專利名稱：基于微納光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于微納光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，尤其是 一種可以提供較大照明能量，并且對(duì)樣品進(jìn)行多方位照明成像的光激活定位顯微成像系 統(tǒng)。
背景技術(shù)：
遠(yuǎn)場光學(xué)熒光顯微鏡具有非接觸性、無損傷性及可探測樣品內(nèi)部等優(yōu)點(diǎn)，其一直 是生命科學(xué)中常用的觀測工具。但是由于衍射極限的存在，即使用油浸物鏡提高數(shù)值孔徑， 傳統(tǒng)的寬場光學(xué)顯微鏡橫向分辨率約為200nm，無法用于觀察細(xì)胞內(nèi)分子尺度的動(dòng)態(tài)和結(jié) 構(gòu)特征。近年來，光激活定位顯微成像技術(shù)利用光激活熒光蛋白特性以及單分子熒光成像 的高定位精度突破了光學(xué)分辨率極限，達(dá)到了 20nm的分辨率。光激活定位顯微成像的基本原理是利用低能量的激活光照射熒光蛋白，單次僅激 活視野下稀疏的熒光蛋白，再使用激發(fā)光進(jìn)行照射，此時(shí)僅處于激活態(tài)的熒光蛋白被激發(fā) 發(fā)出熒光。通過控制激活光光強(qiáng)和激發(fā)光光強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)每個(gè)衍射極限區(qū)域內(nèi)每個(gè)時(shí)刻至多有 一個(gè)熒光分子發(fā)光。對(duì)采集到的單分子信號(hào)進(jìn)行高斯擬合，精確定位各單分子。當(dāng)能精確 定位這些分子后，用激發(fā)光長時(shí)間照射，直至所有激活的熒光蛋白被漂白。然后按照上述步 驟進(jìn)入下一次循環(huán)，利用激活光和激發(fā)光定位其他的熒光分子。當(dāng)視野內(nèi)的熒光蛋白都被 漂白后就得到了視野內(nèi)熒光蛋白精確的定位信息，然后將這些熒光蛋白疊加在一張圖中即 得到了比傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像分辨率高約10倍的超分辨顯微圖像。根據(jù)光激活定位顯微成像技術(shù)的成像原理，其探測到的是單個(gè)熒光蛋白分子發(fā)射 的光強(qiáng)信號(hào)。單個(gè)熒光蛋白分子的信號(hào)很微弱，容易受到背景噪聲的影響。然而探測到的 單分子信號(hào)的信噪比直接影響分辨率，更高的信噪比可以得到更高的分辨率。全內(nèi)反射產(chǎn)生的倏逝場在軸向上只存在于百納米的范圍內(nèi)，并且場強(qiáng)隨著距離的 增加呈指數(shù)衰減。利用倏逝場進(jìn)行照明時(shí)，只有百納米范圍內(nèi)的熒光蛋白被激活激發(fā)，而超 過這個(gè)范圍內(nèi)的熒光蛋白則不受影響，其可以提供更高的信噪比。所以在一般的光激活定 位顯微成像系統(tǒng)中，利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的倏逝場進(jìn)行照明，以減少背景噪聲對(duì)分辨率的影 響?，F(xiàn)有的光激活定位顯微成像系統(tǒng)一般利用大數(shù)值孔徑物鏡產(chǎn)生倏逝場進(jìn)行照明， 其缺點(diǎn)是1)大數(shù)值孔徑增加了系統(tǒng)的成本；2)照明光路和探測光路重合，不易于調(diào)節(jié)光 路；3)根據(jù)全內(nèi)反射原理，只能探測貼壁生長的細(xì)胞的下表面，而無法探測具有生物功能 的細(xì)胞上表面和側(cè)面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，結(jié)合微納光纖技術(shù)，設(shè)計(jì)了一種基于微納 光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，可以提供較大照明能量，并且能對(duì)樣品進(jìn) 行多方位照明成像。
本發(fā)明的技術(shù)方案為基于微納光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，主要由激活激光器11、 成像激光器12、中性濾光片(9，10)、快門及其控制器(7，8)、反射鏡6、二色鏡5、透鏡4、微 納光纖倏逝場照明器1、三維微納調(diào)節(jié)架3、微納光纖探針2、倒置熒光顯微鏡14、子倍增 EMCCD探測器13組成；激活激光器11發(fā)射的激活激光依次經(jīng)過中性濾光片10、快門及其控 制器8、反射鏡6、二色鏡5、透鏡4入射到微納光纖倏逝場照明器1 ；成像激光器12發(fā)射的 成像激光依次經(jīng)過中性濾光片9、快門及其控制器7、二色鏡5、透鏡4入射到微納光纖倏逝 場照明器1 ；微納光纖探針2安裝在三維微納調(diào)節(jié)架3上，微納光纖倏逝場照明器1的微納 光纖段放置在倒置熒光顯微鏡14的樣品池15內(nèi)，用微納光纖探針2撥動(dòng)微納光纖倏逝場 照明器1從而調(diào)節(jié)微納光纖倏逝場照明器1的位置，電子倍增EMCXD探測器13采集倒置熒 光顯微鏡14的物鏡收集到熒光信號(hào)。激活激光器11用于發(fā)出激活激光，根據(jù)使用的熒光 蛋白的激活波段選用適當(dāng)波長的激活激光器；成像激光器12用于發(fā)出成像激光，根據(jù)使用 的熒光蛋白的激發(fā)波段選用適當(dāng)波長的成像激光器；中性濾光片10用于控制激活激光的 強(qiáng)度；中性濾光片9用于控制成像激光的強(qiáng)度；快門及其控制器8用于控制激活激光的照 射時(shí)間；快門及其控制器7用于控制成像激光的照射時(shí)間；反射鏡6用于改變激活激光的 傳播方向；二色鏡5對(duì)上述激活光透射，二色鏡5對(duì)上述成像光反射，并且將上述激活光和 成像光的傳播方向調(diào)節(jié)至一致；透鏡4用于將激活光和成像光耦合入微納光纖倏逝場照明 器；微納光纖倏逝場照明器1用于傳導(dǎo)上述激活光和成像光，同時(shí)產(chǎn)生倏逝場對(duì)樣品進(jìn)行 激活激發(fā)；通過控制三維微納調(diào)節(jié)架3來調(diào)節(jié)微納光纖探針2的三維位置，從而控制上述微 納光纖倏逝場照明器1在樣品池內(nèi)的位置、深度和角度；探測器電子倍增EMCXD13用于采集 倒置熒光顯微鏡14的物鏡收集到熒光信號(hào)。所述的微納光纖倏逝場照明器1，將倏逝場照明器制作在單根光纖上，其特征在 于所述的單根光纖包括普通光纖段16、拉錐段17和微納光纖段18三段，普通光纖段16 為普通的單模光纖，微納光纖段18直徑在100-300nm范圍內(nèi)，普通光纖段用于耦合和傳導(dǎo) 入射光；拉錐段用于將入射光從普通光纖段耦合入微納光纖段；微納光纖段用于產(chǎn)生倏逝 場；微納光纖段的一端面鍍?nèi)瓷淠?，?dāng)光傳輸至微納光纖鍍?nèi)瓷淠ざ嗣鏁r(shí)被全部反射， 端面無出射光；微納光纖段的表面鍍薄層金膜，可以有效的防止周圍環(huán)境散射顆粒對(duì)表面 倏逝場分布的影響。本發(fā)明的特點(diǎn)為1)相對(duì)于傳統(tǒng)的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，其將照明光路和成 像光路分離開，光路調(diào)節(jié)更簡單；2)不需要使用大數(shù)值孔徑的物鏡，減少了系統(tǒng)的成本；3) 通過控制微納光纖的位置可以對(duì)細(xì)胞各表面進(jìn)行成像；4)通過選用適當(dāng)直徑的微納光纖 可以得到較強(qiáng)的倏逝場。


圖1為基于微納光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為微納光纖三維控制示意圖。圖3為微納光纖照明器結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為微納光纖及其表面光強(qiáng)分布示意圖。圖5為光激活定位成像過程中激活成像時(shí)序圖。
具體實(shí)施例方式如圖1所示，本發(fā)明主要由激活激光器11、成像激光器12、中性濾光片(9，10)、快 門及其控制器(7，8)、反射鏡6、二色鏡5、透鏡4、微納光纖倏逝場照明器1、三維微納調(diào)節(jié)架 3、微納光纖探針2、倒置熒光顯微鏡14、電子倍增EMCXD探測器13組成；激活激光器11發(fā) 射的激活激光依次經(jīng)過中性濾光片10、快門及其控制器8、反射鏡6、二色鏡5、透鏡4入射 到微納光纖倏逝場照明器1 ；成像激光器12發(fā)射的成像激光依次經(jīng)過中性濾光片9、快門及 其控制器7、二色鏡5、透鏡4入射到微納光纖倏逝場照明器1 ；微納光纖探針2安裝在三維 微納調(diào)節(jié)架3上，微納光纖倏逝場照明器1的微納光纖段放置在倒置熒光顯微鏡14的樣品 池15內(nèi)，用微納光纖探針撥動(dòng)微納光纖倏逝場照明器從而調(diào)節(jié)微納光纖倏逝場照明器的 位置，電子倍增EMCCD探測器13采集倒置熒光顯微鏡14的物鏡收集到熒光信號(hào)。激活激 光器11用于發(fā)出激活激光，根據(jù)使用的熒光蛋白的激活波段選用適當(dāng)?shù)牟ㄩL的激活激光 器；成像激光器12用于發(fā)出成像激光，根據(jù)使用的熒光蛋白的激發(fā)波段選用適當(dāng)波長的成 像激光器；中性濾光片10用于控制激活激光的強(qiáng)度；中性濾光片9用于控制成像激光的強(qiáng) 度；快門及其控制器8用于控制激活激光的照射時(shí)間；快門及其控制器7用于控制成像激 光的照射時(shí)間；反射鏡6用于改變激活激光的傳播方向；二色鏡5對(duì)上述激活光透射，二色 鏡5對(duì)上述成像光反射，并且將上述激活光和成像光的傳播方向調(diào)節(jié)至一致；透鏡4用于將 激活光和成像光耦合入微納光纖倏逝場照明器；微納光纖倏逝場照明器1用于傳導(dǎo)上述激 活光和成像光，同時(shí)產(chǎn)生倏逝場對(duì)樣品進(jìn)行激活激發(fā)；如圖2所示，通過控制三維微納調(diào)節(jié) 架3來調(diào)節(jié)微納光纖探針2的三維位置，從而控制上述微納光纖倏逝場照明器1在樣品池 內(nèi)的位置、深度和角度；探測器電子倍增EMCXD13用于采集倒置熒光顯微鏡14的物鏡收集 到熒光信號(hào)。實(shí)施例一利用基于微納光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)生物 細(xì)胞的超分辨顯微成像。如圖1為利用基于微納光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)生物 細(xì)胞的超分辨顯微成像的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。實(shí)驗(yàn)樣品為熒光蛋白dronpa標(biāo)記的hek293細(xì) 胞的BK通道的β亞基。激活激光的波長為405nm，成像激光的波長為473nm。反射鏡6和 二色鏡5將激活光和成像光的傳播方向調(diào)節(jié)至相同。透鏡4用于將激活光和成像光耦合入 微納光纖倏逝場照明器1。三維微納調(diào)節(jié)架3及其微納光纖探針2用于調(diào)節(jié)微納光纖倏逝 場照明器1的三維位置，其具體結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。中性濾光片10、快門及其控制器8 分別用于控制激活激光的光強(qiáng)和照射時(shí)間。中性濾光片9、快門及其控制器7分別用于控制 成像激光的光強(qiáng)和照射時(shí)間。如圖3所示，所述的微納光纖倏逝場照明器1，將倏逝場照明器制作在單根光纖 上，其特征在于所述的單根光纖包括普通光纖段16、拉錐段17和微納光纖段18三段，普 通光纖段16直徑dl = 125 μ m,拉錐段17長度L = 10 μ m,微納光纖段18直徑為d2 = 200nm，普通光纖段用于耦合和傳導(dǎo)入射光；拉錐段用于將入射光從普通光纖耦合入微納光 纖段；微納光纖段用于產(chǎn)生倏逝場；微納光纖段的一端面鍍?nèi)瓷淠?，?dāng)光傳輸至微納光 纖鍍?nèi)瓷淠ざ嗣鏁r(shí)被全部反射；微納光纖段的表面鍍厚度為50nm的金膜，可以有效的防 止周圍環(huán)境中的散射可以對(duì)表面倏逝場分布的影響。直徑為200nm的微納光纖段18及其表面光強(qiáng)分布如圖4所示。 將樣品細(xì)胞置于倒置顯微鏡14的載物臺(tái)上，移動(dòng)載物臺(tái)將需要成像的細(xì)胞移入 視野內(nèi)，然后調(diào)節(jié)三維微納調(diào)節(jié)架3將微納光纖倏逝場照明器移入視野內(nèi)，利用倏逝場激 活激發(fā)熒光蛋白dronpa。根據(jù)樣品實(shí)際情況選取合適激活激光光強(qiáng)，激活激光照射時(shí)間， 成像激光光強(qiáng)，成像激光照射時(shí)間，并通過中性濾光片(10，9)和快門及其控制器(8，7)實(shí) 現(xiàn)上述參數(shù)的控制。成像過程中激活成像時(shí)序如圖5所示。根據(jù)樣品實(shí)際情況選取合適的 EMCCD采圖參數(shù)，如曝光時(shí)間和增益等，然后開始采集一系列成像圖。最后經(jīng)過后期的數(shù)據(jù) 處理，精確定位采集到的單分子，并進(jìn)行疊加得到最終的超分辨顯微成像重構(gòu)圖。
權(quán)利要求
基于微納光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，主要由激活激光器、成像激光器、中性濾光片、快門及其控制器、反射鏡、二色鏡、透鏡、微納光纖倏逝場照明器、三維微納調(diào)節(jié)架、微納光纖探針、倒置熒光顯微鏡、探測器電子倍增EMCCD組成；其特征在于激活激光器發(fā)射的激活激光依次經(jīng)過中性濾光片、快門及其控制器、反射鏡、二色鏡、透鏡入射到微納光纖倏逝場照明器；成像激光器發(fā)射的成像激光依次經(jīng)過中性濾光片、快門及其控制器、二色鏡、透鏡入射到微納光纖倏逝場照明器；微納光纖探針安裝在三維微納調(diào)節(jié)架上，微納光纖倏逝場照明器的微納光纖段放置在倒置熒光顯微鏡的樣品池內(nèi)，用微納光纖探針撥動(dòng)微納光纖倏逝場照明器從而調(diào)節(jié)微納光纖倏逝場照明器的位置，探測器電子倍增EMCCD采集倒置熒光顯微鏡的物鏡收集到熒光信號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于微納光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，其 特征在于將倏逝場照明器制作在單根光纖上，所述的單根光纖包括普通光纖段、拉錐段和 微納光纖段三段，普通光纖段為普通的單模光纖，微納光纖段直徑在100-300·范圍內(nèi)，普 通光纖段用于耦合和傳導(dǎo)入射光；拉錐段用于將入射光從普通光纖耦合入微納光纖段；微 納光纖段用于產(chǎn)生倏逝場；微納光纖段的一端面鍍?nèi)瓷淠?，?dāng)光傳輸至微納光纖鍍?nèi)?射膜端面時(shí)被全部反射，端面無出射光；微納光纖段的表面鍍薄層金膜。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于微納光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統(tǒng)，連接如下激活激光器發(fā)射的激活激光依次經(jīng)過中性濾光片、快門及其控制器、反射鏡、二色鏡、透鏡入射到微納光纖倏逝場照明器；成像激光器發(fā)射的成像激光依次經(jīng)過中性濾光片、快門及其控制器、二色鏡、透鏡入射到微納光纖倏逝場照明器；微納光纖探針安裝在三維微納調(diào)節(jié)架上，微納光纖倏逝場照明器的微納光纖段放置在倒置熒光顯微鏡的樣品池內(nèi)，用微納光纖探針撥動(dòng)微納光纖倏逝場照明器從而調(diào)節(jié)其位置，探測器電子倍增EMCCD采集倒置熒光顯微鏡的物鏡收集到熒光信號(hào)。本發(fā)明將照明光路和成像光路分離開，光路調(diào)節(jié)更簡單；不需要使用大數(shù)值孔徑的物鏡減少系統(tǒng)的成本；通過控制微納光纖倏逝場照明器的三維位置對(duì)細(xì)胞各表面進(jìn)行成像。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101949848SQ20101027552
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者付玲, 呂曉華, 曾紹群, 駱清銘, 黃振立 申請人:華中科技大學(xué)