DNA-蛋白質(zhì)相互作用的普適性方法，利用功能化的單分子器件可以根據(jù)特定檢測目的，對實(shí)際樣品進(jìn)行不同體系、專一的選擇性與超高靈敏度的實(shí)時(shí)檢測具有廣闊的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明所舉實(shí)例不能概括生物體系中眾多的相互作用，但是使用本發(fā)明所述的方法，經(jīng)過合理的分子設(shè)計(jì)與修飾，均可在單分子器件上實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高選擇性的檢測。值得一提的是，本發(fā)明在檢測兩種相互作用的物質(zhì)基礎(chǔ)上，還可以繼續(xù)引入與第二種物質(zhì)相互作用的其他物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)第三種物質(zhì)的實(shí)時(shí)檢測，如DNA-蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)體系(如 DNA-抗體-抗原)和DNA-蛋白質(zhì)-小分子體系(如DNA-鏈霉親和素-生物素)等。除了可用于蛋白質(zhì)的檢測，本發(fā)明還可以應(yīng)用于檢測和連接的單分子DNA有相互作用的DNA或者小分子。鑒于本發(fā)明廣泛的普適性與應(yīng)用性同時(shí)結(jié)合微流控的實(shí)時(shí)檢測技術(shù)，使得本發(fā)明具有廣闊的研究與應(yīng)用的價(jià)值和意義。
權(quán)利要求
1.一種基于核酸適體的生物傳感器，包括a)至少一個(gè)單壁碳納米管晶體管器件，每個(gè)所述單壁碳納米管晶體管器件包括柵極、 源極、漏極和導(dǎo)電溝道；所述導(dǎo)電溝道為單壁碳納米管，所述源極和漏極位于所述單壁碳納米管上；其中，所述單壁碳納米管被切割為兩段，形成長度為I-IOnm間隙的兩段單壁碳納米管；b)經(jīng)末端氨基修飾的核酸適體，其通過酰胺鍵與形成所述間隙的碳納米管的兩端連接；所述核酸適體能夠特異性識別待測分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物傳感器，其特征在于所述柵極為含有厚度為 IOO-IOOOnm二氧化硅層的硅基底，其電阻率為δΙΟοΙιπ ΜπΓ1 ；所述源極和漏極均由Cr電極層和設(shè)于所述Cr電極層上的Au電極層組成，所述Cr電極層厚度為3-lOnm，所述Au電極層厚度為40-100nm ；所述源極和漏極之間的距離為5_30 μ m ；所述單壁碳納米管的直徑為 l-3nm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物傳感器，其特征在于所述基于核酸適體的生物傳感器包括至少50個(gè)所述單壁碳納米管晶體管器件；所述基于核酸適體的生物傳感器還包括微流道組件，所述微流道組件至少包括樣品進(jìn)口和樣品出口的相互連通的分流式微流道。
4.制備權(quán)利要求1所述的基于核酸適體的生物傳感器的方法，包括下述步驟1)構(gòu)建單壁碳納米管晶體管器件；2)對步驟1)得到的單壁碳納米管晶體管器件中的單壁碳納米管依次進(jìn)行電子束刻蝕和氧化切割，在所述單壁碳納米管之間得到長度為I-IOnm的間隙；3)將步驟幻得到的具有納米間隙的單壁碳納米管末端羧基進(jìn)行活化，然后將活化的單壁碳納米管與經(jīng)末端氨基修飾的核酸適體在磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行納米間隙中的單分子共價(jià)連接，得到所述基于核酸適體的生物傳感器。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟3)中對具有間隙的單壁碳納米管末端羧基進(jìn)行活化的方法為將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有Sulfo-NHS和EDCI的 IO-IOOmM MES緩沖溶液中浸泡8_12小時(shí)；所述MES緩沖溶液的pH值為3_10，所述MES緩沖溶液中Sulfo-NHS的濃度為5-15mM，EDCI的濃度為3_10mM ；步驟3)中所述PBS緩沖液的濃度為lO-lOOmM，pH值為6_8。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于步驟1)中構(gòu)建單壁碳納米管晶體管器件的方法為在含有厚度為IOO-IOOOnm 二氧化硅層的硅片表面，采用化學(xué)氣相沉積法制備單壁碳納米管陣列，所述硅芯片電阻率為5-20ohm · cnT1，所述單壁碳納米管的長度為 30-10000 μ m ；在所述單壁碳納米管陣列上間隔5-30 μ m蒸鍍漏極和源極；所述漏極和源極的制備方法為在單壁碳納米管上依次蒸鍍厚度為3-lOnm的Cr電極層、厚度為40-100nm 的Au電極層。
7.制備權(quán)利要求3所述的生物傳感器的方法，包括下述步驟1)在含有厚度為IOO-IOOOnm二氧化硅層的硅片表面，采用化學(xué)氣相沉積法制備單壁碳納米管陣列，所述硅片電阻率為5-20ohm · cnT1 ；2)在步驟1)制備的含單壁碳納米管陣列的硅基底上光刻形成毫米尺寸且電極之間依次間隔為5-30 μ m的電極圖形，顯影后依次蒸鍍厚度為3-lOnm的Cr電極層和厚度為40-100nm的Au電極層；再通過電子束熱蒸鍍的方法在Au電極表面沉積50-100nm的二氧化硅鈍化電極；3)采用光刻法保護(hù)步驟幻得到的器件的中心區(qū)域電極，其余部分用氧等離子體刻蝕除去，得到單壁碳納米管晶體管陣列器件；4)對步驟幻得到的單壁碳納米管晶體管陣列器件中的單壁碳納米管依次進(jìn)行電子束刻蝕和氧化切割，在所述單壁碳納米管之間得到I-IOnm間隔的納米間隙；5)將步驟4)得到的具有納米間隙的單壁碳納米管進(jìn)行氨基活化，然后將經(jīng)氨基活化的單壁碳納米管與經(jīng)末端氨基修飾的核酸適體在PBS緩沖液中進(jìn)行納米間隙中的單分子共價(jià)連接，然后引入微流道組件，得到所述基于核酸適體的生物傳感器。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于步驟5)中對具有納米間隙的單壁碳納米管末端羧基進(jìn)行活化的方法為將具有納米間隙的單壁碳納米管在含有Sulfo-NHS和EDCI 的IO-IOOmM MES緩沖溶液中浸泡8_12小時(shí)；所述MES緩沖溶液的pH值為3_10，所述MES 緩沖溶液中Sulfo-NHS的濃度為5-15mM，EDCI的濃度為3_10mM ；步驟3)中所述PBS緩沖液的濃度為lO-lOOmM，pH值為6_8。
9.權(quán)利要求1-3中任一所述的生物傳感器在對DNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行單分子檢測中的應(yīng)用。
10.一種對DNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行單分子檢測的方法，包括下述步驟1)對權(quán)利要求1或2所述基于核酸適體的生物傳感器進(jìn)行DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合與識別的電學(xué)信號檢測，確定檢測的PH值；2)對權(quán)利要求1或2所述基于核酸適體的生物傳感器進(jìn)行DNA或蛋白質(zhì)檢測的選擇性、靈敏度以及可逆性的測試；3)根據(jù)步驟1)和2、的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定檢測條件，向權(quán)利要求3所述生物傳感器中注入待檢測的DNA或蛋白質(zhì)溶液，測量檢測過程中生物傳感器的電流變化，基于電流的變化實(shí)現(xiàn)對DNA或蛋白質(zhì)的實(shí)時(shí)檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速高靈敏分子生物傳感器及其對DNA或蛋白質(zhì)進(jìn)行單分子檢測的方法。本發(fā)明所提供的的生物傳感器，包括a)至少一個(gè)單壁碳納米管晶體管器件，所述單壁碳納米管晶體管器件包括柵極、源極、漏極和導(dǎo)電溝道；所述導(dǎo)電溝道為單壁碳納米管，該單壁碳納米管被切割為兩段，形成長度為1-10nm間隙的兩段單壁碳納米管；b)經(jīng)末端氨基修飾的核酸適體，其通過酰胺鍵與形成所述間隙的碳納米管兩端連接。本發(fā)明是將納米/分子電子學(xué)與生物體系相結(jié)合，利用功能化的單分子器件通過電學(xué)信號測量實(shí)現(xiàn)對DNA或者蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行直接的、實(shí)時(shí)的、具有專一選擇性與超高靈敏度檢測的可靠、實(shí)用的普適性方法。
文檔編號G01N27/26GK102375007SQ201010253888
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者劉松, 郭雪峰 申請人:北京大學(xué)