專利名稱：毛細(xì)管電泳電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)雪卡毒素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及毛細(xì)管電泳電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)，具體地說(shuō)是毛細(xì)管電泳酶聯(lián)免 疫分析法檢測(cè)雪卡毒素。
背景技術(shù)：
雪卡毒素(Ciguatoxin，CTX)，又名西加魚毒素，是一種危害性較為嚴(yán)重的海洋藻 類毒素，主要來(lái)源于一種腰鞭毛藻2 R比爾盤藻。人攝食了含有雪卡毒素的珊瑚魚而引起 的食源性疾病稱為雪卡魚中毒，是目前世界上報(bào)道最多的海洋生物毒素性疾病。由于雪卡 毒素在魚體內(nèi)含量很低，而且CTX污染的魚類在感觀、嗅覺(jué)和味覺(jué)上均沒(méi)有什么異常，不易 用簡(jiǎn)單的常規(guī)方法檢測(cè)到。因此，至今尚未建立一種簡(jiǎn)便、快速的可信賴的檢測(cè)方法。目前 國(guó)內(nèi)外已有多種檢測(cè)方法，但是每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，主要的方法有小鼠生物法、細(xì)胞 毒性試驗(yàn)、高效液相色譜_質(zhì)譜分析、免疫測(cè)定法等。小鼠生物法具有可靠性強(qiáng)、能表達(dá)出樣品中實(shí)際毒性、不需復(fù)雜設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，但其 缺點(diǎn)是特異性差、靈敏度低、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性差、不能斷定個(gè)體毒素成分、操作要求較高技 巧、對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的種系及體重要求苛刻。細(xì)胞毒性試驗(yàn)的缺點(diǎn)是特異性差，不能確定毒素的 準(zhǔn)確成分，實(shí)驗(yàn)配置及操作人員的技術(shù)要求高。高效液相色譜_質(zhì)譜分析需要昂貴的設(shè)備 及高素質(zhì)的操作人員，樣品前處理要求較高，毒素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，不能同時(shí)檢測(cè)大量樣品 等。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)利用抗原與抗體專一、特異結(jié)合的特點(diǎn)，對(duì)毒素進(jìn)行定性定量的檢測(cè)， 具有準(zhǔn)確、靈敏、便利等優(yōu)點(diǎn)，但普通免疫測(cè)定法耗時(shí)較長(zhǎng)，靈敏度不夠。由于目前缺乏一種 簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，因此對(duì)雪卡魚中毒沒(méi)有很好的防預(yù)措施，為了保證魚類食用的安全 性，需要建立合適的雪卡毒素的檢測(cè)技術(shù)。毛細(xì)管電泳免疫分析法將毛細(xì)管電泳技術(shù)引入免疫分析中來(lái)，使其具有以下三個(gè) 方面的突出優(yōu)點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了極低的檢測(cè)量的檢測(cè)；由于擴(kuò)散路徑縮短，使得免疫反應(yīng)孵化時(shí) 間大大減少，對(duì)于25 μ L毛細(xì)管，從管中心到表面的擴(kuò)散距離約是0. 0125cm，而一般的免疫 板，這個(gè)距離為0. 35cm,由于時(shí)間與距離具有平方的關(guān)系，所以后者的擴(kuò)散時(shí)間大約是前者 的784倍；酶催化產(chǎn)物的稀釋極大減小，可以大大縮短酶催化放大時(shí)間。幾個(gè)方面改進(jìn)的綜 合結(jié)果，使得由原來(lái)幾個(gè)小時(shí)的測(cè)定時(shí)間縮短到了十幾分鐘甚至更短。但目前為止，基于毛 細(xì)管電泳電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析的檢測(cè)雪卡毒素的方法還未見報(bào)道。納米技術(shù)的飛速發(fā)展為納米粒子在生物傳感器和生物分析中的應(yīng)用開辟了新的 方向。由于獨(dú)特的物理、化學(xué)性質(zhì)，納米粒子引起了納米科學(xué)工作者極大興趣。這些性質(zhì)使 其在化學(xué)和生物傳感方面具有廣闊的應(yīng)用前景。膠體金和半導(dǎo)體量子點(diǎn)納米粒子在生物分 析中應(yīng)用得尤其廣泛。納米粒子放大標(biāo)記以及納米粒子_生物分子的自組裝產(chǎn)生極大的信 號(hào)增強(qiáng)作用，為構(gòu)建超靈敏的光學(xué)和電學(xué)檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，其靈敏度可與聚合物酶鏈反應(yīng) (PCR)相媲美。本發(fā)明將毛細(xì)管電泳電化學(xué)方法和酶聯(lián)免疫分析相結(jié)合，以HRP為標(biāo)記酶，制備 了膠體金酶標(biāo)抗體作為探針，選擇高靈敏度的供氫體為底物，酶催化反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電
3泳分離后用微電極進(jìn)行安培檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)雪卡毒素的快速在線檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間由常規(guī)免疫 分析Id以上縮短至幾分鐘，操作簡(jiǎn)便，試劑消耗量少，可用于定性、定量檢測(cè)海洋貝類及魚 類中的雪卡毒素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)雪卡毒素的方法，該方法簡(jiǎn)化了樣品處理過(guò)程、操 作程序簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏快速，特別適用于魚類樣品中雪卡毒素含量的快速檢測(cè)。本方法所用儀器裝置為實(shí)驗(yàn)采用柱端式安培檢測(cè)毛細(xì)管電泳_電化學(xué)檢測(cè)系 統(tǒng)購(gòu)自西安瑞邁分析儀器有限公司，包括一臺(tái)高壓電源(MPI-A型)，一臺(tái)電化學(xué)分析儀 (MPI-A型)，三維檢測(cè)池；三電極系統(tǒng)鉬工作電極，Ag-AgCl參比電極，鉬對(duì)電極；數(shù)字式 恒溫水浴箱(浙江余姚工業(yè)儀表二廠)。聚丙烯酰胺脂內(nèi)涂層毛細(xì)管(50ym ID, 375 μ m 0D)購(gòu)自美國(guó)賽分科技有限公司有限公司。分離管長(zhǎng)度為30cm，反應(yīng)管長(zhǎng)度為6cm。所用試劑為鄰氨基酚、磷酸、硼酸、醋酸、氫氧化鈉、辣根過(guò)氧化物酶(上海雪滿 生物科技有限公司)，雪卡毒素診斷試劑條(美國(guó)，Abraxis公司)，其他試劑為分析純，所 有溶液均用二次蒸餾水配制，所有緩沖液及樣品溶液在使用前均需用0. 22 μ m微孔濾膜濾 過(guò)，且在臨用前進(jìn)行超聲脫氣處理。本發(fā)明所述的溶液配制方法具體陳述如下=H2O2溶液取市售30%的11. 3 μ L，用 二次水稀釋到lOOmL，濃度為1.0X10_3mol/L，用時(shí)現(xiàn)配；OAP溶液準(zhǔn)確稱取鄰氨基酚(分 析純)0. 109g，用IOmL乙醇溶解并用水定容至IOOmL,濃度為1. 0 X 10_2mol/L，使用時(shí)可用 二次蒸餾水再稀釋；1. OX 10_2mOl/L BR緩沖溶液。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為1)膠體金酶標(biāo)抗體探針的制備利用膠體金作為固相載體，將酶和抗體同時(shí)固定在其表面，增加酶的固定量，提高 檢測(cè)靈敏度。將3yL 5. Omg/mL HRP加入100 μ L含有0. 04%檸檬酸三鈉、0. 26mM K2CO3 > 0. 02% NaN3的膠體金標(biāo)記的抗體溶液中，室溫下攪拌2h后，加入ImL 1 % BSA溶液反應(yīng) 30min, 15，OOOrpm轉(zhuǎn)速下離心20min，通過(guò)直徑0. 22 μ m的聚丙烯微孔濾膜過(guò)濾，4°C冰箱保
存?zhèn)溆谩?)、雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)采用非競(jìng)爭(zhēng)模式，將一系列不同濃度的雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品和膠體金酶標(biāo)抗體探針加 入微富集管，于37°C水浴中孵育30min，取出后用緩沖溶液稀釋到200 μ L，壓力進(jìn)樣，運(yùn)行 電泳并記錄。2)、魚類樣品處理將魚肉和內(nèi)臟樣品在70°C水浴中溫育15min，勻漿機(jī)勻漿后， 加入一定量雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品，依次用丙酮(3L/kg樣品)和80%丙酮(0. 5L/Kg樣品)提 取，過(guò)濾，丙酮提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾干，殘留物以90%甲醇(0. 5L/Kg樣品)和正己烷 (1 Iv v2)萃取，甲醇相再次用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾干，殘留物以25%乙醇(0.5L/Kg樣 品)和乙醚(1 1 ν ν)萃取，收集乙醚組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾干，殘留物以氯仿-甲醇 (97 3 ν ν)溶解，氮?dú)鉂饪s儀吹干得到毒素粗提物。毒素粗提物溶于ImL氯仿，以3mL 氯仿-甲醇(9 1 ν ν)洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，加入ImL甲醇溶解，0.22 μ m濾膜 過(guò)濾。在上述處理的貝類樣品溶液中加入一定量的膠體金酶標(biāo)抗體孵育30min ；取出后用緩沖溶液稀釋到200μ L，在最佳檢測(cè)條件下運(yùn)行電泳并記錄。所述緩沖液為BR緩沖液，由磷酸、醋酸、硼酸加過(guò)氧化氫溶液配制而成。所述底物為鄰氨基酚；所述酶為辣根過(guò)氧化物酶。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明將毛細(xì)管電泳、酶催化反應(yīng)、電化學(xué)檢測(cè)和免疫分析結(jié)合起來(lái)，既具有毛 細(xì)管電泳的高分離效率、電化學(xué)分析的高靈敏度，又具有免疫分析的高選擇性和專一性，用 于魚類樣品中雪卡毒素的檢測(cè)，避免了魚類樣品前處理中需要過(guò)離子交換柱的煩瑣程序， 簡(jiǎn)化了操作步驟。2、將毛細(xì)管電泳電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析法應(yīng)用于雪卡毒素的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間由常規(guī) 免疫分析1天以上縮短至幾分鐘，操作簡(jiǎn)便快速，試劑消耗量少。3、采用雙重放大技術(shù)，提高檢測(cè)靈敏度。結(jié)合納米技術(shù)，制備膠體金酶標(biāo)抗體探 針，利用膠體金作為固相載體，將酶和抗體同時(shí)固定在其表面，增加酶的固定量，提高每個(gè) 結(jié)合過(guò)程標(biāo)記物的數(shù)量，從而放大信號(hào)；利用酶的高特殊活性，可以在短時(shí)間內(nèi)將大量底物 分子轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，使信號(hào)放大。4、雪卡毒素免疫混合物在分離過(guò)程中使用緩沖液壓池和底物液壓池確保分離毛 細(xì)管兩端壓力平衡，整個(gè)分離過(guò)程只有電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)力，分離效率高，同時(shí)由于壓力的作用也確 保底物進(jìn)入反應(yīng)毛細(xì)管。4、利用免疫反應(yīng)的專一性，將雪卡毒素免疫復(fù)合物及游離的膠體金酶標(biāo)抗體探針 經(jīng)毛細(xì)管電泳分離后，可實(shí)現(xiàn)毛細(xì)管電泳電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定雪卡毒素。


圖1為雪卡毒素CTX3C的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖2為本發(fā)明檢測(cè)雪卡毒素的反應(yīng)原理示意圖；圖3為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中膠體金酶標(biāo)抗體探針的毛細(xì)管電泳譜圖；峰1為溶 液中過(guò)量的HRP催化底物形成的電泳峰，峰2為膠體金酶標(biāo)抗體探針催化底物形成的電泳 峰；圖4為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中標(biāo)準(zhǔn)樣品中不同濃度免疫復(fù)合物的毛細(xì)管電泳譜圖， 峰1為溶液中過(guò)量的HRP催化底物形成的電泳峰，峰2為膠體金酶標(biāo)抗體探針催化底物形 成的電泳峰；峰3為膠體金酶標(biāo)抗體_抗原復(fù)合物催化底物形成的電泳峰；圖5為本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中模擬魚類樣品中的雪卡毒素與膠體金酶標(biāo)抗體反應(yīng) 后的毛細(xì)管電泳譜圖，峰1為溶液中過(guò)量的HRP催化底物形成的電泳峰，峰2為膠體金酶標(biāo) 抗體探針催化底物形成的電泳峰；峰3為膠體金酶標(biāo)抗體_抗原復(fù)合物催化底物形成的電 泳峰。
具體實(shí)施例方式以下為實(shí)施本發(fā)明的具體示例，其作用在于進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，使閱讀者 更容易理解，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明要求的保護(hù)范圍的限定或限制。 實(shí)施例一毛細(xì)管電泳電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的雪卡毒素
所用儀器及試劑如前所述。
利用膠體金作為固相載體，將酶和抗體同時(shí)固定在其表面，增加酶的固定量，提高 檢測(cè)靈敏度。為了使每個(gè)膠體金上負(fù)載更多的酶分子，膠體金與酶反應(yīng)時(shí)，HRP保持過(guò)量。 圖3為膠體金酶標(biāo)抗體探針的毛細(xì)管電泳譜圖，峰1為溶液中過(guò)量的HRP催化底物形成的 電泳峰，峰2為膠體金酶標(biāo)抗體探針催化底物形成的電泳峰，說(shuō)明酶成功標(biāo)記在膠體金上。采用非競(jìng)爭(zhēng)模式，將一系列不同濃度的雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品和膠體金酶標(biāo)抗體加入微 富集管，于37°C水浴中孵育30min，取出后用緩沖溶液稀釋到200 μ L，壓力進(jìn)樣(9cm，20s)， 運(yùn)行電泳并記錄。采用非競(jìng)爭(zhēng)模式，膠體金酶標(biāo)抗體(AuNP-Ab*)過(guò)量，樣品溶液在孵育后 既含有膠體金酶標(biāo)抗體_抗原結(jié)合物(Ag-AuNP-Ab*)，又含有未反應(yīng)的膠體金酶標(biāo)抗體探 針(AuNP-Ab*)。膠體金酶標(biāo)抗體-抗原結(jié)合物(Ag-AuNP-Ab*)和剩余膠體金酶標(biāo)抗體探 針根據(jù)遷移速率不同在分離毛細(xì)管中分成不同的區(qū)帶，并順次進(jìn)入反應(yīng)毛細(xì)管中，分別在 反應(yīng)毛細(xì)管中催化緩沖液中的過(guò)氧化氫氧化底物鄰氨基酚，生成具有電化學(xué)活性的物質(zhì) 3_氨基吩噁嗪，進(jìn)入電化學(xué)檢測(cè)池進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)到三個(gè)電泳峰(圖4)，分別為溶液中過(guò) 量的HRP催化底物形成的電泳峰，膠體金酶標(biāo)抗體探針催化底物形成的電泳峰；膠體金酶 標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物催化底物形成的電泳峰。雪卡毒素的濃度不同，形成的雪卡抗原抗體 結(jié)合物的量不同，催化過(guò)氧化氫氧化鄰氨基酚生成氧化產(chǎn)物3-氨基吩噁嗪的濃度就不同， 產(chǎn)生不同的電化學(xué)信號(hào)，由此可對(duì)酶標(biāo)雪卡毒素-抗體復(fù)合物以及魚類樣品中的雪卡毒素 進(jìn)行定量分析?？疾炝诉\(yùn)行緩沖溶液濃度和pH值、分離電壓、檢測(cè)電勢(shì)、進(jìn)樣時(shí)間和電壓對(duì)雪卡 毒素檢測(cè)的影響，確定最佳檢測(cè)條件是1.0X10_2mOl/L BR緩沖溶液(pH 5.0)；分離電壓 15kV ；檢測(cè)電勢(shì)-35OmV ；壓力進(jìn)樣(9cm, 20s)。在最佳檢測(cè)條件下，雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液檢測(cè)的線性范圍為1. 0-50. Opg/mL，檢測(cè) 限為0. 3pg/mL。工作曲線的線性回歸方程為y = -0. 0277x+l. 4825 (其中χ為雪卡毒素濃 度，pg/mL, y為峰面積，μ C，η = 5)，其相關(guān)系數(shù)Y=O. 9914。實(shí)施例二使用毛細(xì)管電泳電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析方法檢測(cè)模擬魚類樣品中的雪卡
毒素將雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品加入魚類樣品中模擬實(shí)際樣品檢測(cè)將魚肉和內(nèi)臟樣品在 70°C水浴中溫育15min，勻漿機(jī)勻漿后，加入一定量雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品，依次用丙酮(3L/kg樣 品)和80%丙酮(0. 5L/Kg樣品)提取，過(guò)濾，丙酮提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾干，殘留物以 90%甲醇(0.5L/Kg樣品)和正己烷(1 1 ν ν 2)萃取，甲醇相再次用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾 干，殘留物以25%乙醇(0.5L/Kg樣品)和乙醚(1 1 ν ν)萃取，收集乙醚組分，旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀蒸餾干，殘留物以氯仿-甲醇(97 3 ν ν)溶解，氮?dú)鉂饪s儀吹干得到毒素粗提物。 毒素粗提物溶于ImL氯仿，以3mL氯仿-甲醇(9 1 ν ν)洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈桑?加入ImL甲醇溶解，0.22 um濾膜過(guò)濾。在上述處理的魚類樣品溶液中加入過(guò)量膠體金酶標(biāo)抗體，在37°C孵化反應(yīng) 30min,魚類樣品中的雪卡毒素和膠體金酶標(biāo)抗體反應(yīng)，進(jìn)行電泳分離檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)采用非競(jìng)爭(zhēng)模式，由于膠體金酶標(biāo)抗體探針過(guò)量，樣品溶液在孵育后既含 有膠體金酶標(biāo)抗體_抗原結(jié)合物(Ag-AuNP-Ab*)，又含有未反應(yīng)的膠體金酶標(biāo)抗體探針 (AuNP-Ab*)及游離的 HRP。經(jīng)毛細(xì)管電泳分離后，分別在反應(yīng)毛細(xì)管中催化底物溶液反應(yīng)，可檢測(cè)到三個(gè)電
6泳峰，分別為溶液中過(guò)量的HRP催化底物形成的電泳峰，膠體金酶標(biāo)抗體探針催化底物形 成的電泳峰；膠體金酶標(biāo)抗體_抗原復(fù)合物催化底物形成的電泳峰。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，膠體金酶標(biāo)抗體探針從毛細(xì)管入口端進(jìn)樣，在14kV高壓電場(chǎng)下向陰 極遷移，進(jìn)入電化學(xué)檢測(cè)池進(jìn)行檢測(cè)，出現(xiàn)2個(gè)電泳峰，峰1為溶液中過(guò)量的HRP催化底物 形成的電泳峰(150s附近)，出現(xiàn)在200s附近的峰2為膠體金酶標(biāo)抗體探針催化底物形成 的電泳峰。如圖4所示，雪卡毒素與過(guò)量的膠體金酶標(biāo)抗體溶液在37°C孵化反應(yīng)30min，形成 膠體金酶標(biāo)抗體_抗原結(jié)合物結(jié)合物，將混合溶液14kV電動(dòng)進(jìn)樣5s后進(jìn)行電泳分離檢測(cè)。 峰1為溶液中過(guò)量的HRP催化底物形成的電泳峰(150s附近)，峰2為膠體金酶標(biāo)抗體探針 催化底物形成的電泳峰(200s附近)；峰3為膠體金酶標(biāo)抗體_抗原復(fù)合物催化底物形成 的電泳峰(250s附近)。三個(gè)電泳峰峰形較好，可以達(dá)到基線分離。隨著雪卡毒素抗原濃度 的增大，峰2逐漸變小，峰3逐漸變大，根據(jù)非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析的原理，峰2為膠體金酶標(biāo)抗體 探針催化底物形成的電泳峰；峰3為膠體金酶標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物催化底物形成的電泳峰。如圖5所示，將雪卡毒素加入魚類樣品模擬實(shí)際樣品檢測(cè)，魚類樣品中的雪卡毒 素同膠體金酶標(biāo)抗體反應(yīng)，生成膠體金酶標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物(峰3)，說(shuō)明本方法可用于實(shí) 際樣品檢測(cè)，樣品中的物質(zhì)不會(huì)干擾本方法。
權(quán)利要求
毛細(xì)管電泳電化學(xué)酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)雪卡毒素的方法，其特征在于以生物酶作為標(biāo)記物，將酶催化反應(yīng)、免疫技術(shù)和電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合，利用毛細(xì)管電泳分離技術(shù)檢測(cè)鄰氨基酚 H2O2 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)體系中的HRP含量，從而間接檢測(cè)貝類樣品中的雪卡毒素。
2.按照權(quán)利要求1所述檢測(cè)雪卡毒素的方法，其特征在于膠體金酶標(biāo)抗體探針的制 備利用膠體金作為固相載體，將酶和抗體同時(shí)固定在其表面，增加酶的固定量，提高檢測(cè) 靈敏度。將3yL 5. Omg/mL HRP 加入 100 μ L 含有 0. 04% 檸檬酸三鈉、0. 26mM K2C03>0. 02% NaN3的膠體金標(biāo)記的抗體溶液中，室溫下攪拌2h后，加入ImL 1 % BSA溶液反應(yīng)30min， 15，OOOrpm轉(zhuǎn)速下離心20min，通過(guò)直徑0. 22 μ m的聚丙烯微孔濾膜過(guò)濾，4°C冰箱保存?zhèn)?用。
3.按照權(quán)利要求1所述檢測(cè)雪卡毒素的方法，其特征在于采用非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法將 雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品與過(guò)量膠體金酶標(biāo)抗體探針進(jìn)行孵化反應(yīng)，由于膠體金酶標(biāo)抗體探針過(guò) 量，樣品溶液在孵育后既含有膠體金酶標(biāo)抗體_抗原結(jié)合物，又含有未反應(yīng)的膠體金酶標(biāo) 抗體探針。
4.按照權(quán)利要求1所述檢測(cè)雪卡毒素的方法，其特征在于采用毛細(xì)管電泳_電化學(xué)酶 聯(lián)免疫分析法檢測(cè)將權(quán)利要求3中的混合液中進(jìn)樣，膠體金酶標(biāo)抗體-抗原結(jié)合物和剩余 膠體金酶標(biāo)抗體探針根據(jù)遷移速率不同在分離毛細(xì)管中分成不同的區(qū)帶，并順次進(jìn)入反應(yīng) 毛細(xì)管中，催化緩沖液中的過(guò)氧化氫氧化底物，生成具有電化學(xué)活性的物質(zhì)，進(jìn)入電化學(xué)檢 測(cè)池進(jìn)行檢測(cè)。
5.按照權(quán)利要求1所述檢測(cè)雪卡毒素的方法，其特征在于將雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品加入魚 類樣品中模擬實(shí)際樣品檢測(cè)將魚肉和內(nèi)臟樣品在70°C水浴中溫育15min，勻漿機(jī)勻漿后， 加入一定量雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品，依次用丙酮(3L/kg樣品)和80%丙酮(0. 5L/Kg樣品)提 取，過(guò)濾，丙酮提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾干，殘留物以90%甲醇(0. 5L/Kg樣品)和正己烷 (1 Iv v2)萃取，甲醇相再次用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾干，殘留物以25%乙醇(0.5L/Kg樣 品)和乙醚(1 1 ν ν)萃取，收集乙醚組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾干，殘留物以氯仿-甲醇 (97 3 ν ν)溶解，氮?dú)鉂饪s儀吹干得到毒素粗提物，毒素粗提物溶于ImL氯仿，以3mL 氯仿-甲醇(9 1 ν ν)洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，加入ImL甲醇溶解，0.22 μ m濾膜 過(guò)濾ο
6.按照權(quán)利要求1所述檢測(cè)雪卡毒素的方法，其特征在于所述緩沖液為BR緩沖液， 其配制方法為取磷酸、醋酸、硼酸溶解稀釋，用氫氧化鈉調(diào)PH后加入過(guò)氧化氫溶液定容。
7.按照權(quán)利要求4所述檢測(cè)雪卡毒素的方法，其特征在于所述底物為鄰氨基酚。
8.按照權(quán)利要求4所述檢測(cè)雪卡毒素的方法，其特征在于所述酶為辣根過(guò)氧化物酶。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種測(cè)定貝類樣品中遺忘性貝類毒素的新型毛細(xì)管電泳電化學(xué)酶聯(lián)免疫方法。制備了膠體金HRP酶標(biāo)雪卡毒素抗體探針，采用非競(jìng)爭(zhēng)模式，樣品溶液與膠體金酶標(biāo)雪卡毒素抗體反應(yīng)，膠體金酶標(biāo)抗體過(guò)量。膠體金酶標(biāo)抗體-抗原結(jié)合物和剩余膠體金酶標(biāo)抗體探針根據(jù)遷移速率不同在分離毛細(xì)管中分成不同的區(qū)帶，并順次進(jìn)入反應(yīng)毛細(xì)管中，經(jīng)毛細(xì)管電泳分離后，分別在反應(yīng)毛細(xì)管中催化緩沖液中的過(guò)氧化氫氧化底物鄰氨基酚，生成具有電化學(xué)活性的物質(zhì)3-氨基吩噁嗪，進(jìn)入電化學(xué)檢測(cè)池進(jìn)行檢測(cè)。雪卡毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液檢測(cè)的線性范圍為1.0-50.0pg/mL，檢測(cè)限為0.3pg/mL。
文檔編號(hào)G01N27/447GK101963614SQ20101027732
公開日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者張書圣, 張召香, 李曉琳, 李雪梅, 梅振華, 葛安青 申請(qǐng)人:青島科技大學(xué)