專利名稱：一種檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體的試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及羊駝副結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium paratuberculosis, MAP)的 hed(Host expression dependent)蛋白間接ELISA檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羊駝原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈，與駝羊、駱馬、原駝共同屬于美洲駝屬，被稱為南 美小型駝。駝絨有22種天然色，是高級(jí)毛紡原料，具有“軟黃金”之稱；其皮可制成地毯、 被子等；其肉蛋白質(zhì)含量高，味道鮮美。羊駝是一種很有市場(chǎng)前景的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，我國(guó)山西于 2000年首次從澳大利亞引進(jìn)羊駝，隨后在新疆維吾爾自治區(qū)等地區(qū)也先后引進(jìn)羊駝，為我 國(guó)農(nóng)牧民增收增添了新的亮點(diǎn)。羊駝副結(jié)核病是由副結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium paratuberculosis, MAP)引 起的羊駝的一種慢性傳染性腸炎，羊駝價(jià)格昂貴，一旦羊駝牧場(chǎng)被大面積傳染該病，造成的 經(jīng)濟(jì)損失將是巨大的。副結(jié)核病的檢測(cè)常采用皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等，但是皮內(nèi)變 態(tài)反應(yīng)需要檢測(cè)活動(dòng)物，且靈敏度較低；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)靈敏度較低，且檢測(cè)很不方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體的試劑盒及其檢測(cè)方法， 該檢測(cè)方法特異性高，靈敏度高，方便，快速，適合大規(guī)模樣品檢測(cè)。本發(fā)明提供一種檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體的試劑盒，包含下列試劑(1)、副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白；(2)、羊駝副結(jié)核陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清。所述試劑盒還可以包含酶標(biāo)板、包被液、封閉液、PBST、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的金 黃色葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA)、顯色液配制原料和終止液；所述包被液是濃度為lmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH 7. 5 ；所述封閉液是質(zhì)量濃度為2%的明膠溶液；所述PBST 的組成是=Na2HPO4 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L, NaCl 8. 0g/L, KCl 0. 2g/L, Tween-20體積濃度為0. 05%，其pH為7. 4 ；所述顯色液配制原料包括①由Na2HPO4 ·12Η20 18. 408g/L，檸檬酸5. 106g/L組成 的磷酸鹽_檸檬酸鹽緩沖液，PH 5. 0 ；②鄰苯二胺；③體積濃度為30%的H2O2水溶液；所述終止液是濃度為2mol/L的H2SO4溶液。本發(fā)明還提供采用上述試劑盒檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體的方法，按如下步 驟(1)、包被副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白用包被液稀釋至3. 75 μ g/mL,于酶標(biāo)板 各孔中分別加入100 μ L，4°C包被過(guò)夜，用PBST洗滌5次；(2)、封閉每孔加入300 μ L封閉液，4°C封閉過(guò)夜，用PBST洗滌5次；
(3)、加入待檢樣品以PBST分別將陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、待檢血清按體 積1 50稀釋，每孔中加入100yL，37°C孵育60min，用PBST洗滌5次；(4)、加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的金黃色葡萄球菌蛋白A 用PBST將辣根過(guò)氧化物 酶標(biāo)記的金黃色葡萄球菌蛋白A作1 5000稀釋，每孔中加入100yL，37°C孵育60min，用 PBST洗滌5次；(5)、配制并加入顯色液臨顯色之前向所述磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中加入鄰苯 二胺，使鄰苯二胺濃度達(dá)到0. 4g/L，然后加入所述的H2O2水溶液0. 15mL,即獲得顯色液；每 孔加入該顯色液100μ L，37°C避光孵育15min ；(6)、終止每孔加入100 μ L終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的OD49tlnm值；(7)、判定待檢血清孔的OD49tlnm值彡陰性對(duì)照血清孔的OD49tlnm值+0. 24，判為陽(yáng)性； 反之判為陰性。本發(fā)明提供的檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體的試劑盒，引入了特異性強(qiáng)、且高效 表達(dá)的副結(jié)核分支桿菌hed蛋白，用它作為檢測(cè)抗原，直接檢測(cè)羊駝抗副結(jié)核分支桿菌抗 體，具有良好的特異性和靈敏度。用本試劑盒檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體方法簡(jiǎn)便、快速 且準(zhǔn)確，適合大批量樣品檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白的制備1.引物設(shè)計(jì)從GenBank上調(diào)取MAP的基因序列(X16293)，用DNAStar軟件分析 hed (Host expression d印endent)基因的抗原性，選取抗原性較好的840bp片斷作 為擴(kuò)增目的基因，上游引物Pl :5，-ATAGGATCCGGTAGTTACCGCGGCGAA-3’，下游引物P2 5’ -CGCAAGCTTTTAGGTGTGGCGTT TTC-3，，限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為 BamH I 和 Hind III。2. hed基因的擴(kuò)增、克隆提取副結(jié)核分支桿菌K-IO的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用50 μ L體系體積 IOXEx Taq Buffer 5 μ L, dNTPs (IOmM) 4 μ L，Mg2+(25mM) 4 μ L，TaKaRaEx Taq 酶(5U/ μ L)0. 3 μ L，上游引物 Pl (20pmol/L) 1 μ L，下游引物 P2(20pmol/L) 1 μ L，超純水 32. 7 μ L， 模板DNA2y L。反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min，94°C 45s, 57°C 45s, 72°C 45s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳、回收后，克隆至pGEM-T，獲得重組質(zhì)粒pGEM-T-hed。按照堿裂解 法提取重組質(zhì)粒，BamH I和Hind III雙酶切后電泳，回收大小為840bp的特異性目的片段， 與重組載體pET-32a(+)用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)按照說(shuō)明書的條件進(jìn)行連接，按照 常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E. coli BL21(DE3)中，篩選到陽(yáng)性表達(dá)質(zhì)粒(pET-32a-hed)。 對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-hed進(jìn)行PCR擴(kuò)增、BamH I和Hind III雙酶切，電泳后在大小約為 840bp處均出現(xiàn)特異性條帶。對(duì)表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-hed進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果經(jīng)DNAStar軟件分析 發(fā)現(xiàn)，PCR擴(kuò)增片段與X16293序列同源性為99. 5%，推導(dǎo)的氨基酸序列與已報(bào)道的氨基酸 序列相同。3.副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白的表達(dá)及純化將含有表達(dá)質(zhì)粒pET-32a_hed的E. coli BL21 (DE3)于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期(OD6tltlmin為0. 6-0. 8)，加入IPTG至濃度為0. 8mM,誘導(dǎo)4h后離心，菌體沉淀用PBS緩沖液重懸，超聲裂解后離心，沉淀用6M的尿素溶液溶解，離心，上清用0. 45 μ m微孔濾膜過(guò)濾 后，用His Bind Purification Kit (Novagen公司)按照說(shuō)明書的方法純化副結(jié)核分支桿 菌重組hed蛋白。純化的重組蛋白用SDS-PAGE電泳分析，觀察到約49. 5kD的特異性蛋白 條帶，大小與預(yù)計(jì)相似，說(shuō)明純化的副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白的純度較好。實(shí)施例2鑒定副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白的反應(yīng)原性和免疫原性1.免疫轉(zhuǎn)印將實(shí)施例1純化的重組hed蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，凝膠用半干轉(zhuǎn)印儀 (Bio-Rad)電轉(zhuǎn)印至PVNF膜(Osmonics公司)。將轉(zhuǎn)印后的PVNF膜用1% (m/v)牛血清 白蛋白封閉，加入1 100稀釋的羊抗副結(jié)核陽(yáng)性血清(中國(guó)獸藥監(jiān)察所)，37°C作用1.5h 后洗膜；加入1 10000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊IgG，37°C作用Ih后 洗膜；用3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5min后，顯示單一的特異性條帶，大小與重組蛋白 相似，說(shuō)明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。2.小鼠免疫試驗(yàn)純化的重組hed蛋白用PBS緩沖液稀釋至400 μ g/mL，加入等量的弗氏完全佐劑 (GIBC0公司)乳化，腹部皮下注射4周齡清潔級(jí)雄性小鼠，0. 2mL/只，共10只，每2周加強(qiáng) 免疫1次，共加強(qiáng)免疫2次，最后一次免疫IOd后采血分離血清，用ELISA方法檢測(cè)血清抗 體。結(jié)果顯示血清抗體效價(jià)大于1 6400，說(shuō)明重組hed蛋白具有良好的免疫原性。ELISA反應(yīng)程序?yàn)橹亟Mhed蛋白用lmol/L的Tris-HCl (pH為7. 5)稀釋至 4.4yg/mL，4°C包被過(guò)夜；2% (質(zhì)量濃度)明膠4°C封閉過(guò)夜；小鼠血清自1 100起始做 2倍倍比稀釋，加入酶標(biāo)板每孔100yL，37°C作用1. 5h ；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(辣根過(guò)氧 化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗)1 1000稀釋，37°C作用l.Oh;鄰苯二胺(OPD) 37°C避光顯色 15min ；硫酸終止反應(yīng)后，測(cè)定OD49tlnm值，然后計(jì)算抗體效價(jià)。實(shí)施例3本發(fā)明試劑盒的組成及制備檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體的試劑盒包括下列試劑(1)、副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白(制備方法見實(shí)施例1)；(2)、羊駝副結(jié)核陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清；(3)、酶標(biāo)板；(4)、包被液濃度為 lmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液，pH 7. 5 ；(5)、封閉液質(zhì)量濃度為2%的明膠溶液；(6)、PBST =Na2HPO4 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L, NaCl 8. Og/L, KCl 0. 2g/L, Tween-20 體積濃度為0. 05 %，其pH為7. 4 ；(7)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的金黃色葡萄球菌蛋白A (HRP-SPA)；(8)、顯色液配制原料①由Na2HPO4 ·12Η20 18. 408g/L，檸檬酸5. 106g/L組成的磷 酸鹽_檸檬酸鹽緩沖液，PH 5. 0 ；②鄰苯二胺；③體積濃度為30%的H2O2水溶液；(9)、終止液濃度為2mol/L的H2SO4溶液。其中，陰性對(duì)照血清的制備如下選取10頭臨床健康的青年公羊駝，用補(bǔ)體結(jié)合 試驗(yàn)和變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)均為陰性，采取血清用實(shí)施例4最終確定的間接ELISA反應(yīng)檢測(cè)，選取 OD490nm值小于0. 30、P/N值小于0. 8、阻斷試驗(yàn)OD49tlnm值無(wú)明顯變化的5份血清混合后，作為 羊駝副結(jié)核陰性對(duì)照血清。
阻斷試驗(yàn)是將待檢血清中加入過(guò)量的純化重組hed蛋白，37°C中和Ih后，用實(shí)施 例4最終確定的間接ELISA反應(yīng)檢測(cè)，比較血清處理前后OD49tlnm值有無(wú)明顯變化。羊駝副結(jié)核陽(yáng)性對(duì)照血清的制備如下副結(jié)核滅活疫苗(吉林獸醫(yī)研究所生產(chǎn)) 按照說(shuō)明書的劑量免疫健康成年羊駝2頭，首次免疫20d后加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫3次，每次 間隔15-20d，最后一次免疫20天后采血，用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和以上建立的間接ELISA方法檢 測(cè)均為陽(yáng)性。將制備的2份羊駝副結(jié)核陽(yáng)性血清等體積混勻得到羊駝混合陽(yáng)性血清。將羊 駝混合陽(yáng)性血清用以上羊駝陰性對(duì)照血清稀釋至滴度為1 400，再次用實(shí)施例4最終確定 的間接ELISA反應(yīng)檢測(cè)確認(rèn)其滴度的準(zhǔn)確性，該血清作為間接ELISA方法的陽(yáng)性對(duì)照血清。實(shí)施例4用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體_間接ELISA反應(yīng)1.方法將純化的副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白用包被液適當(dāng)稀釋后，包被酶標(biāo)板，4°C過(guò) 夜；用PBST洗滌酶標(biāo)板5次，加入封閉液(300 μ L/孔)于4°C封閉過(guò)夜，洗滌同前；將待檢 血清、陰性和陽(yáng)性對(duì)照血清用PBST稀釋至最佳濃度(100 μ L/孔)，37°C作用一定時(shí)間，洗滌 同前；加入適當(dāng)濃度的HRP-SPA，100 μ L/孔，37°C孵育一定時(shí)間，洗滌同前；加入OPD底物 顯色液，作用15min ；2mo VLH2SO4終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀讀取OD49tlmin值。2.最佳抗原、抗體濃度確定純化的重組hed蛋白用lmol/L Tris-HCl (pH 7. 5)以起始濃度為17. 6μ g/mL做2 倍倍比稀釋，羊駝抗副結(jié)核陽(yáng)性血清和陰性血清(制備方法見本實(shí)施例中標(biāo)號(hào)9)以起始濃 度為1 25做2倍倍比稀釋，采用方陣滴定法確定重組hed蛋白的包被濃度以及血清的最 佳工作濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)抗原濃度為3.75yg/mL，血清以1 50稀釋時(shí)，P/N值(陰 陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果之比)最大(為6. 23)，故將其確定為最佳的抗原包被濃度和抗體稀釋濃度。3.封閉條件的選擇采用以上步驟2確定的最佳抗原包被濃度和抗體稀釋濃度，分別以0. 1 % (質(zhì)量 濃度)BSA、2% (質(zhì)量濃度)明膠或5% (質(zhì)量濃度)脫脂乳作為封閉液，于4°C封閉過(guò)夜、 37°C封閉2h進(jìn)行間接ELISA反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)2%明膠的封閉效果好于0. 1%BSA和5%脫脂乳， 4°C孵育過(guò)夜的封閉效果明顯好于37°C孵育2h，因此確定2%明膠，4°C封閉過(guò)夜為最佳封 閉條件。4.血清最佳反應(yīng)時(shí)間的確定按照以上步驟2和3確定的最佳條件，將血清于37 °C分別孵育30min、60min、 90min、120min,進(jìn)行間接ELISA反應(yīng)。結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為60min時(shí)，Ρ/Ν值最高，確定 最佳血清反應(yīng)時(shí)間為60min。5.酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度和作用時(shí)間的選擇按照以上步驟2、3、4確定的最佳條件，將HRP-SPA分別作1 1000，1 5000， 1 10000稀釋，并使各稀釋度的酶標(biāo)SPA分別于37°C作用30min、60min、90min、120min,按 間接ELISA程序進(jìn)行。當(dāng)HRP-SPA稀釋度為1 5000，作用時(shí)間為60min時(shí)，P/N值最大， 即反應(yīng)效果最佳。6.底物作用時(shí)間的確定按照以上步驟2-5確定的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行間接ELISA反應(yīng)，加入底物顯色液后 分別于37°C避光孵育5min、10min、15min、20min終止反應(yīng)，比較效果。結(jié)果顯示，37°C避光顯色15min，Ρ/Ν值最高。7.結(jié)果判定取30份健康羊駝血清，將其1 50稀釋，按照以上步驟2-6確定的最佳反應(yīng)條件 進(jìn)行測(cè)定，這些血清數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到OD49tlnm平均值X和標(biāo)準(zhǔn)差S。發(fā)現(xiàn)血清OD49tlnm 值最高為0. 38，最低為0. 17，平均值為0. 25，標(biāo)準(zhǔn)方差S為0. 08。判定方法設(shè)定為血清樣 品OD490nm值彡陰性血清OD490nm值+0. 24 (即3S)，且該樣品的Ρ/Ν彡2. 5，判為陽(yáng)性；反之判 為陰性。因此，最終確定的間接ELISA反應(yīng)過(guò)程(1)、包被副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白用包被液稀釋至3. 75 μ g/mL,于酶標(biāo)板 各孔中分別加入100μ L，4°C包被過(guò)夜，用PBST洗滌5次。(2)、封閉每孔加入300 μ L封閉液，4°C封閉過(guò)夜，用PBST洗滌5次。(3)、加待檢樣品以PBST將陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、待檢血清按1 50稀 釋，每孔中加入100 μ L，37°C孵育60min,用PBST洗滌5次；(4)、加 HRP-SPA 將 HRP-SPA 用 PBST 作 1 5000 稀釋，每孔中加入 100 μ L, 37°C 孵育60min，用PBST洗滌5次；(5)、配制并加入顯色液臨顯色之前向所述磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中加入鄰苯 二胺，使鄰苯二胺濃度達(dá)到0. 4g/L，然后加入所述的H2O2水溶液0. 15mL,即獲得顯色液；每 孔加入該顯色液100μ L，37°C避光孵育15min ；(6)、終止每孔加入100 μ L終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的OD49tlnm值；(7)、判定待檢血清孔的OD49tlnm值彡陰性對(duì)照血清孔的OD49tlnm值+0. 24，判為陽(yáng)性； 反之判為陰性。8.敏感性測(cè)定副結(jié)核滅活疫苗(吉林獸醫(yī)研究所生產(chǎn))按照說(shuō)明書的劑量免疫健康成年羊駝2 頭，首次免疫20d后加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫3次，每次間隔15-20d，最后一次免疫20天后采血， 用補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)和以上建立的間接ELISA方法檢測(cè)均為陽(yáng)性。將制備的2份羊駝副結(jié)核陽(yáng) 性血清等體積混勻得到羊駝混合陽(yáng)性血清，自1 25起始做倍比稀釋，用本實(shí)驗(yàn)建立的間 接ELISA方法對(duì)各個(gè)稀釋度進(jìn)行檢測(cè)，得出該混合血清的效價(jià)為1 3200，表明抗原抗體反 應(yīng)的敏感性良好。9.陰陽(yáng)性對(duì)照血清的制備選取了 10頭臨床健康的青年公羊駝，用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)均為陰性， 采取血清用以上間接ELISA方法檢測(cè)，選取OD49tlnm值小于0. 30、P/N值小于0. 8、阻斷試驗(yàn) OD490nm值無(wú)明顯變化的5份血清混合后，作為間接ELISA方法的陰性對(duì)照血清。將以上步驟8制備的羊駝混合陽(yáng)性血清用以上陰性對(duì)照血清稀釋至滴度為 1 400，再次用間接ELISA確認(rèn)其滴度的準(zhǔn)確性，該血清作為間接ELISA方法的陽(yáng)性對(duì)照 血清。阻斷試驗(yàn)是將待檢血清中加入過(guò)量的純化重組hed蛋白，37°C中和Ih后，用以上 間接ELISA方法檢測(cè)，比較血清處理前后OD49tlnm值有無(wú)明顯變化。10.保存期測(cè)定按照以上確定的間接ELISA反應(yīng)程序，包被、封閉酶標(biāo)板后，分別于4°C和_20°C保
7存，分別于1周、2周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月取出，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，其它試劑于 4°C保存。結(jié)果顯示，包被的酶標(biāo)板在4°C保存時(shí)間為1個(gè)月，而在-20°C可保存6個(gè)月以上。
實(shí)施例4臨床樣品檢測(cè) 用建立的間接ELISA方法對(duì)47份羊駝血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，用副結(jié)核補(bǔ) 體結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)和變態(tài)反應(yīng)檢測(cè)，結(jié)果也均為陰性，證實(shí)該方法具有一定的臨床實(shí)踐性。
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權(quán)利要求
一種檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體的試劑盒，包含下列試劑(1)副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白；(2)羊駝副結(jié)核陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體的試劑盒，其特征在于還包含 酶標(biāo)板、包被液、封閉液、PBST、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的金黃色葡萄球菌蛋白A、顯色液配制 原料和終止液；所述包被液是濃度為lmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH 7. 5 ；所述封閉液是質(zhì)量濃度為2%的明膠溶液；所述 PBST 的組成是=Na2HPO4 2. 9g/L, KH2PO4 0. 2g/L, NaCl 8. Og/L, KCl 0. 2g/L, Tween-20體積濃度為0. 05%，其pH為7. 4 ；所述顯色液配制原料包括①由Na2HPO4 · 12H20 18. 408g/L,檸檬酸5. 106g/L組成的磷 酸鹽_檸檬酸鹽緩沖液，PH 5. 0 ；②鄰苯二胺；③體積濃度為30%的H2O2水溶液；所述終止液是濃度為2mol/L的H2SO4溶液。
3.一種采用權(quán)利要求2的試劑盒檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體的方法，按如下步驟(1)、包被副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白用包被液稀釋至3.75 μ g/mL，于酶標(biāo)板各孔 中分別加入100μ L，4°C包被過(guò)夜，用PBST洗滌5次；(2)、封閉每孔加入300μ L封閉液，4°C封閉過(guò)夜，用PBST洗滌5次；(3)、加入待檢樣品以PBST分別將陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、待檢血清按體積 1 50稀釋，每孔中加入100yL，37°C孵育60min，用PBST洗滌5次;(4)、加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的金黃色葡萄球菌蛋白A用PBST將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo) 記的金黃色葡萄球菌蛋白A作1 5000稀釋，每孔中加入100μ ，37 孵育60min，用PBST 洗滌5次；(5)、配制并加入顯色液臨顯色之前向所述磷酸鹽_檸檬酸鹽緩沖液中加入鄰苯二 胺，使鄰苯二胺濃度達(dá)到0. 4g/L，然后加入所述的H2O2水溶液0. 15mL,即獲得顯色液；每孔 加入該顯色液100 μ L，37°C避光孵育15min ；(6)、終止每孔加入100μ L終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的OD49tlnm值；(7)、判定待檢血清孔的OD49tlnm值彡陰性對(duì)照血清孔的OD49tlnm值+0.24，判為陽(yáng)性；反 之判為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體的試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包含副結(jié)核分支桿菌重組hed蛋白，羊駝副結(jié)核陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清，還可以包括酶標(biāo)板、包被液、封閉液、PBST、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的金黃色葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA)、顯色液配制原料和終止液。由于本發(fā)明試劑盒，引入了特異性強(qiáng)、且高效表達(dá)的副結(jié)核分支桿菌hed蛋白，用它作為檢測(cè)抗原，直接檢測(cè)羊駝抗副結(jié)核分支桿菌抗體，具有良好的特異性和靈敏度。用本試劑盒檢測(cè)羊駝副結(jié)核分支桿菌抗體方法簡(jiǎn)便、快速且準(zhǔn)確，適合大批量樣品檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101949928SQ20101026468
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者唐泰山, 姜焱, 廉慧鋒, 張常印, 張睿, 王凱民, 祝長(zhǎng)青 申請(qǐng)人:江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心