專利名稱：利用單抗檢測萊克多巴胺殘留的間接化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
利用單抗檢測萊克多巴胺殘留的間接化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試
劑盒
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)免疫試劑盒，尤其涉及一種萊克多巴胺的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫 檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
萊克多巴胺(Ractopamine，RAC)是一種苯乙醇胺類β 2_腎上腺素受體激動劑，可 選擇性激動平滑肌的β 2受體，臨床上主要用于治療支氣管哮喘，充血性心力衰減癥和肌肉
萎縮癥等，萊克多巴胺的結(jié)構(gòu)式如下有研究表明，動物日糧中萊克多巴胺的添加量為臨床治療量的5-10倍時，動物體 內(nèi)的營養(yǎng)成分由脂肪向肌肉轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出營養(yǎng)再分配效應，進而調(diào)控動物體營養(yǎng)代謝路徑， 增強脂肪分解代謝，促進蛋白質(zhì)合成，顯著增加胴體瘦肉率，提高飼料報酬率，對豬的效應 尤為明顯。由于萊克多巴胺在動物臟器中殘留，并通過食物鏈進入人體，人體累計攝入超過 一定值或食用了高殘留的內(nèi)臟組織，易出現(xiàn)副作用。表現(xiàn)為骨骼肌收縮增加，破壞快縮肌纖 維與慢縮肌纖維間的融合，引發(fā)肌肉震顫，四肢和面部肌肉尤為明顯等癥狀。其他中毒癥狀 包括心動過速、心率失常、腹痛、肌肉疼痛、惡心和眩暈等。除美國FDA外，世界各國均禁止 將萊克多巴胺用于生豬生產(chǎn)，尤其近年來，隨著我國政府對非法使用克倫特羅打擊力度的 加大，萊克多巴胺的非法使用日趨嚴重。萊克多巴胺殘留傳統(tǒng)的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)，微生物法，氣/質(zhì)聯(lián) 用分析法(GC-MS)，液/質(zhì)聯(lián)用分析法(LC-MS)等。雖然這些方法測定結(jié)果很精確，但由于 存在需要昂貴的儀器設備、熟練的專業(yè)人員、煩瑣費時、周期長、費用高、不能現(xiàn)場操作等缺 陷，不能滿足實際檢測工作的需求。ELISA酶聯(lián)免疫技術(shù)具有敏感、特異、快速、簡便的特點， 近年來已被應用于萊克多巴胺殘留檢測，Haasnootet等建立了阻斷ELISA方法，Shelver等 建立了間接競爭ELISA方法，國內(nèi)于洪俠等對萊克多巴胺多克隆抗體、曲勅等對萊克多巴 胺單克隆抗體進行了研究，但有關(guān)化學發(fā)光酶聯(lián)免疫(CL-ELISA)檢測方法的建立尚未見 報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種利用單抗檢測萊克多巴 胺殘留的間接化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒具有檢測靈敏度高、應用靈活、方便的特
3點ο本發(fā)明提供的利用單抗檢測萊克多巴胺殘留的間接化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，包 括盒體，設在盒體內(nèi)的酶標板和試劑；該試劑盒由下列試劑組成A、各孔包被有包被抗原即萊克多巴胺與載體蛋白的偶聯(lián)物的酶標板1塊；B、萊克多巴胺標準溶液濃度分別為 0. 01ng/mL、0. 05ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/ mL、0. 5ng/mL、0. 8ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL 各一瓶； C、酶標羊抗鼠抗體溶液辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG原液，使用時用洗滌溶液配制 成1 2000的工作濃度；D、萊克多巴胺抗體溶液人工免疫抗原免疫動物制得的單克隆抗體，使用時用洗 滌溶液稀釋成1 8000的工作濃度；E、發(fā)光溶液0. OlM魯米諾、pH = 8.8的0. OOlM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲 烷溶液和體積比3/10000的H2O2的混合液；F、洗滌溶液指含有吐溫-20體積分數(shù)0. 05%的pH = 7. 5,0. lmol/L的磷酸鹽緩 沖液；G、包被溶液1. 59g碳酸鈉和2. 53g碳酸氫鈉溶于IL水中，調(diào)節(jié)pH為9. 5 ；H、封閉溶液由IOg OVA溶于IL洗滌溶液中，再加入質(zhì)量比為0.05%的NaN3配制 而成。上述檢測萊克多巴胺殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒中所述偶聯(lián)物的載體蛋白為分子量范圍是6. 7KDa 6. SKDa的牛血清蛋白。包被酶標板的包被抗原是采用水溶性碳化亞二胺法(EDC)由萊克多巴胺與牛血 清蛋白偶合制成，純化后的抗原濃度為15mg/ml，優(yōu)選包被濃度為稀釋1 2000。制備抗體 的人工免疫原同樣由萊克多巴胺與牛血清蛋白偶合制成。所述酶標羊抗鼠抗體為辣根過氧化酶_羊抗鼠IgG原液，其稀釋倍數(shù)優(yōu)選為 1 2000。所述萊克多巴胺抗體是由萊克多巴胺與分子量范圍是6. 7KDa 6. SKDa的牛血清 蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動物制得的單克隆抗體，其濃度為5.9ng/ml.其工作濃度 優(yōu)選為稀釋1 8000。本發(fā)明中包被萊克多巴胺抗原的酶標板的制備步驟(1)微孔板采用RAC-BSA在設定的包被溶液中，以設定的濃度，在4°C中過夜反應 包被或37°C下包被2h。本發(fā)明中微孔板中所包被的RAC-OVA在堿性環(huán)境下可以很好的結(jié)合在微孔板塑 料表面上，可以經(jīng)受多次洗板，采用的包被蛋白濃度是原濃度稀釋2000倍。(2)傾去包被液，洗滌三次，拍干。(3)包被好的微孔板可以用含封閉溶液封閉，封閉液中惰性蛋白優(yōu)選0VA，需加入 NaN3防止變質(zhì)。37°C下，封閉1. 5_2h。(4)傾去封閉液，洗滌三次，拍干。待干燥后，用鋁膜真空密閉保存。本發(fā)明所述酶標羊抗鼠抗體的制備(1)羊抗鼠抗體的制備以鼠源性抗體為免疫原對無病原山羊進行免疫，得到羊 抗鼠抗體°)將得到的羊抗鼠抗體與辣根過氧化物酶，采用過碘酸鈉法進行連接。本發(fā)明中涉及的酶標羊抗兔抗體溶液優(yōu)選用洗滌溶液配制的濃度為1 2000。本發(fā)明中萊克多巴胺抗體溶液、酶標羊抗鼠抗體溶液濃度是決定本發(fā)明中萊克多 巴胺酶聯(lián)免疫測試試劑盒測定范圍及靈敏度的重要因素。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明應用化學發(fā)光與酶聯(lián)免疫結(jié)合，成功的合成了免疫原，得到了萊克多巴胺 的單克隆抗體，建立了一種檢測萊克多巴胺殘留的新的試劑盒。由于應用的是單克隆抗體 和發(fā)光法，化學發(fā)光酶聯(lián)免疫法具有比普通的ELISA更高的靈敏度和特異性。具有靈敏度 高、簡便快速、準確的特點，與傳統(tǒng)的比色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個數(shù)量級。能夠 在檢測動物性食品(如奶、動物組織、尿樣)中萊克多巴胺的殘留發(fā)揮重要作用。

圖1為本發(fā)明的萊克多巴胺包被抗原的合成方案。圖2為本發(fā)明萊克多巴胺抗體的抑制率曲線。圖3為本發(fā)明的萊克多巴胺工作曲線。
具體實施方式實施例1、檢測萊克多巴胺試劑盒的組分及制備過程1、檢測萊克多巴胺的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的組成A、包被有包被抗原(萊克多巴胺與載體蛋白的偶聯(lián)物)的固相載體(酶標板)；B、萊克多巴胺標準溶液0. 01ng/mL、0. 05ng/mL、0. Ing/mL、lng/mL、5ng/mL、IOng/
mLoC、酶標羊抗鼠抗體溶液酶標羊抗鼠抗體為辣根過氧化酶-羊抗兔IgG原液，裝 入，使用時用洗滌溶液配制成1 2000的工作濃度。D、萊克多巴胺抗體溶液用人工免疫抗原免疫動物制備所得的單克隆抗體，將所 得萊克多巴胺抗體用洗滌溶液稀釋成1 8000工作濃度。E、發(fā)光溶液使用pH8. 8的0. 0001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液配制 成0. OlM的魯米諾溶液，再與H2O2按照3 10000的體積比混合。F、洗滌溶液含有體積分數(shù)0. 05%吐溫-20的pH7. 5,0. lmol/L磷酸鹽緩沖液。G、包被溶液1. 59g碳酸鈉和2. 53g碳酸氫鈉溶于IL水中，調(diào)節(jié)pH9. 5。H、封閉溶液配制10g卵清蛋白(OVA)溶于IL洗滌溶液中，再加入重量比為 0. 05% 的 NaN3。2、酶標板的制備用包被液將包被抗原稀釋1 2000，每孔加入IOOyLdO過夜，傾去包被液，每孔 加入250 μ L洗滌液洗滌3次，拍干，然后每孔加入封閉液250 μ L，37°C孵育lh，傾去孔內(nèi)液 體，洗滌液洗滌3次，拍干，用錫箔紙真空密封保存。3、抗原的合成(1)免疫原的合成IOmg的BSA溶于0. 5mL雙蒸水中，用1. Omol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到10. 8，
5加入22mol/L的BDE溶液50L，在氮氣保護下，室溫攪拌反應22h。17mg (50btmol) RAC-HCl 加入到0. 5mL 0. 511101/1的氫氧化鈉溶液中，加入5(^1^ DMF助溶。然后在冰浴中將此溶液 緩慢加入到活化的BSA溶液中，氮氣保護下室溫攪拌反應22h。反應產(chǎn)物于4°C冰箱中用 PBS透析3d，所得偶聯(lián)物RAC-BSA中加入0. 疊氮鈉，_20°C儲存?zhèn)溆谩?2)包被抗原的合成取1. 36g(2Xl(T5mol)BSA，溶于 30ml 水或常規(guī) I3BS 中，加入 0.3g(100X2X10_5mol)對醛基本甲酸。0_4°C攪拌過夜反應。離心取上清，用PBS透析。 向透析后得上清液中加入0.4g(60X2X I(T5m0I)鹽酸萊克多巴胺。攪拌溶解后，加入 0. 115g(30X2X10_5mol)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，4°C攪拌反應4小時。離心，上清透析，加 1 % NaN3置于0 4°C冷藏備用。4、萊克多巴胺單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/C小鼠做免疫組以合成的RAC-BSA免疫抗原(加佐劑) 分別對每組小鼠進行免疫，每次每只的免疫劑量為100 μ g，每次免疫間隔兩周，一共免疫4 次。最后用同樣劑量的免疫原(不加佐劑)進行強化免疫。根據(jù)檢測結(jié)果挑選效價最高的小鼠進行細胞融合。取小鼠脾細胞，按7 1比例 (數(shù)量配比)與SP2/0骨髓細胞融合。根據(jù)觀察，當融合細胞克隆達1/3 1/2培養(yǎng)孔的 面積，對有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進行抗體檢測。用間接ELISA方法進行初步篩選陽性孔。 采用有限稀釋法進行陽性雜交瘤的克隆化，將細胞懸液連續(xù)稀釋至統(tǒng)計上每孔加樣僅含單 個細胞，接種到96孔培養(yǎng)板，通過ELISA篩選出單個細胞繁殖形成的陽性雜交瘤細胞克隆。 將24孔板中擴大培養(yǎng)的陽性雜交瘤細胞株，進一步在5mL，IOmL, 50mL培養(yǎng)瓶中逐步擴大培 養(yǎng)。除一部分用于腹水的制備之外，其余細胞凍存?zhèn)溆谩Ｈ? 10周齡的BALB/c小鼠，以0. 5mL/只的量用液體石蠟注入小鼠腹腔，IOd 于腹腔內(nèi)注射單克隆雜交瘤細胞株5X IO7個/只。7d后觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待小鼠 腹部明顯膨大，抽取腹水。收集的腹水置于離心管中，1500r/min離心30min。取上清，用辛 酸_飽和硫酸銨法對腹水進行純化，得到單克隆抗體，-20°C保存?zhèn)溆?。實施?、間接CL-ELISA檢測方法的建立(1)抗體與包被抗原濃度的優(yōu)選(方陣)用包被緩沖液溶解的包被抗原鍍盤從首行稀釋度1/10開始縱向梯度稀釋， 100 μ L/孔，37°C孵育2h ；洗盤五次；封閉，300 μ L/孔，0_4°C，過夜；鍍抗體從首列1/100 開始橫向梯度稀釋(見表一)，100yL/孔，37°C孵育2h ；酶標稀釋度用1/2000，100 μ L/孔 鍍盤37°C，50分鐘；加發(fā)光底物溶液每孔加入100 μ L的發(fā)光底物溶液，3 5分鐘后檢 測。選出最佳包被和抗體的配比，再用此包被濃度鍍盤，抗體橫向稀釋，酶標縱向稀釋，同理 選出抗體和酶標的最佳配比。(2)化學發(fā)光ELISA法測萊克多巴胺單克隆抗體的特異性根據(jù)上述對抗體及包被抗原濃度的優(yōu)選實驗，申請人選擇并確定抗體濃度為 1 8000，包被抗原濃度為1 2000進行抗體的靈敏度的測定包被用0. 05Μ ρΗ9. 6的碳酸鹽包被緩沖液將已知包被抗原稀釋至一定濃度，在 每個聚苯乙烯板的反應孔中加100 μ L/孔，4°C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗 3次，300 μ L/孔，每次5分鐘。(簡稱洗滌，下同)。
封閉用PBST+1 % OVA封閉上述已包被的酶標板，250 μ L/孔，室溫孵育2 4小 時，然后洗滌。加樣加一定稀釋的待檢樣品(抗體和半抗原)100yL/孔于上述已封閉的反應孔 中，置37°C孵育1小時或室溫2 4小時，然后洗滌。加酶標抗體加入新鮮稀釋的酶標二抗100 μ L/孔。37°C孵育0. 5 1小時或室 溫1 2小時，洗滌。加發(fā)光底物溶液每孔加入IOOul的發(fā)光底物溶液，3 5分鐘后檢測。測定結(jié)果 由陰性對照孔校正。萊克多巴胺自身對抗體的抑制率，計算公式如下抑制率％=加入競爭物的孔的 發(fā)光值/不含競爭物的孔的發(fā)光值X100%。計算50%抑制率時藥物的濃度即為該抗體的靈敏度。實施例3、檢測萊克多巴胺的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒的應用(1)試劑的配制A、樣品稀釋液將試劑盒中提供的濃縮磷酸鹽緩沖溶液用蒸餾水稀釋10倍后使用。B、洗滌溶液將試劑盒中提供的濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋10倍后使用。C、發(fā)光溶液0. OlM魯米諾+0. OOlM對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液 (ρΗ8· 8)+3/10000 (體積比)H2O2。(2)樣品前處理Α、尿液收集到的豬尿樣品必須是澄清的，若有雜質(zhì)，4°C離心15min，取上清液。B、動物組織取樣品與4mL 0. IM的鹽酸混合，并且放在一起用超生波提取20min， 然后IOOOOg離心15min，取上清液用IOM NaOH調(diào)pH至9. 5士0. 5，旋渦振蕩5min，然后 IOOOOg離心15min。取上清液加5mL異丁醇振蕩2min，混合物室溫下靜止15min，然后3000g 離心lOmin，分出有機相，水相再用異丁醇(每次IOmL)萃取兩次，三次萃取的有機相合并在 一起，50-60°C水浴減壓蒸干，殘余物用洗滌液重新溶解配成1 10的溶液，得到待測樣品。(3)檢測步驟A、加樣向酶標板微孔中加入萊克多巴胺系列標準濃度溶液或樣品溶液50 μ L， 然后加入萊克多巴胺抗體溶液50μ L，37°C恒溫孵育1. 5h ；B、洗滌傾出孔中液體，每孔加入洗滌溶液250 μ L，洗滌3次，拍干；C、加酶標羊抗鼠抗體溶液每孔加入酶標羊抗兔抗體溶液100 μ L，37°C孵育Ih ；D、洗滌傾出孔中液體，每孔加入洗滌溶液250 μ L，洗滌3次，拍干；Ε、加發(fā)光溶液每孔加入發(fā)光溶液100 μ L ；F、檢測用化學發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強度。(4)結(jié)果判斷所獲得的標準品和樣品發(fā)光值的平均值除以第一個標準(O標準)的發(fā)光值再乘 以100，以抑制率為縱坐標，萊克多巴胺濃度的對數(shù)為橫坐標作標準曲線，每一個樣品的濃 度可以從標準曲線上讀出。%抑制率標準品發(fā)光值(或樣品)/O標準品發(fā)光值。實施例4、試劑盒精密度和準確度試驗
取0. 2，0. 5，0. 8，1，2ppb的萊克多巴胺標樣，添加到雞肉樣品中，來檢測萊克多巴 胺回收率。每個濃度的批間變異系數(shù)都以不同的5天的5個重復數(shù)據(jù)進行計算，批內(nèi)變異 系數(shù)以同一天的5次重復數(shù)據(jù)計算。根據(jù)制定的標準曲線的線性方程進行回收率的定量計算。結(jié)果見下表。表一
權(quán)利要求
一種利用單抗檢測萊克多巴胺殘留的間接化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征是該試劑盒由下列試劑組成A.各孔包被有包被抗原即萊克多巴胺與載體蛋白的偶聯(lián)物的酶標板1塊；B.萊克多巴胺標準溶液濃度分別為0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL各一瓶；C.酶標羊抗鼠抗體溶液辣根過氧化酶 羊抗鼠IgG原液，使用時用洗滌溶液配制成1∶2000的工作濃度；D.萊克多巴胺抗體溶液人工免疫抗原免疫動物制得的單克隆抗體，使用時用洗滌溶液稀釋成1∶8000的工作濃度；E.發(fā)光溶液0.01M魯米諾、pH＝8.8的0.001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液和體積比3/10000的H2O2的混合液；F.洗滌溶液指含有吐溫 20體積分數(shù)0.05％的pH＝7.5、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液；G.包被溶液1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于1L水中，調(diào)節(jié)pH為9.5；H.封閉溶液由10g OVA溶于1L洗滌溶液中，再加入質(zhì)量比為0.05％的NaN3配制而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述偶聯(lián)物的載體蛋白為分子量范圍 是6. 7KDa 6. 8KDa的牛血清蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于包被酶標板的包被抗原由萊克多巴胺 與牛血清蛋白偶合制成，制備抗體的人工免疫原由萊克多巴胺與牛血清蛋白偶合制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述包被抗原濃度由純化后濃度為 15mg/ml的抗原稀釋1 2000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述萊克多巴胺抗體是由萊克多巴胺 與分子量范圍是6. 7KDa 6. SKDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動物制得的單 克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述檢測方法是將化學發(fā)光與間接酶 聯(lián)免疫法結(jié)合的一種新方法。
全文摘要
一種利用單抗檢測萊克多巴胺殘留的間接化學發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒。包括各孔包被有以萊克多巴胺與牛血清蛋白偶合制成的包被抗原的酶標板以及萊克多巴胺系列標準溶液、酶標羊抗鼠抗體溶液、萊克多巴胺抗體溶液、發(fā)光溶液、洗滌溶液、包被溶液及封閉溶液。本發(fā)明的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測試劑盒利用單克隆抗體進行化學發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測，IC50＝0.6ng/ml。在雞肉樣品中最低檢測限為0.10ng/ml，批間批內(nèi)變異系數(shù)＜13％，回收率為88～114％。本發(fā)明應用單克隆抗體并將化學發(fā)光與間接酶聯(lián)免疫法結(jié)合，建立了一種檢測萊克多巴胺殘留的新的體系，具有比普通的ELISA更高的靈敏度和特異性，能夠在動物性食品(如奶、動物組織、尿樣)中的萊克多巴胺殘留檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N21/76GK101949933SQ20101026201
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者孟萌, 張元陽, 張?zhí)? 徐靜, 王亞賓, 薛虎寅, 郗日沫 申請人:南開大學