專利名稱：Atp含量的檢測方法及atp適配體傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及ATP含量的檢測方法及ATP適配體傳 感器。
背景技術(shù)：
三磷酸腺苷(ATP)存在于從微生物到高等動植物等生物體的細胞中，主要作用是 提供能量，參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖和核酸的代謝，是機體能量的重要來源，在維持生物體 的正常機能上有著無可替代的作用。ATP的快速高效測定，對于研究細胞乃至機體的生理活 性和代謝過程、進行藥物敏感實驗以及食品衛(wèi)生監(jiān)控都有非常重要的意義。傳統(tǒng)上，ATP的檢測方法有電泳法、高效液相色譜法和同位素示蹤法等。在電泳法 測定中，樣品需經(jīng)濾紙電泳分離，再利用紫外分光光度計進行比色，操作復雜；采用高效液 相色譜法，儀器、試劑昂貴，操作過程繁瑣，檢測時間比較長，且靈敏度僅為1 X IO-3M,推廣應 用難度較大；同位素示蹤法中放射性同位素對人體有危害，某些同位素半衰期長，需要在專 門的同位素實驗室完成，應用范圍受到限制(博士論文，基于核酸適配體化學發(fā)光檢測新 技術(shù)的研究，復旦大學，嚴喜鸞，第86頁)。核酸適配體是近年來發(fā)展起來的一類經(jīng)體外人工合成而篩選出的單鏈寡核苷酸， 能高效、特異性地結(jié)合各種生物目標分子，核酸適配體的出現(xiàn)為化學生物學界和生物醫(yī)學 界提供了一種新的研究平臺。核酸適配體具有自身穩(wěn)定性好、制備合成相對簡單、快速、易 獲得、易功能化修飾與標記等優(yōu)點，因此，在生物傳感器設計中應用靈活廣泛。近幾年，基于 核酸適配體的生物傳感器研究受到人們極大的關(guān)注。目前，利用基于ATP核酸適配體的生物傳感器檢測ATP的相關(guān)研究已有報道 (J.Am. Che m. Soc. 2009，131,6944-6945)?，F(xiàn)有技術(shù)中，在ATP的檢測過程中，需要對核酸 適配體進行化學標記，再根據(jù)識別反應前后標記物本身或其催化底物的變化進行檢測，因 此操作復雜，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種ATP含量的檢測方法及ATP適 配體傳感器，該檢測方法無需化學標記，方法簡單。本發(fā)明提供一種ATP含量的檢測方法，包括以下步驟提供表面固定有DNA單鏈的金電極，所述DNA單鏈序列如SEQ ID No. 1所示；提供部分DNA雙鏈，所述部分DNA雙鏈中第一鏈3，末端如SEQ ID No. 2所示，其 5’末端與第二鏈互補；所述金電極浸入所述部分DNA雙鏈與待測樣品的混合液；以Ru (phen) 32+、[Ru (bpy) 2dppz]2+ 或[Ru (phen) 2 (dppz) ]2+ 作為電化學發(fā)光探針對 所述金電極進行ECL檢測。優(yōu)選的，所述第一鏈5’末端與其3’末端以及所述DNA單鏈不相同且不互補。
優(yōu)選的，所述第二鏈含有20 23個堿基。優(yōu)選的，所述第二鏈序列如SEQ ID No. 3所示。優(yōu)選的，所述固定通過DNA單鏈5’末端修飾巰基固定。優(yōu)選的，所述金電極與混合液反應前用巰基己醇封閉金電極表面的非特異性吸附 位點。優(yōu)選的，所述對金電極進行檢測以草酸鹽或胺類化合物作為共反應劑。優(yōu)選的，所述胺類化合物為三丙胺或2- 二丁基乙醇胺。本發(fā)明還提供一種ATP適配體傳感器，包括電化學發(fā)光探針，所述電化學發(fā)光探針為Ru(phen)32+、[Ru(bpy)2dppz]2+或 [Ru (phen) 2 (dppz) ]2+ ；表面固定有DNA單鏈的金電極，所述DNA單鏈序列如SEQ ID No. 1所示；部分DNA雙鏈，所述部分DNA雙鏈中第一鏈3，末端如SEQ ID No. 2所示，其5，末
端與第二鏈互補。優(yōu)選的，所述DNA單鏈通過其5’末端修飾巰基固定于金電極。優(yōu)選的，還包括草酸鹽或胺類化合物作為共反應劑。優(yōu)選的，所述胺類化合物為三丙胺或2- 二丁基乙醇胺。從上述的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明提供一種ATP含量的檢測方法及ATP適配體 傳感器，ATP含量的檢測方法包括提供表面固定有DNA單鏈的金電極，所述DNA單鏈序列 如SEQ ID No. 1所示；提供部分DNA雙鏈，所述部分DNA雙鏈中第一鏈3，末端如SEQ ID No. 2所示，其5’末端與第二鏈互補；所述金電極浸入所述部分DNA雙鏈與待測樣品的混合 液；以 Ru (phen) 32+、[Ru (bpy) 2dppz]2+或[Ru (phen) 2 (dppz) ]2+作為電化學發(fā)光探針對所述 金電極進行ECL檢測。由于釕化合物配體較大的芳香環(huán)具有嵌入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的性能，即不 需要化學反應就可以與DNA結(jié)合。因此，在不存在ATP的情況下，DNA單鏈與部分DNA雙鏈 相互間不結(jié)合，因此很少有DNA雙鏈存在于電極表面，也就很少有釕化合物到達電極表面， 因此不產(chǎn)生或產(chǎn)生微弱的ECL信號；當有ATP存在時，在ATP誘導下DNA單鏈與部分DNA雙 鏈及ATP結(jié)合，在電極表面形成復合物。作為ECL探針，釕化合物通過嵌入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)到 達電極表面，產(chǎn)生較強的ECL信號，實現(xiàn)了對ATP的檢測。本發(fā)明提供的檢測方法無需使用 化學標記，方法簡單。
具體實施例方式下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例 僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明公開了一種ATP含量的檢測方法，包括以下步驟提供表面固定有DNA單鏈的金電極，所述DNA單鏈序列如SEQ ID No. 1所示；提供部分DNA雙鏈，所述部分DNA雙鏈中第一鏈3，末端如SEQ ID No. 2所示，其 5’末端與第二鏈互補；所述金電極浸入所述部分DNA雙鏈與待測樣品的混合液；
以Ru (phen) 32+、[Ru (bpy) 2dppz]2+ 或[Ru (phen) 2 (dppz) ]2+ 作為電化學發(fā)光探針對 所述金電極進行ECL檢測。本發(fā)明中，所述表面固定有DNA單鏈的金電極優(yōu)選按如下方法制備將直徑為2 5mm金電極浸入DNA單鏈溶液中，反應0. 5 2小時，得到表面固定有DNA單鏈的金電極。 所述DNA單鏈與所述部分DNA雙鏈中第一鏈3，末端如SEQ ID No. 2所示的序列構(gòu)成ATP 適配體，所述 ATP 適配體序列為 5，-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-3，，如 SEQ ID No.4所示。所述固定通過DNA單鏈5’末端修飾巰基固定。DNA單鏈5’末端修飾巰基后為 5 ’ HS- (CH2) 6-ACCTGGGGGAGTAT-3 ’。所述部分DNA雙鏈優(yōu)選按照如下方法制備將ATP適配體分成兩個序列，分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。以SEQ ID No. 2作為部分DNA雙鏈中第一鏈3’末端，部分DNA雙鏈中第一鏈的5’末端與第二鏈互 補，所述第一鏈5 ’末端與其3 ’末端以及所述DNA單鏈不相同且不互補。所述部分DNA雙鏈 中第一鏈序列優(yōu)選為 3’ -TGG AAGGAG GCG TCA AGT TTT TCT AGT CTA TTA TTC-5，。所述 第二鏈優(yōu)選含有20 23個堿基，更優(yōu)選其序列為5’ -CA AAA AGA TCA GAT AAT AAG-3’， 如 SEQ ID No. 3 所示。按照本發(fā)明，還包括將所述金電極浸入所述部分DNA雙鏈與待測樣品的混合液。 所述金電極浸入所述混合液中時間優(yōu)選為0. 5 3小時，更優(yōu)選為0. 5 1小時。在不存 在ATP的情況下，所述DNA單鏈與所述部分DNA雙鏈相互間不結(jié)合，因此很少有DNA雙鏈存 在于電極表面；當有ATP存在時，在ATP誘導下DNA單鏈和DNA雙鏈及ATP結(jié)合，在電極表 面形成復合物。將金電極浸入混合液中后，以Ru (phen) 32+、[Ru(bpy)2dppz]2+或 [Ru (phen) 2 (dppz) ]2+作為電化學發(fā)光探針對所述金電極進行ECL檢測。所述用電化學發(fā)光 探針對所述在待檢測液中浸過的金電極的檢測時間優(yōu)選為0. 5 3小時，更優(yōu)選為1 2 小時。由于釕化合物配體較大的芳香環(huán)具有嵌入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的性能，即不需要化學反應 就可以與DNA結(jié)合，因此，在不存在ATP的情況下，所述DNA單鏈與所述部分DNA雙鏈相互 間不結(jié)合，因此很少有DNA雙鏈存在于電極表面，也就很少有釕化合物到達電極表面，因此 不產(chǎn)生或產(chǎn)生微弱的ECL信號；當有ATP存在時，在ATP誘導下DNA單鏈和部分DNA雙鏈及 ATP結(jié)合，在電極表面形成復合物。作為ECL探針，釕化合物通過嵌入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)到達電 極表面，產(chǎn)生較強的ECL信號，實現(xiàn)了對ATP的檢測。本發(fā)明無需要采用將探針分子標記在 DNA上的方法，方法簡單，實現(xiàn)了對ATP的檢測。所述對金電極進行檢測以草酸鹽或胺類化合物作為共反應劑，所述胺類化合物優(yōu) 選為三丙胺(TPA)或2-二丁基乙醇胺。所述共反應劑具有增強檢測信號的作用。本發(fā)明還提供一種ATP適配體傳感器，包括電化學發(fā)光探針，所述電化學發(fā)光探針為Ru (phen) 32+、[Ru (bpy) 2dppz]2+或 [Ru (phen) 2 (dppz) ]2+ ；表面固定有DNA單鏈的金電極，所述DNA單鏈序列如SEQ ID No. 1所示；部分DNA雙鏈，所述部分DNA雙鏈中第一鏈3，末端如SEQ ID No. 2所示，其5，末
端與第二鏈互補。所述DNA單鏈優(yōu)選通過其5’末端修飾巰基固定于金電極。
按照本發(fā)明，還包括草酸鹽或胺類化合物作為共反應劑，所述胺類化合物為三丙 胺或2-二丁基乙醇胺。為了進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行 描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權(quán) 利要求的限制。實施例1將含有ATP適配體鏈分成兩個序列，如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，分別為 DNA單鏈和部分DNA雙鏈中第一鏈3，末端；提供部分DNA雙鏈中第二鏈，如SEQ ID No. 3所示，DNA雙鏈中第二鏈與所述部分 DNA雙鏈中第一鏈5，末端互補，形成部分DNA雙鏈(part ds-DNA)。實施例2在DNA單鏈的5’末端修飾巰基后，得到序列5’ HS- (CH2) 6_ACCTGGGGGAGTAT_3，；將金電極(直徑3mm)浸入5 μ M的實施例1制備的DNA單鏈的溶液中，1小時后取 出；將所述金電極經(jīng)沖洗后置于IOmM巰基己醇(MCH)溶液中，放置30分鐘；將上述在巰基己醇(MCH)溶液中放置的金電極浸入5 μ M實施例1制備的part ds-DNA和5 μ M ATP的混合溶液中，反應30分鐘后取出；最后，將所述金電極置于20mM Ru(phen)32+溶液中反應lh。ECL檢測在0. 2M磷酸緩沖液(PBS) (pH 7. 5，含20mM草酸鹽作為共反應劑)中進 行，循環(huán)伏安掃描在0-1. 3伏范圍內(nèi)進行，掃速0. 05伏/秒。實施例3在DNA單鏈的5，末端修飾巰基后，將金電極(直徑3mm)浸入5 μ M實施例1制備 的DNA單鏈溶液中，1小時后取出；將所述金電極經(jīng)沖洗后置于IOmM巰基己醇(MCH)溶液中，放置30分鐘；將上述在巰基己醇(MCH)溶液中放置的金電極浸入5 μ M實施例1制備的part ds-DNA和10 μ M ATP的混合溶液中，反應30分鐘后取出；最后，將所述金電極置于20mM Ru (phen) 32+溶液中反應lh。ECL檢測在0. 2M PBS (pH 7. 5，含20mM草酸鹽作為共反應劑)中進行，循環(huán)伏安掃 描在0-1. 3伏范圍內(nèi)進行，掃速0. 05伏/秒。實施例4在DNA單鏈的5，末端修飾巰基后，將金電極(直徑3mm)浸入5 μ M實施例1制備 的DNA單鏈溶液中，1小時后取出；將所述金電極經(jīng)沖洗后置于IOmM巰基己醇(MCH)溶液中，放置30分鐘；將上述在巰基己醇(MCH)溶液中放置的金電極浸入5 μ M實施例1制備的part ds-DNA和100 μ M ATP的混合溶液中，反應30分鐘后取出；最后，將所述金電極置于20mM Ru (phen) 32+溶液中反應lh。ECL檢測在0. 2M PBS (pH 7. 5，含20mM草酸鹽作為共反應劑)中進行，循環(huán)伏安掃 描在0-1. 3伏范圍內(nèi)進行，掃速0. 05伏/秒。實施例5
在DNA單鏈的5 ’末端修飾巰基后，將金電極(直徑3mm)浸入5 μ M實施例1制備 的DNA單鏈溶液中，1小時后取出；將所述金電極沖洗后置于IOmM巰基己醇(MCH)溶液中，放置30分鐘；將上述在巰基己醇(MCH)溶液中放置的金電極浸入5μ M實施例1制備的part ds-DNA和500 μ M ATP的混合溶液中，反應30分鐘后取出；最后，將所述金電極置于20mM Ru(phen)32+溶液中反應lh。ECL檢測在0. 2M PBS (pH 7. 5，含20mM草酸鹽作為共反應劑)中進行，循環(huán)伏安掃 描在0-1. 3伏范圍內(nèi)進行，掃速0. 05伏/秒。實施例6在DNA單鏈的5，末端修飾巰基后，將金電極(直徑3mm)浸入5 μ M實施例1制備 的DNA單鏈溶液中，1小時后取出；將所述金電極沖洗后置于IOmM巰基己醇(MCH)溶液中，放置30分鐘；將上述在巰基己醇(MCH)溶液中放置的金電極浸入5 μ M part ds-DNA和1000 μ M ATP的混合溶液中，反應30分鐘后取出；最后，將所述金電極置于20mM Ru (phen) 32+溶液中反應lh。ECL檢測在0. 2M PBS (pH 7. 5，含20mM草酸鹽作為共反應劑)中進行，循環(huán)伏安掃 描在0-1. 3伏范圍內(nèi)進行，掃速0. 05伏/秒。對實施例2 6中對不同濃度的ATP進行檢測的檢測結(jié)果為ECL響應變化值 Δ Iecl隨著ATP濃度的增大而增大，在6. 4X IO"7 1. OX ICT3M范圍內(nèi)呈線性響應，其ECL 變化值和濃度的線性響應方程為Δ Im(a. u.) = 7.7714CATP(yM)+314.04，相關(guān)系數(shù)為 0. 9986，檢測限為 0. 64 μ M0從上述實施例可以看出，本發(fā)明提供一種ATP的檢測方法，利用了釕化合物配體 較大的芳香環(huán)能嵌入到雙鏈DNA凹槽的特性，無需使用將探針分子化學標記到DNA上的方 法，實現(xiàn)對ATP的檢測，方法簡單。對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。 對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的 一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明 將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一 致的最寬的范圍。
權(quán)利要求
一種ATP含量的檢測方法，包括以下步驟提供表面固定有DNA單鏈的金電極，所述DNA單鏈序列如SEQ ID No.1所示；提供部分DNA雙鏈，所述部分DNA雙鏈中第一鏈3’末端如SEQ ID No.2所示，其5’末端與第二鏈互補；所述金電極浸入所述部分DNA雙鏈與待測樣品的混合液；以Ru(phen)32+、[Ru(bpy)2dppz]2+或[Ru(phen)2(dppz)]2+作為電化學發(fā)光探針對所述金電極進行ECL檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述第一鏈5’末端與其3’末端以及 所述DNA單鏈不相同且不互補。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述第二鏈含有20 23個堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述第二鏈序列如SEQIDNo. 3所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述固定通過DNA單鏈5’末端修飾 巰基固定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述金電極與混合液反應前用巰基 己醇封閉金電極表面的非特異性吸附位點。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述對金電極進行檢測以草酸鹽或 胺類化合物作為共反應劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述胺類化合物為三丙胺或2-二丁 基乙醇胺。
9.一種ATP適配體傳感器，包括電化學發(fā)光探針，所述電化學發(fā)光探針為Ru (phen):、[Ru(bpy)2dppz]2+或 [Ru (phen) 2 (dppz) ]2+ ；表面固定有DNA單鏈的金電極，所述DNA單鏈序列如SEQ ID No. 1所示；部分DNA雙鏈，所述部分DNA雙鏈中第一鏈3，末端如SEQ ID No. 2所示，其5，末端與第二鏈互補。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的ATP適配體傳感器，其特征在于，所述DNA單鏈通過其5’末 端修飾巰基固定于金電極。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的ATP適配體傳感器，其特征在于，還包括草酸鹽或胺類化合 物作為共反應劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的ATP適配體傳感器，其特征在于，所述胺類化合物為三丙胺 或2-二丁基乙醇胺。
全文摘要
本發(fā)明實施例公開了一種ATP含量的檢測方法及ATP適配體傳感器，ATP含量的檢測方法包括提供表面固定有DNA單鏈的金電極，DNA單鏈序列如SEQ ID No.1所示；提供部分DNA雙鏈，部分DNA雙鏈中第一鏈3’末端如SEQ ID No.2所示，其5’末端與第二鏈互補；金電極浸入所述部分DNA雙鏈與待測樣品的混合液；以Ru(phen)32+、[Ru(bpy)2dppz]2+或[Ru(phen)2(dppz)]2+作為電化學發(fā)光探針對金電極進行ECL檢測。本發(fā)明利用釕化合物配體較大的芳香環(huán)具有嵌入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的性能，實現(xiàn)了對ATP的檢測，本發(fā)明提供的檢測方法無需使用化學標記，方法簡單。
文檔編號G01N27/48GK101936945SQ20101027099
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者劉中原, 徐國寶 申請人:中國科學院長春應用化學研究所