專利名稱：Il-23在肝癌早期病變診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝癌早期病變診斷的新標(biāo)記物和方法，還涉及用于肝癌早期病變診 斷的試劑盒。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌是我國發(fā)生率最高的惡性腫瘤之一，每年因患肝癌而死亡的人數(shù)約 占全世界肝癌死亡人數(shù)的50%，嚴(yán)重威脅著人民群眾的生命健康，給患者家庭及國家造 成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在我國，肝癌發(fā)生的主要病因是慢性持續(xù)性乙型肝炎病毒的感 染，表現(xiàn)為血清乙型肝炎病毒表面抗原持續(xù)陽性，這部分人群是肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)人群。 根據(jù)2006年全國流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國自然人群中乙型肝炎病毒表面抗原調(diào)整后 陽性率高達(dá)7.18%，估計(jì)有乙肝病毒表面抗原攜帶者9400萬人。目前，對于臨床診斷的 肝癌的治療手段單一受限，患者的死亡率居多種惡性腫瘤的首位。因此，預(yù)防慢性持續(xù) 乙肝病毒感染者進(jìn)展為肝癌，及早發(fā)現(xiàn)肝癌的早期病變，進(jìn)而采取積極的診療措施，可 極大提高肝癌患者的生存率。根據(jù)《中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會》于2001年9月在廣州所制定的“原發(fā) 性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)”，(中華肝臟病雜志，2001年12月第9卷第6期第324 頁)，我國目前最常用的原發(fā)性肝癌早期診斷方法是在高危人群中定期進(jìn)行血清中甲胎蛋 白的檢測以及影像學(xué)的篩查(高危人群40歲及以上男性，45歲及以上女性的慢性乙肝 病毒感染者)。診斷標(biāo)準(zhǔn)為至少具有以下特征之一 (a)AFPM00yg/L，能排除妊娠、生 殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉(zhuǎn)移性肝癌，并能觸及腫大、堅(jiān)硬及有大結(jié)節(jié)狀腫塊 的肝臟或影像學(xué)檢查有肝癌特征的占位性病變者；(b)AFP < 400μ g/L，能排除妊娠、 生殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉(zhuǎn)移性肝癌，并有兩種影像學(xué)檢查有肝癌特征的占 位性病變或有兩種肝癌標(biāo)志物(DCP、GGT II、AFU及CA19-9等)陽性及一種影像學(xué)檢 查有肝癌特征的占位性病變者。(C)有肝癌的臨床表現(xiàn)并有肯定的肝外轉(zhuǎn)移病灶(包括肉 眼可見的血性腹水或在其中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞)并能排除轉(zhuǎn)移性肝癌者。而這一診斷的做出往 往在肝癌發(fā)生之后，病人已經(jīng)喪失了最佳的治療時(shí)機(jī)。此外，流行病學(xué)調(diào)查顯示，在慢 性乙肝病毒表面抗原攜帶者中，每年有的人群自然進(jìn)展為肝癌，終身肝癌的發(fā)生率累 計(jì)約有40%。因此在高危人群中及早發(fā)現(xiàn)早期的病變特征，從而采取積極的手段與措施 進(jìn)行干預(yù)和治療，提高患者的生活質(zhì)量與生存率。需要建立高效便捷易行的方法。由慢性乙肝進(jìn)展為肝癌是一個(gè)漫長的過程，可長達(dá)40-50年，是機(jī)體與病毒長 期相互作用的結(jié)果。因此，臨床醫(yī)生通常針對40歲及以上男性，45歲及以上女性的慢性 乙肝病毒感染者這一高危群體，定期檢測其血清中甲胎蛋白的水平并附加超聲影像學(xué)的 篩查，以期采用現(xiàn)行的常規(guī)手段發(fā)現(xiàn)早期肝癌患者。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙肝病毒 感染的患者中，病毒感染的肝細(xì)胞和識別感染肝細(xì)胞的免疫細(xì)胞分泌多種不同的細(xì)胞因 子，在由慢性乙肝病毒感染狀態(tài)進(jìn)展為肝癌的病程進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。白細(xì)胞介素23 (IL-23)是一個(gè)異二聚體造血細(xì)胞因子，由p40和pl9兩個(gè)亞基組 成，主要由機(jī)體活化的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和IFN-Y的產(chǎn)生。IL-23優(yōu)先刺激機(jī)體記憶性T細(xì)胞而不是初始型T細(xì)胞群。其受體廣泛表達(dá)于活化 T細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，IL-23作用于這些細(xì)胞，誘 導(dǎo)IFN-Y等前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在炎癥性疾病、自身免疫性疾病的發(fā)病以及抗腫瘤 和抗感染等方面發(fā)揮重要作用。發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人具有發(fā) 生肝癌傾向的方法，包括檢測得自所述對象的生物學(xué)樣品中IL-23的水平，其中檢測樣品中IL-23水平升 高是所述對象具有發(fā)生肝癌傾向的指征。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物學(xué)樣品是血液樣品如血清或其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品中IL-23的水平通過檢測IL-23蛋白或IL-23的 mRNA的水平來確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用IL-23特異性抗體或其抗原結(jié)合片段檢測所述生物學(xué)樣 品中IL-23蛋白的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測樣品中IL-23水平升高是檢測樣品中IL-23水平與 對照樣品中IL-23水平相比是升高的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測樣品中IL-23水平升高是檢測樣品中IL-23蛋白水 平高于截?cái)嘀怠Ｔ谝粋€(gè)實(shí)施方案中，對象具有發(fā)生肝癌傾向的截?cái)嘀禐?55pg/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測樣品中IL-23蛋白的水平通過檢測pl9亞基或其同 源物來確定。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人 具有發(fā)生肝癌傾向的組合物，其中所述組合物包含用于檢測所述對象的生物學(xué)樣品中 IL-23水平例如檢測IL-23蛋白或IL-23的mRNA的水平的制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物學(xué)樣品是血液樣品例如血清或其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用IL-23特異性抗體或其抗原結(jié)合片段檢測所述生物學(xué)樣 品中IL-23蛋白的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑是針對IL-23蛋白的特異性抗體，例如單克隆或多 克隆抗體。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 IL-23特異性抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于鑒 定慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人具有發(fā)生肝癌傾向的組合物中的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人具有 發(fā)生肝癌傾向的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測所述對象的生物學(xué)樣品中IL-23水平例 如檢測IL-23蛋白或IL-23的mRNA的水平的制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物學(xué)樣品是血液樣品例如血清或其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑是針對IL-23蛋白的特異性抗體。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述抗體是單克隆或多克隆抗體。附圖簡述

圖1 :通過受試者操作特征曲線分析評估IL-23對預(yù)測肝細(xì)胞癌(HCC)的作 用。ROC下的面積為0.699(95% CI 0.593/0.791)(圖中兩條虛線所表示曲線為95%置信區(qū)間)。當(dāng)截?cái)嘀禐?55pg/ml時(shí)，靈敏性和特異性分別為60.0%和91.1%。圖2 Kaplan-Meier分析用于評估IL-23水平和HCC累積發(fā)病率之間的相關(guān)性。 結(jié)果表明具有高IL-23水平的患者中HCC的累積發(fā)病率較高。圖3:根據(jù)距隨訪結(jié)束時(shí)的時(shí)間間隔將不同時(shí)間點(diǎn)的樣品血清分成5組。結(jié)果 表明在發(fā)展為HCC的患者中，在疾病進(jìn)展早期IL-23濃度較高，然后降低，在對照患者 中在隨訪期間IL-23濃度保持恒定。發(fā)明詳細(xì)描述除非特別指出，本文使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的 含義。另外除非特別需要，則單數(shù)術(shù)語應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包括單數(shù)。前述技術(shù)和 方法通常根據(jù)本領(lǐng)域熟知的及在本說明書引用的參考文獻(xiàn)所述的常規(guī)方法進(jìn)行。見例如 并入作參考的 Current Protocols inlmmunology.Wiley&Sons, Hoboken, NJ 所述。本文引
用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請、文章、教科書等及其中引用的參考文獻(xiàn)在此 均以其全部援引加入本文。本發(fā)明人于上世紀(jì)90年代中后期在我國肝炎肝癌的高發(fā)區(qū)之一的啟東地區(qū)建立 了一個(gè)可長期追蹤隨訪的慢性乙肝攜帶者隊(duì)列，定期進(jìn)行血清甲胎蛋白水平的檢測和肝 膽脾的超聲影像學(xué)檢查，發(fā)現(xiàn)了一些早期肝癌患者。利用這一隊(duì)列同時(shí)研究了在慢性乙 肝病毒感染者中機(jī)體針對病毒的免疫應(yīng)答在由慢性乙肝進(jìn)展為肝癌過程中的作用，以期 發(fā)現(xiàn)影響肝癌早期病變的血清細(xì)胞因子特征。研究結(jié)果顯示，早在由慢性肝炎進(jìn)展為采 用現(xiàn)行臨床常規(guī)方法診斷為肝癌的5-8年之前，與持續(xù)性慢性乙肝感染者相比，肝癌患 者血清中的細(xì)胞因子表達(dá)譜就已經(jīng)發(fā)生了明顯的變化，其中差異最為明顯的細(xì)胞因子為 IL-23。采用酶聯(lián)免疫布陣法(ELISAArray)的檢測結(jié)果表明IL-23對于慢性肝炎患者病 程進(jìn)展結(jié)局具有較好的指示作用，能有效地對持續(xù)性慢性乙肝進(jìn)展為肝癌的患者進(jìn)行早 期預(yù)警診斷。IL-23可作為由持續(xù)性慢性乙肝進(jìn)展為原發(fā)性肝癌的早期病變血清標(biāo)志物。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人具有發(fā)生肝 癌傾向的方法，包括在所述對象的生物學(xué)樣品中檢測IL-23的水平，其中檢測樣品中所述 IL-23水平升高是所述對象具有發(fā)生肝癌傾向的指征。本文所述“肝癌”是指原發(fā)性肝細(xì)胞癌癥。本文所用術(shù)語“癌癥”通常指任何 類型的惡性贅生物，即與未受影響的(健康)野生型對照細(xì)胞相比顯示或具有發(fā)生癌特征 傾向的靶細(xì)胞的任何形態(tài)學(xué)和/或生理學(xué)改變。這種改變的例子可涉及細(xì)胞大小和形狀 (變大或變小)、細(xì)胞增殖(細(xì)胞數(shù)增加)、細(xì)胞分化(生理學(xué)狀態(tài)變化)、凋亡(程序性 細(xì)胞死亡)或細(xì)胞存活。本文所用術(shù)語“具有發(fā)生癌癥傾向”是指任何處于癌前狀態(tài)即正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 腫瘤細(xì)胞過程中的中間狀態(tài)的指征的細(xì)胞表型。換句話說，該術(shù)語是指發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn) 的狀態(tài)。最常見類型的肝癌是肝細(xì)胞癌(HCC)。本文所用術(shù)語“肝細(xì)胞癌”是指原發(fā)的 肝臟惡性腫瘤。大多數(shù)HCC繼發(fā)于慢性肝炎病毒感染(乙型肝炎或丙型肝炎)或者肝硬 化(酒精中毒是導(dǎo)致肝硬化的最常見因素)。肝細(xì)胞癌與任何其它癌癥一樣，當(dāng)存在引起 細(xì)胞高速復(fù)制和/或?qū)е录?xì)胞避免凋亡的分子機(jī)制突變時(shí)而發(fā)生。特別地，乙型肝炎和 /或丙型肝炎的慢性感染通過導(dǎo)致機(jī)體自身免疫系統(tǒng)反復(fù)攻擊自身肝細(xì)胞(其中一些被病毒感染，其它的僅是旁觀者)而可助于肝細(xì)胞癌的發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物學(xué)樣品是血液樣品如血清或其衍生物。本發(fā)明中 的生物學(xué)樣品可以是人或非人類來源的。然而，本發(fā)明典型地用人類生物學(xué)樣品進(jìn)行。 本文所述生物學(xué)樣品是來自被測對象的任意生物學(xué)樣品，尤其是包括核酸或者多肽的任 意樣品。有利地，可以包括下列樣品血液，血清，血漿，血小板，唾液，痰，尿液等 等，更一般來說包括核酸或者多肽的任意組織、器官或者有利地生物體液。另外，生物 學(xué)樣品可含有衍生自細(xì)胞例如肝細(xì)胞的細(xì)胞提取物或包括其的細(xì)胞群。在本發(fā)明的體外 方法中用于檢測的樣品通常應(yīng)以臨床可接受的方式收集，例如以保護(hù)核酸或蛋白質(zhì)的方 式收集。在一個(gè)實(shí)例中，所述樣品是源自血液的樣品，如血液、血清或者血漿的樣品。 可以通過任意已知技術(shù)如通過采血、通過非侵入性技術(shù)從樣品采集點(diǎn)或者庫等等獲取樣 品。還可以預(yù)處理所述樣品以增加靶分子的可接近性，如通過裂解(機(jī)械、化學(xué)、酶裂 解等等)、純化、離心、分離等等。還可以標(biāo)記所述樣品以便于靶分子存在的檢測(熒 光、放射性、發(fā)光、化學(xué)、酶標(biāo)記等等)。在一個(gè)實(shí)例中，所述生物學(xué)樣品是全血樣品， 即還沒有經(jīng)過分離步驟的血液，其任選可以被稀釋。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品中IL-23的水平通過檢測IL-23蛋白或IL_23的 mRNA的水平來確定，例如使用IL-23特異性抗體或其抗原結(jié)合片段檢測所述生物學(xué)樣品 中IL-23蛋白的水平。IL-23蛋白由pl9和p40兩個(gè)亞基組成，其中pl9(SEQ ID NO 1 MGSRAVMWTAGRAVGGS SAWTCSKCTAWSAHVGHMDRGDTTNDVHCGDGCDGRDN SCRHGYKGSDTGSDSVGHASGSGHHWTSSSWRRKRSAVAVAARVAHGAATS)為特有亞 基，而 p40(SEQ ID NO 2 MCHVSWSVASVAWKKDVYVVDWYDAGMVVTCDTDGT WTDSSVGSGKTTVKGDAGYTCHKGGVSHSHKKDGWSTDKDKKNKTRCAKNYSGRTC WWTTSTDTSVKSSRGSSDGVTCGAATSARVRGDNKYYSVCDSACAASVMVDAVHKKY NYTSSRDKDKNKKNSRVVSWYDTWSTHSYSTCVVGKSKRKKDRVTDKTSATVCRKNA SSVRADRYYSSSWSWASVCS)為與同源物共享的亞基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述檢測IL-23蛋白的水平可以通過檢測pl9亞基或其同源物的水平來進(jìn)行，其中檢測樣品 中所述IL-23的水平升高是所述對象具有發(fā)生肝癌傾向的指征。pl9亞基的同源物是指包含與SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列具有至少50 %、 60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%, 99%或者更高的同源性的氨基酸序列的多肽。兩個(gè)蛋白質(zhì)序列的同源性對應(yīng)于兩個(gè)蛋白質(zhì)鏈中位于相同或類似位置的相同氨 基酸的百分比。用BLAST算法利用BLOSUM 62陣列計(jì)算同源性百分比，該算法可在 NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得。在本文中，所述pl9亞基的同源物優(yōu)選 是功能性同源物，即其與SEQ ID NO: 1具有顯著的相似性(例如在氨基酸水平大約50% 序列相同性)并且與p40亞基一起組成的多肽。至少大約60%，至少大約70%，至少大 約80%、至少大約90%、至少大約95%、或至少大約99%序列相同性的pl9亞基的功能 性同源物是優(yōu)選的功能性同源物。用于檢測IL-23蛋白、pl9亞基或其同源物、IL-23的mRNA的制劑可以是多 肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干擾(RNAi)、
6反義RNA、重組蛋白質(zhì)、抗體、或者其綴合物或融合蛋白。關(guān)于RNAi，可見Milhavet O, GaryDS, Mattson MP. (Pharmacol Rev.2003Dec ； 55(4) 629_48.Review.)，關(guān)于反義 RNA,可見 Opalinska JB，GewirtzAM. (Sci STKE.20030ct 28 ； 2003(206) pe47)。例如，為了確定對象中IL-23蛋白、pl9亞基或其同源物的水平，本發(fā)明的方法 可以使用結(jié)合IL-23蛋白或pl9亞基的配體測定來自所述對象的生物學(xué)樣品中IL-23蛋白 或pl9亞基或其同源物的水平(濃度或絕對量)，在對象的所述生物學(xué)樣品中IL-23蛋白 或pl9亞基或其同源物水平升高指示所述對象存在肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)。本文所述配體可以是受體靶向物質(zhì)、細(xì)胞因子、激素、生長因子、受體特異性 抗體以及模式識別受體(PRR)配體。在一個(gè)實(shí)例中，所述配體是抗體(或其抗原結(jié)合片 段)?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意技術(shù)揭示或者分析樣品中的IL-23蛋白、pl9 亞基或其同源物，尤其是例如利用特異性配體，如抗體或者片段或者抗體衍生物。優(yōu)選 所述配體是所述蛋白的特異性抗體或者這類抗體的片段(如Fab，F(xiàn)ab'，CDR等等)或 者這類抗體的衍生物(諸如單鏈抗體，ScFv)。通過檢測靶和配體的復(fù)合物如利用標(biāo)記的 配體、利用第二種標(biāo)記的檢測配體等等可以檢測樣品中靶蛋白的存在或者量?？梢允褂?公知的免疫技術(shù)包括ELISA，RIA等等。可以通過常規(guī)技術(shù)尤其是利用包括所述蛋白(或者其免疫原性片段)的免疫原 免疫非人動物并回收抗體(多克隆)或者生成細(xì)胞(以產(chǎn)生單克隆抗體)產(chǎn)生靶蛋白 的特異性抗體。用于制備多克隆或者單克隆抗體、ScFv片段以及人的或者人源化抗體 的技術(shù)例如在下列文獻(xiàn)中描述Harlow etal.，Antibodies A Laboratory Manual, CSH Press, 1988 ； Ward et al.，Nature 341 (1989) 544 ； Bird et al.，Science 242 (1988) 423 ； W094/02602 ； US5,223,409 ； US5,877,293 ； W093/01288。本文所述“抗體”、“抗原結(jié)合片段”或“免疫原性部分”均具有本領(lǐng)域技術(shù) 人員通常已知的含義。例如抗體的“抗原結(jié)合片段”是指通過重組DNA技術(shù)或者通過酶 或化學(xué)切割完整的抗體而產(chǎn)生的，包括Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv和單鏈抗體(svFc)。 抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體及可以是標(biāo)記的 抗體以及所述抗體的片段、變體或衍生物?？贵w標(biāo)記可以是放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、 酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或者生物素基團(tuán)標(biāo)記。抗體或其片段其制備及使用是熟知的并 且公開在例如 Harlow, Ε.and Lane, D., Antibodies A LaboratoryManual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999。本領(lǐng)域已知許多針對IL-23蛋白、pl9亞基或其同源物的特異性抗體，例如 Anti-Human IL-23 (ρ 19) Monoclonal antibody，Clone hlt2736 (Biolegend)、Anti-Human IL-23p 19，Clone eBio473P 19 (eBioscience)禾口 Anti—Human IL_23p 19Functional Grade Purified, Clone HNU2319 (eBioscience)。還可以利用質(zhì)譜分析相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)檢測蛋白質(zhì)表達(dá)和/或結(jié) 構(gòu)的變化，這類技術(shù)一般來說被分到蛋白質(zhì)組分析名下，以便檢測患者血液中的特異性 特征序列?；蛘撸景l(fā)明的方法可以使用檢測IL-23的mRNA的變化的任何檢測方法來測 定所述生物學(xué)樣品中IL-23的mRNA的水平，其中所述生物學(xué)樣品中IL-23的mRNA的 水平升高指示所述患者具有肝癌患病風(fēng)險(xiǎn)。上述檢測方法包括能夠檢測樣品中核酸的各種技術(shù)，如Northern印跡，選擇性雜交，使用包被寡核苷酸探針的基材例如核酸分子陣 列、DNA芯片等，通過例如RT-PCR、定量PCR或者連接PCR的核酸擴(kuò)增等等。這 些方法可以包括使用能夠選擇性或者特異性檢測樣品中核酸靶的核酸探針或者引物。例 如，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且可以參考標(biāo)準(zhǔn)條件(Sambrook，F(xiàn)ritsch, Maniatis(1989) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press)進(jìn)行雜交，例如可以在高、中或 者低嚴(yán)格性條件下進(jìn)行雜交。或者，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用已知的各種方法進(jìn)行擴(kuò) 增，如PCR、LCR、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、NASBA、等位基因 特異性寡核苷酸(ASO)的使用、等位基因特異性擴(kuò)增、Southern印跡、單鏈構(gòu)像分析 (SSCA)、原位雜交(例如FISH)、凝膠遷移、異源雙鏈分析等等。本文所述“水平升高”是指通過檢測上述生物學(xué)樣品獲得的值與參照值例如在 未患肝癌的慢性乙肝感染者或者正常人中觀察到的中間值或者平均值、或者與基于實(shí)驗(yàn) 證據(jù)和/或現(xiàn)有技術(shù)數(shù)據(jù)針對慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人具有發(fā)生肝癌傾向的截 斷值相比是升高的。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測樣品中IL-23水平升高是檢測樣品中IL-23水平與 對照樣品中IL-23水平相比是升高的。本文所用術(shù)語“對照樣品”典型地是指來自具有慢性乙型肝炎病毒感染但無肝 癌病變特征的對象的生物學(xué)樣品。靶的水平的確定典型地遵循本領(lǐng)域熟知的已建立的標(biāo) 準(zhǔn)程序(參見例如 Current Protocols in Immunology.Wiley&Sons, Hoboken, NJ; Current Protocols in Molecular Biology.Wiley&Sons，Hoboken, NJ)。確定可以在蛋白質(zhì)水平
或RNA水平進(jìn)行，例如使用酶聯(lián)免疫分析或Western印跡方法進(jìn)行蛋白水平檢測，或者 RNA特異性探針進(jìn)行Northern印跡分析，或者在逆轉(zhuǎn)錄(及克隆)RNA后通過定量PCR 或?qū)崟r(shí)PCR技術(shù)在DNA水平進(jìn)行。所獲得的一或多種待測樣品和一或多種對照樣品的水平之間的差異可以歸一化 至進(jìn)一步的對照核酸例如管家基因的水平，管家基因的水平已知不根據(jù)細(xì)胞的疾病狀態(tài) 而不同。舉例的管家基因包括β-肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl寸。但是，代替在任何實(shí)驗(yàn)中確定一或多種對照樣品的水平，也可以基于實(shí)驗(yàn)證據(jù) 和/或現(xiàn)有技術(shù)數(shù)據(jù)定義針對特定疾病表型(即疾病狀態(tài))的一或多個(gè)截?cái)嘀?。在本文中，截?cái)嘀凳侵窻OC曲線各點(diǎn)中陽性似然比(為真陽性率與假陽性率之 比)與陰性似然比(為假陰性率與真陰性率之比)比值最大的點(diǎn)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述檢測樣品中IL-23水平升高是檢測樣品中IL-23 蛋白水平高于截?cái)嘀?。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述截?cái)嘀禐?55pg/ml。在本發(fā)明中，術(shù)語“鑒定具有發(fā)生肝細(xì)胞癌癥的傾向”也包括預(yù)測和可能性分 析(“診斷”意義上)。本文公開的組合物和方法意在臨床應(yīng)用，以決定治療形式，包 括治療性或預(yù)防性干預(yù)，診斷標(biāo)準(zhǔn)如疾病階段，和疾病監(jiān)控和疾病監(jiān)視。根據(jù)本發(fā)明， 可提供用于檢查對象狀態(tài)的中間結(jié)果。這種中間結(jié)果可與額外信息組合以幫助醫(yī)生、護(hù) 士或其它從業(yè)人員診斷出該對象患有該疾病或者具有患有該疾病的風(fēng)險(xiǎn)。本文所用術(shù)語“多肽”，“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，指氨基酸殘基的聚 合物，其包含經(jīng)肽鍵結(jié)合的9個(gè)或更多個(gè)氨基酸。聚合物可以是線性的，分枝的或環(huán)狀的，可包含天然存在的和/或氨基酸類似物，它可被非氨基酸間斷。通常，若氨基酸聚 合物是長的(例如超過50個(gè)氨基酸殘基)，其優(yōu)選稱為多肽或蛋白質(zhì)，但是若其是50個(gè) 氨基酸長或更短，優(yōu)選稱為“肽”。在本文中，術(shù)語“核酸”，“核酸分子”，“多 核苷酸”和“核苷酸序列”可互換使用，定義任何長度的多聚物，如聚脫氧核糖核苷酸 (DNA)(例如cDNA，基因組DNA，質(zhì)粒，載體，病毒基因組，分離的DNA，探針，引 物和其任何混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)分子(例如mRNA，反義RNA)或混合的 聚核糖_聚脫氧核糖核苷酸。它們包含單鏈或雙鏈，線性或圓形，天然或合成的多核苷 酸。此外，多核苷酸可包括非-天然存在的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似 物和可被非核苷酸組分間斷。如果存在，在聚合之前或之后可進(jìn)行核苷酸修飾。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了特異性檢測IL-23蛋白或IL-23的mRNA的制 劑在制備用于鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人具有發(fā)生肝癌傾向的組合物中的應(yīng) 用。在一個(gè)實(shí)例中，所述制劑是IL-23蛋白的配體。本文所述配體可以是受體靶向物 質(zhì)、細(xì)胞因子、激素、生長因子、受體特異性抗體以及模式識別受體(PRR)配體。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述配體是抗體(或其抗原結(jié)合片段)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述對象是 人。在配體是抗體的實(shí)例中，所述抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人 源化抗體、人抗體及可以是標(biāo)記的抗體以及所述抗體的片段、變體或衍生物，或者所述 抗原結(jié)合片段是Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv和單鏈抗體(svFc)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了用于鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人具 有發(fā)生肝癌傾向的試劑盒，所述試劑盒包括用于檢測來自所述對象的生物學(xué)樣品、例如 血液樣品或其衍生物中IL-23蛋白或IL-23的mRNA的水平的制劑。所述試劑盒包括可 以用于實(shí)施本發(fā)明所述方法的任意物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的試劑盒包括特異性針 對IL-23蛋白或免疫原性片段的抗體。
實(shí)施例本發(fā)明通過下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明，但任何實(shí)施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對本 發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗?。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定，結(jié)合本說明書和 本領(lǐng)域一般常識，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書所限定的范圍。在不 偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何 修改或改變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例1 自1996年至1999年在江蘇省啟東招募在2年內(nèi)至少2次測試為HBsAg陽性的 慢性乙肝病毒(HBV)持續(xù)感染的患者。排除丙肝病毒或HIV共感染以及其他伴隨性慢 性肝病的人群。在基線進(jìn)行B超檢測以排除肝硬化和HCC的存在，在隨訪過程中，無人 接受過抗病毒治療。研究方案獲得中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院和啟東肝癌防治研究所癌癥研究所/ 醫(yī)院倫理委員會(EthicsCommittee of Cancer Institute/Hospital，Chinese Academy of Medical Sciencesand Qidong Liver Cancer Institute)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號SO9-59/35^。進(jìn)展為 HCC 的 所有患者根據(jù)2001年《中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會》所制定的“原發(fā)性肝癌的臨床診 斷與分期標(biāo)準(zhǔn)”進(jìn)行診斷，具有至少一個(gè)下列標(biāo)準(zhǔn)(a)AFPM00yg/L，能排除妊娠、 生殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉(zhuǎn)移性肝癌，并能觸及腫大、堅(jiān)硬及有大結(jié)節(jié)狀腫
9塊的肝臟或影像學(xué)檢查有肝癌特征的占位性病變者；(b) AFP < 400 μ g/L能排除妊娠、 生殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉(zhuǎn)移性肝癌，并有兩種影像學(xué)檢查有肝癌特征的占 位性病變或有兩種肝癌標(biāo)志物(DCP、GGT II、AFU及CA19-9等)陽性及一種影像學(xué)檢 查有肝癌特征的占位性病變者。(C)有肝癌的臨床表現(xiàn)并有肯定的肝外轉(zhuǎn)移病灶(包括肉 眼可見的血性腹水或在其中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞)并能排除轉(zhuǎn)移性肝癌者?；颊呙?4-36個(gè)月進(jìn)行隨訪。每次隨訪期間，進(jìn)行肝功、AFP、乙肝病毒s抗原 (HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)檢測。每次隨訪保存血清樣品用于進(jìn)一步分析，同 時(shí)進(jìn)行B超檢測。臨床肝硬化定義為肝硬化和脾功能亢進(jìn)跡象特征。發(fā)生HCC前隨訪 時(shí)間定義為首次血清收集時(shí)間和診斷出HCC之間的時(shí)間間隔。當(dāng)隨訪在2009年6月結(jié) 束時(shí)每名患者被訪問3-4次。實(shí)施例2 實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)方法使用 Quansys (Quansys Biosciences, Logan, Utah)的 Human 9-plex 分析試齊Ll
盒檢測人血清細(xì)胞因子水平，所述試劑盒含有下述9種細(xì)胞因子IL-I α，IL-I β , IL-6，IL-8，IL-10, IL-17，IL-23，IFN Y和TNF α。根據(jù)生產(chǎn)商手冊的指導(dǎo)進(jìn)行檢 測分析，該分析具有高靈敏性和廣泛的動力學(xué)范圍(IL-Ici 0.87-450pg/ml ； IL-I β 3.24-1400pg/ml IL-6 3.81_475pg/ml ； IL-8 0.21_125pg/ml，； IL-10 0.22_190pg/ ml; IL-17 1.63-450pg/ml ； IL-23 18.64_8000pg/ml，TNFa 0.73_350pg/ml ； IFNY 0.25-100pg/ml,通過軟件計(jì)算超出所述動力學(xué)范圍的細(xì)胞因子濃度)。每個(gè) 樣品重復(fù)檢測兩次，使用平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。為了評估儲存時(shí)間長短是否影響細(xì)胞 因子穩(wěn)定性，在同一人的系列血樣中檢測了與肝功能無關(guān)的人嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白 (ECP)。結(jié)果表明，ECP濃度不隨儲存時(shí)間的長短而發(fā)生改變，因此認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)所檢測 的炎癥性細(xì)胞因子在合適的儲存條件下也是穩(wěn)定的。分析數(shù)據(jù)時(shí)，連續(xù)變量以中間值和四分位數(shù)間距表示。通過卡方檢測比較分類 變量。通過Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較發(fā)展為HCC的患者和保持慢性乙型肝炎病毒感染 的對照人群之間的細(xì)胞因子水平。無HCC的隨訪時(shí)間通過Kaplan-Meier分析評估。多 重邏輯回歸模型用于調(diào)整與HCC發(fā)生相關(guān)的潛在因素。通過受試者特性曲線分析評估細(xì) 胞因子水平在預(yù)測HCC發(fā)生中的作用。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)測試均為雙尾。ρ <0.05認(rèn)為具有 統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。實(shí)施例3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果至2009年6月，45名患者發(fā)展為HCC，45名年齡和和性別相匹配的對照患者被 配對。發(fā)展為HCC的患者中隨訪時(shí)間中位數(shù)(四分位數(shù)間距)為108(84，132)個(gè)月， 對照組中為144(132，144)個(gè)月(ρ < 0.0001)。我們還比較了兩組之間的一些特征(表 I)。發(fā)展為HCC的患者的中位年齡為45(39，52)歲，而對照組為44(41，53)歲(ρ = 0.79)。因?yàn)槟行员扰愿鼉A向于發(fā)展HCC，因此在所述群中僅有3名女性患者。發(fā)展 為HCC的28 (62% )名患者飲酒，對照組中29 (64% )名患者飲酒。他們具有相似的酒 精攝入量(ρ = 0.72)。此外，兩組之間吸煙狀況和家族病史也無差異。表I-有和無HCC的慢性乙肝患者的基線特征
權(quán)利要求
1.一種鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人具有發(fā)生肝癌傾向的方法，包括檢測得自所述對象的生物學(xué)樣品中IL-23的水平，其中檢測樣品中IL-23水平升高是所述對象具有發(fā)生肝癌傾向的指征。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述生物學(xué)樣品是血液樣品如血清或其衍生物。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述樣品中IL-23的水平通過檢測IL-23蛋白或IL-23 的mRNA的水平來確定。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中檢測所述樣品中IL-23蛋白的水平。
5.權(quán)利要求4的方法，其中通過使用IL-23特異性抗體或其抗原結(jié)合片段檢測所述生 物學(xué)樣品中IL-23蛋白的水平。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的方法，其中檢測樣品中IL-23水平升高是檢測樣品中IL-23 水平與對照樣品中IL-23水平相比是升高的。
7.權(quán)利要求4或5的方法，其中檢測樣品中IL-23水平升高是檢測樣品中IL-23蛋白 水平高于截?cái)嘀?，例如高?55pg/ml。
8.權(quán)利要求4或5的方法，其中樣品中IL-23蛋白的水平通過檢測pl9亞基或其同源 物來確定。
9.IL-23特異性抗體或其抗原結(jié)合片段在制備用于鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象例 如人具有發(fā)生肝癌傾向的組合物中的應(yīng)用。
10.一種用于鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人具有發(fā)生肝癌傾向的組合物，其 中所述組合物包含用于檢測所述對象的生物學(xué)樣品中IL-23水平例如檢測IL-23蛋白、或 IL-23的mRNA的水平的制劑。
11.權(quán)利要求10的組合物，其中所述生物學(xué)樣品是血液樣品例如血清或其衍生物。
12.權(quán)利要求10的組合物，其中所述制劑是針對IL-23蛋白的特異性抗體，例如單克 隆或多克隆抗體。
13.用于鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象例如人具有發(fā)生肝癌傾向的試劑盒，所述試 劑盒包括用于檢測所述對象的生物學(xué)樣品中IL-23水平例如檢測IL-23蛋白、或IL-23的 mRNA的水平的制劑。
14.權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述生物學(xué)樣品是血液樣品例如血清或其衍生物。
15.權(quán)利要求13或14的試劑盒，其中所述制劑是針對IL-23蛋白的特異性抗體，例 如單克隆或多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒定慢性乙型肝炎病毒感染對象具有發(fā)生肝癌傾向的方法，包括在所述對象的生物學(xué)樣品例如血液樣品例如血清或其衍生物中檢測IL-23的水平并與對照樣品中IL-23的水平比較，其中檢測樣品中所述IL-23水平升高是所述對象具有發(fā)生肝癌傾向的指征。本發(fā)明還涉及了檢測IL-23的制劑在制備用于鑒定對象具有發(fā)生肝癌傾向的組合物中的應(yīng)用以及用于所述鑒定的試劑盒。
文檔編號G01N33/574GK102010903SQ20101026846
公開日2011年4月13日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者曲春楓, 杜君, 王金兵, 陳陶陽 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所