專利名稱：檢測尿中嗎啡類生物堿的柱切換lc-ms/ms分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測尿中嗎啡類生物堿的柱切換LC-MS/MS分析方法，具體涉及 一種檢測尿樣中的嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因或乙酰可待因的柱切換LC-MS/MS分析方 法。
背景技術(shù)：
近年來隨著國際毒潮持續(xù)泛濫，境外毒品對我國的侵襲日益加劇，吸食或注射海 洛因的人員也越來越多。為了打擊毒犯，維護(hù)正義，禁毒部門逐年加大對毒品案件的偵查力 度。禁毒部門在偵破毒品案件時(shí)，為了定性檢測吸毒嫌疑人體液中的毒品，常使用單抗免疫 檢測試劑盒，但是單抗免疫檢測試劑盒容易受到某些藥物的干擾出現(xiàn)假陽性，不能直接單 獨(dú)用作吸毒案件的定性依據(jù)，因此對這類人群體液中定性檢驗(yàn)毒品，從而判斷他們是否吸 食毒品海洛因尤為重要。海洛因進(jìn)入人體后，在體內(nèi)代謝很快，幾乎檢測不到原體海洛因， 而且海洛因在人體內(nèi)很快代謝為嗎啡和單乙酰嗎啡，而嗎啡屬于水溶性藥物，極性較大，應(yīng) 用氣相色譜直接分析較為困難，而且靈敏度低。目前，氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析尿中嗎 啡已有很多報(bào)道，但是對檢材必須采用混合溶劑(氯仿異丙醇=9 1)提取、丙酸酐衍 生化后用GC-MS進(jìn)行定性分析，樣品處理繁瑣、難以滿足實(shí)際案件快速檢驗(yàn)的需要。樣品前處理是生物樣品分析方法中一個(gè)非常重要的步驟，也是比較費(fèi)時(shí)、工作量 大的過程。柱切換技術(shù)，通過閥切換將處理試樣與分析統(tǒng)一在一個(gè)系統(tǒng)中，不僅增加了樣品 處理的安全性，而且減少了人為因素影響，提高了準(zhǔn)確度和精密度。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (LC-MS/MS)技術(shù)集液相色譜高效的在線分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性于一體，正 成為法醫(yī)毒物分析強(qiáng)有力的工具。多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式通過兩次離子選擇作用，鎖定目 標(biāo)物的母離子_子離子對，大大提高了分析的專一性和靈敏度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測尿中嗎啡類生物堿的柱切換LC-MS/ MS分析方法，通過儀器改裝，將柱切換技術(shù)與LC-MS/MS聯(lián)用，使得待測尿樣無需前處理， 可直接進(jìn)樣，大大簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了分析時(shí)間，降低了成本，同時(shí)，本發(fā)明的柱切換 LC-MS/MS分析方法快速、靈敏、可靠，可廣泛應(yīng)用于實(shí)際案例的分析。本發(fā)明所述的柱切換LC-MS/MS分析方法，包括如下步驟1)配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥系統(tǒng)為了實(shí)現(xiàn)柱切換，本發(fā)明的分析方法至少需配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥 系統(tǒng)，所述系統(tǒng)具體包括十通切換閥1、四元梯度泵2、高壓二元泵3、進(jìn)樣器4、預(yù)處理柱5、 分析柱6和檢測器7。其中，十通切換閥1的接口⑤與四元梯度泵2連接；十通切換閥1的 接口⑩與高壓二元泵3通過進(jìn)樣器4連接；十通切換閥1的接口④、⑨分別與預(yù)處理柱5的 兩端相連；分析柱6的一端與十通切換閥1的接口⑧相連，另一端與檢測器7連接。所述四元梯度泵2為Waters Alliance 2695泵，高壓二元泵3為Watersl525泵，檢測器7為Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜。所述的雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥系統(tǒng)的具體流路過程如下a.初始狀態(tài)1(參見圖1)四元梯度泵2輸送分析流動(dòng)相，依次通過十通切換閥1 的接口⑤、⑥、⑦、⑧，進(jìn)入分析柱6 ；高壓二元泵3輸送預(yù)處理流動(dòng)相經(jīng)過進(jìn)樣器4，通過十 通切換閥1的接口⑩、⑨，流入預(yù)處理柱5，即當(dāng)樣品通過進(jìn)樣器4進(jìn)樣時(shí)，預(yù)處理流動(dòng)相將 樣品帶入預(yù)處理柱5，樣品在預(yù)處理柱5上被凈化和富集，廢液通過十通切換閥1接口④、③ 排出；經(jīng)過預(yù)處理時(shí)間后，十通切換閥1切換為進(jìn)樣狀態(tài)II。b.進(jìn)樣狀態(tài)11(參見圖2)分析流動(dòng)相通過十通切換閥1的接口⑤、④進(jìn)入預(yù)處 理柱5并把樣品通過十通切換閥1的接口⑨、⑧，沖入分析柱6，并最終進(jìn)入到檢測器7中進(jìn) 行檢測。其中，在進(jìn)樣狀態(tài)II情況下，高壓二元泵3繼續(xù)持續(xù)不斷的輸送預(yù)處理流動(dòng)相，此 時(shí)十通切換閥1通過接口⑩、①、②、③直接將預(yù)處理流動(dòng)相排出；經(jīng)過切換時(shí)間后，十通切 換閥1切換成初始狀態(tài)I，平衡準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣。2)液相色譜條件a.預(yù)處理柱型號(hào)Oasis HLB 25 μ m 2. 1 X 20mm (Waters 公司)預(yù)處理柱柱溫室溫預(yù)處理流動(dòng)相水流速1· OmL · mirT1預(yù)處理時(shí)間36s切換時(shí)間36s-3.OOminb.分析柱型號(hào)Xterra MS C18 3. 5ym 2. ImmX 150mm(Waters 公司)分析柱柱溫35°C分析流動(dòng)相包括A和B，其中A為2mM甲酸胺和0. 05% (ν/ν)甲酸的水溶液(0. 126 克甲酸胺和500yL甲酸，加水至lOOOmL)，B為2mM甲酸胺和0.05% (ν/ν)甲酸的乙腈 (0. 126克甲酸胺和500 μ L甲酸溶于40mL水中，加乙腈960mL)。流速0. 2mL · mirT1梯度流動(dòng)相梯度洗脫條件見表1。表1流動(dòng)相梯度洗脫條件 c.進(jìn)樣量100 μ L3)質(zhì)譜條件檢測方式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)
掃描方式正離子掃描電噴霧電壓3200V霧化氣流速N2600L/hr錐孔反吹氣流速N250L/hr離子源溫度105°C碰撞氣氬氣內(nèi)標(biāo)嗎啡-d34) MRM 參數(shù)各化合物及內(nèi)標(biāo)設(shè)兩個(gè)母離子_子離子對。5)結(jié)果分析根據(jù)色譜圖和回歸方程，計(jì)算各化合物的濃度。經(jīng)檢測，本發(fā)明方法對尿樣中的嗎 啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虻臋z測限為0. 3 Ing 相關(guān)系數(shù)γ在0. 9991 以上，線性關(guān)系良好。其中，要實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的柱切換LC-MS/MS分析方法，首先需要確定以下條件1)切換時(shí)間的確定采用柱切換方法，切換時(shí)間的確定至關(guān)重要，本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)確定預(yù)處理流動(dòng)相 沖洗時(shí)間。初始狀態(tài)I時(shí)，預(yù)處理柱和分析柱是并聯(lián)狀態(tài)，進(jìn)樣后各化合物富集、保留在預(yù) 處理柱上，36s后切換到進(jìn)樣狀態(tài)II，即可除去尿液中的水溶性雜質(zhì)和鹽類，同時(shí)使峰面積 達(dá)到最大化，此時(shí)，時(shí)間增加或者減少時(shí)，峰面積均減?。贿M(jìn)樣狀態(tài)II時(shí)，預(yù)處理柱和分析 柱串聯(lián)在一起，分析流動(dòng)相將保留在預(yù)處理柱上的化合物洗脫進(jìn)入分析柱，3. OOmin后回到 初始狀態(tài)I，化合物繼續(xù)在分析柱上完成分離，但當(dāng)時(shí)間增加時(shí)，峰面積不再增加，僅保留時(shí) 間延長，因此確定切換時(shí)間為36s-3. OOmin02)液相色譜分析條件的確定以乙腈和水作為分析流動(dòng)相主體，同時(shí)根據(jù)樣品離子化的需要，在乙腈和水中需 要加入甲酸和甲酸銨，其中甲酸主要起到改善峰形的作用，甲酸銨可以提高儀器信號(hào)的響 應(yīng)值。為了克服梯度洗脫對色譜峰面積的穩(wěn)定性的影響，本發(fā)明在分析流動(dòng)相A和分析流 動(dòng)相B中加入相同濃度的甲酸和甲酸銨，保證了梯度變化過程中甲酸和甲酸銨的濃度一 致，改善了色譜峰面積的穩(wěn)定性。另外，嗎啡類生物堿水溶性較大，在色譜柱上不易保留，而 且由于母體結(jié)構(gòu)相似，碎片離子也相同，本發(fā)明為了確保所述柱切換LC-MS/MS分析方法定 性定量的準(zhǔn)確性，避免相互干擾，保證分析的化合物在保留時(shí)間上分開，于是本發(fā)明采用初 始為90% (ν/ν)的A相的梯度洗脫，最終各化合物得到了很好的分離。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的柱切換LC-MS/MS分析方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)1)前處理簡單，自動(dòng)化操作，樣品只需簡單處理或不經(jīng)處理即可進(jìn)樣分析，同時(shí)本 發(fā)明方法也適用于對不穩(wěn)定藥物的檢測分析。2)樣品在預(yù)處理柱上被凈化和富集，提高了分析靈敏度。特別是當(dāng)無法用液_液 萃取檢測水溶性較大的組分時(shí)，可采用本發(fā)明方法檢測，并可取得很好的效果。3)樣品處理的全過程由儀器程序控制，即使進(jìn)樣體積較大，也可獲得很高的精密 度與重現(xiàn)性。


圖1為本發(fā)明分析方法的初始狀態(tài)I的示意圖，其中，1為十通切換閥、2為 四元梯度泵、3為高壓二元泵、4為進(jìn)樣器、5為預(yù)處理柱、6為分析柱、7為檢測器，十通 切換閥1與高壓二元泵3通過進(jìn)樣器4相連的接口為⑩，按逆時(shí)針其余的接口依次為 ①②③④⑤⑥⑦⑧⑨，其中，每相鄰的兩個(gè)接口相通，具體為接口①與接口②，接口③與接 口④，接口⑤與接口⑥，接口⑦與接口⑧，接口⑨與接口⑩相通，共形成五組通路。
圖2為本發(fā)明分析方法的進(jìn)樣狀態(tài)II的示意圖，各數(shù)字標(biāo)號(hào)同圖1，此狀態(tài)下的五 組通路分別為接口①與接口⑩，接口②與接口③，接口④與接口⑤，接口⑥與接口⑦，接口 ⑧與接口⑨相通。圖3為本發(fā)明分析方法的總離子流色譜圖。圖4為實(shí)際案件中尿樣中嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虻纳V圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。儀器和試劑Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿液-質(zhì)聯(lián)用儀，Waters Alliance 2695四元梯度 泵及Waters 1525高壓二元泵、配MassLynxV4. 1軟件購于美國Waters公司)，十通切換閥 (Rheodyne, USA)。對照品嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因及內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3來源于中國藥 品生物制品檢定所、Cerilliant公司。乙腈、甲醇、甲酸、甲酸胺均為色譜純，購于Merck公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析 純，水為自制超純水。儲(chǔ)備液嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱?yàn)楣腆w對照品，配成 1. Omg · mL—1的甲醇溶液，再按照濃度配成混合稀釋液。內(nèi)標(biāo)嗎啡_d3為1. Omg · mL—1的甲 醇溶液，稀釋成濃度為0. Img · mL—1的甲醇溶液。實(shí)施例1配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥系統(tǒng)將十通切換閥1的接口⑤與四元梯度泵2 (Waters Alliance 2695)連接；十通切 換閥1的接口⑩與高壓二元泵3 (Waters 1525)通過進(jìn)樣器4連接；十通切換閥1的接口 ④、⑨與預(yù)處理柱5(Oasis HLB)的兩端分別相連，分析柱6(Xterra MS C18)的一端與 十通切換閥1的接口⑧相連，另一端與檢測器7 (Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜)連接。實(shí)施例2嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虻臋z測1.液相色譜條件a.預(yù)處理柱型號(hào)0asis HLB 25 μ m 2. 1 X 20mm (Waters 公司)預(yù)處理柱柱溫室溫預(yù)處理流動(dòng)相水流速1· OmL · mirT1
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預(yù)處理時(shí)間36s切換時(shí)間36s-3.OOminb.分析柱型號(hào)Xterra MS C18 3. 5ym 2. ImmX 150mm(Waters 公司)分析柱柱溫35°C分析流動(dòng)相包括A和B，其中A為2mM甲酸胺和0. 05% (ν/ν)甲酸的水溶液(0. 126 克甲酸胺和500yL甲酸，加水至lOOOmL)，B為2mM甲酸胺和0.05% (ν/ν)甲酸的乙腈 (0. 126克甲酸胺和500 μ L甲酸溶于40mL水中，加乙腈960mL)。流速0· 2mL · mirT1梯度流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。c.進(jìn)樣量100 μ L2.質(zhì)譜條件檢測方式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描方式正離子掃描電噴霧電壓3200V霧化氣流速N2600L/hr錐孔反吹氣流速N250L/hr離子源溫度105°C碰撞氣氬氣內(nèi)標(biāo)嗎啡-d33. MRM 參數(shù)各化合物及內(nèi)標(biāo)設(shè)兩對母離子-子離子對，各MRM參數(shù)詳見表2。表2各化合物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜MRM參數(shù) 4.結(jié)果分析1)色譜圖各化合物的總離子流色譜圖參見圖3，其中，嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰 可待因及內(nèi)標(biāo)在選定的液相色譜分析條件下，保留時(shí)間分別為6. 01min、7. 69min、9. 58min、 10. 80min和6. Olmin,色譜行為良好。2)最低檢測限以峰強(qiáng)度較低的子離子峰強(qiáng)度信噪比(S/N) = 5時(shí)確定為最低檢測限，各化合物的檢測限參見表3。表3各化合物的檢測限和線性關(guān)系 3)線性關(guān)系和精密度分別取不同量的對照品混合液(含嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱?于 具塞尖底試管中，吹干后加入空白尿樣配成系列濃度的樣品。以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比 (Y)對樣品中化合物的濃度(X)作圖，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3，由表3可以看 出各化合物線性關(guān)系良好。高、中、低濃度日內(nèi)重復(fù)測定6次得日內(nèi)精密度，連續(xù)測定4天得日間精密度，結(jié)果 見表4。表4各化合物的日內(nèi)及日間精密度 經(jīng)分析，本發(fā)明方法對尿樣中的嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虻臋z測 限為0.3 Ing ^mr1,相關(guān)系數(shù)、在0. 9991以上，線性關(guān)系良好，可廣泛應(yīng)用于多起實(shí)際 案件的吸毒尿樣分析。圖4為實(shí)際案例中一吸毒案件的尿樣檢測色譜圖，檢出嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待 因、乙酰可待因成分，其含量分別為 87. 3ng ·πιΓ\10. 3ng ·πιΓ\ 6. 7ng ·πιΓ\4. Ing ^mLA最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的 技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在 本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
一種檢測尿中嗎啡類生物堿的柱切換LC MS/MS分析方法，其特征在于，包括如下步驟1)配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥系統(tǒng)所述系統(tǒng)包括十通切換閥(1)、四元梯度泵(2)、高壓二元泵(3)、進(jìn)樣器(4)、預(yù)處理柱(5)、分析柱(6)和檢測器(7)；其中，所述十通切換閥(1)的接口⑤與所述四元梯度泵(2)連接；所述十通切換閥(1)的接口⑩與所述高壓二元泵(3)通過所述進(jìn)樣器(4)連接；所述十通切換閥(1)的接口④、⑨與所述預(yù)處理柱(5)的兩端分別相連；所述分析柱(6)的一端與所述十通切換閥(1)的接口⑧相連，另一端與所述檢測器(7)連接；2)按設(shè)定的LC MS/MS條件分析樣品；3)結(jié)果分析根據(jù)色譜圖和回歸方程，計(jì)算各化合物的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述四元梯度泵(2)為Waters Alliance 2695泵，所述高壓二元泵(3)為Waters 1525泵，所述檢測器(7)為Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述LC-MS色譜條件如下i)預(yù)處理柱柱溫室溫 預(yù)處理流動(dòng)相水 流速1. OmL · mirT1 預(yù)處理時(shí)間36s切換時(shí)間36s-3minii)分析柱柱溫35°C分析流動(dòng)相包括A和B，其中A為2mM甲酸胺和0. 05%甲酸的水溶液，B為2mM甲酸胺 和0. 05%甲酸的乙腈 流速0. 2mL · mirT1iii)進(jìn)樣量100μL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述MS條件如下 檢測方式多反應(yīng)監(jiān)測MRM掃描方式正離子掃描 電噴霧電壓3200V 霧化氣流速N2600L/hr 錐孔反吹氣流速N250L/hr 離子源溫度105°C 碰撞氣氬氣 內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述LC-MS色譜采用流動(dòng)相梯度洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的分析方法，其特征在于，所述嗎啡類生物堿選白 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱?。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測尿中嗎啡類生物堿的柱切換LC-MS/MS分析方法，包括如下步驟1)配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥系統(tǒng)；2)按設(shè)定的LC-MS/MS條件分析樣品；3)結(jié)果分析。本發(fā)明方法對尿樣中的嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虻臋z測限為0.3～1ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)γ在0.9991以上，線性關(guān)系良好。同時(shí)，尿樣可以直接進(jìn)樣分析，無需前處理，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了成本。本發(fā)明方法快速、靈敏、簡單、可靠，可廣泛應(yīng)用于實(shí)際案例分析中。
文檔編號(hào)G01N30/60GK101923081SQ20101027850
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月10日
發(fā)明者丁敏菊, 葉海英, 張潤生, 張玉榮, 梁晨, 汪蓉 申請人:上海市公安局刑事偵查總隊(duì)