專利名稱：一種乙型肝炎病毒表面抗原的磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及到臨床判定乙型肝炎病毒感染的一項(xiàng)診 斷指標(biāo)乙型肝炎病毒表面抗原，提供了一種乙型肝炎病毒表面抗原的磁分離化學(xué)發(fā)光免疫 檢測方法，適用于人血清、血漿乙型肝炎病毒表面抗原的定量檢測。
背景技術(shù)：
乙型肝炎又稱為血清性肝炎、乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)，是由乙型肝炎病毒 (Hepatitis B Virus，HBV)引起的傳染病。通過血液與體液傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)。乙 肝臨床表現(xiàn)多樣化，易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化，一些病人可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝癌。乙型肝炎病毒表面抗原(HBs-Ag)是乙肝病毒的血清學(xué)標(biāo)志物之一，該蛋白由S基 因編碼，有“a”、“b”、“y”、“r”、“w”等多種抗原決定簇，其中“a”是共同的抗原決定簇，“d”、 “y”和“r”、“w”為主要的亞型決定簇。HBs-Ag主要有adr，adw, ayr，及ayw等4種亞型。 HBs-Ag是急性感染時(shí)最早出現(xiàn)的血清學(xué)標(biāo)志。該抗原常常在癥狀出現(xiàn)前1-6周就可檢測 到，免疫力正常的機(jī)體會產(chǎn)生表面抗體，該抗體可以中和病毒，是一種保護(hù)性抗體。HBs-Ag 檢測陽性是病毒活躍的標(biāo)志，通常意味著患者具有傳染性；陰性的情況要么是病人從未感 染，要么是感染后已經(jīng)康復(fù)或者隱匿性感染。癥狀出現(xiàn)后4個(gè)月，免疫力正常個(gè)體可以清除 HBs-Ag，機(jī)體開始康復(fù)，在康復(fù)期HBs-Ag表現(xiàn)為陰性，但是，有些人尤其是嬰幼兒或免疫力 差的個(gè)體(如艾滋病患者)，會形成慢性乙肝病毒感染，HBs-Ag會持續(xù)陽性。乙型肝炎的流行性監(jiān)測通常以檢測HBs-Ag作為標(biāo)準(zhǔn)，急性感染時(shí)，HBs-Ag可在感 染后4周左右檢測到，還常常伴有一定的臨床癥狀；而慢性感染則通常以HBs-Ag陽性6個(gè) 月以上為診斷標(biāo)準(zhǔn)。作為一種血清學(xué)標(biāo)志物，HBs-Ag不僅用在診斷上，也用于篩查捐獻(xiàn)的 血液。臨床上對乙型肝炎病毒表面抗原的檢測主要是采用免疫學(xué)方法。臨床免疫檢測技 術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)原理檢測生物體內(nèi)物質(zhì)的技術(shù)，該技術(shù)的引入使臨床化學(xué)檢驗(yàn)發(fā)生 了革命性的變化檢測項(xiàng)目不斷增加，方法的靈敏度更高、特異性更強(qiáng)，自動化程度更高。自 上世紀(jì)80年代以后，免疫學(xué)檢測技術(shù)隨著單克隆抗體、人工合成多肽、基因工程表達(dá)抗原 及各種標(biāo)記技術(shù)的成熟而迅速發(fā)展，放射免疫測定(RIA)和酶免疫測定(EIA)逐漸取代傳 統(tǒng)的免疫沉淀和免疫凝聚，使檢測的敏感性、特異性都大大提高，隨后化學(xué)發(fā)光技術(shù)的應(yīng)用 使免疫學(xué)檢測的敏感性和線性范圍得到進(jìn)一步的提高。這些技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用為疾 病的定量檢測、療效觀察及病因探討提供了更直接和客觀的資料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有靈敏度高、特異性好、適用性廣的檢測乙型肝炎 病毒表面抗原的磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法。本發(fā)明生成的乙型肝炎病毒表面抗原磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫的試劑盒組成包括①定標(biāo)液(含一定濃度的乙型肝炎病毒表面抗原，用于確定CutOff值)；②乙型肝炎病 毒表面抗原陰、陽對照品(陽性對照含一定濃度的乙型肝炎病毒表面抗原，用于檢驗(yàn)的結(jié) 果的質(zhì)量控制)；③乙型肝炎病毒表面抗原抗試劑1號、2號(偶聯(lián)有生物酶的乙型肝炎病 毒表面抗原的抗體和偶聯(lián)有FITC的乙型肝炎病毒表面抗原的抗體)；④磁分離試劑(結(jié)合 抗FITC的磁微?；鞈乙?；⑤清洗液濃縮液(用于配制清洗液)；⑥底物溶液(生物酶催化 的發(fā)光底物)。所述的乙型肝炎病毒表面抗原磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法的檢測步驟如 下(1)加樣與免疫反應(yīng)在試管中加入5_100yL處理好的樣本、定標(biāo)液和對照品，然 后分別加入10-500 μ L乙型肝炎病毒表面抗原抗試劑1號和2號，混勻，37°C溫育5_60分 鐘；(2)免疫復(fù)合物與磁微粒結(jié)合向試管中加入20-100 μ L磁分離試劑，混勻，37°C 溫育0-30分鐘(也可不溫育)；(3)磁分離與洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清；加入100-600μ L清洗液， 去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清；可再加入 洗液清洗多次(也可省去)；(4)加底物溶液并讀出樣本濃度每管加入50-300 μ L生物酶催化的發(fā)光底物，酶 促底物發(fā)光，根據(jù)樣本的發(fā)光值和Cut Off值讀出樣本中乙肝表面抗原的S/C0值，判定樣 本陰陽性。所述的乙型肝炎病毒表面抗原磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法的工作原理是: 首先，待檢樣本與酶標(biāo)記抗體、FITC標(biāo)記抗體特異性結(jié)合形成“三明治”結(jié)構(gòu)的夾心復(fù)合物， 夾心復(fù)合物再與磁微粒特異性結(jié)合(通過抗體上偶聯(lián)的FITC與磁微粒上的抗FITC結(jié)合)； 經(jīng)過洗滌，結(jié)合物通過外加磁場被留下，未結(jié)合的抗原、抗體和其他物質(zhì)被去除；加入底物， 用化學(xué)發(fā)光分析儀檢測其發(fā)光值。在一定濃度范圍內(nèi)，待測樣本中的乙型肝炎病毒表面抗 原濃度與發(fā)光值成正比，最后根據(jù)樣本的發(fā)光值和Cut Off值讀出樣本中乙肝表面抗原的 S/C0值，判定樣本陰陽性。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下(1)磁分離試劑的制備將FITC抗體連接在磁微粒表面。所述的磁微粒直徑在 0.01-5.0μπι之間，具有超順磁性，表面含有氨基(ΝΗ2-)或羧基(C00H-)活性基團(tuán)。所述的 FITC抗體與磁微?？梢酝ㄟ^化學(xué)交聯(lián)劑，如戊二醛、l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbo diimide hydrochloride (EDC)等以共價(jià)鍵的形式，也可以通過物理吸附(靜電作用、 離子鍵或疏水作用等)的形式進(jìn)行偶聯(lián)。(2)乙型肝炎病毒表面抗原抗試劑中酶標(biāo)抗體的制備將生物酶與乙型肝炎病毒 表面抗原的抗體偶聯(lián)，所述的生物酶可以是辣根過氧化物酶(HRP)，也可以是堿性磷酸酶 (ALP)。偶聯(lián)方法可以是過碘酸鈉氧化法、戊二醛法或SuCCinimidyl4-(N-maleimid0methy 1) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、2-Iminothiolane · HCl (2IT)交聯(lián)等多種方法。(3)底物溶液所述的底物溶液可以是HRP催化的發(fā)光底物魯米諾(Luminol)，也 可以是ALP催化的發(fā)光底物AMPPD，CSPD和CSPD-Star等。(4)定標(biāo)液和對照品選取經(jīng)滅活的人血清，將其混合后用稀釋液按一定比例稀
4釋而成。


圖1為本發(fā)明試劑盒與國外知名公司進(jìn)口 HBsAg化學(xué)發(fā)光試劑臨床樣本測試的一 致性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 抗FITC抗原與表面氨基(C00H-)磁微粒偶聯(lián)，制備磁分離試劑取IOOmg表面含羧基(C00H-)活性基團(tuán)的磁微粒用0. IM MES(2-[N-morpholino] ethane sulfonic acid)，pH 4. 5-5溶液IOml洗滌3次。磁微粒用該溶液Iml重懸，加入 2mg抗FITC抗體，混合均勻。加入100 μ 1 10mg/ml EDC溶液，混合均勻后室溫反應(yīng)2小時(shí)。 用IOml含牛血清白蛋白(BSA)的0.0IM磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7. 4洗滌磁珠3次后，用 該溶液配制成2. 5mg/ml的磁分離試劑工作液。實(shí)施例2 堿性磷酸酶(ALP)與乙型肝炎病毒表面抗原的抗體的偶聯(lián)取5mg乙型肝炎病毒表面抗原的抗體，濃縮至5mg/ml，加入13. 76mg/mL的活化劑 2-Iminothiolane -HCl (2IT)溶液10 μ 1，室溫放置15分鐘后加甘氨酸終止活化反應(yīng)，室溫 下放置5分鐘。使用PGlO柱子除鹽，收集洗脫蛋白。取 7. 5mg ALP 溶液，力口入 6. 69mg/mL 的 Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)溶液50 μ 1，室溫放置30分鐘，加入甘氨酸終止活化反 應(yīng)，室溫放置5分鐘。使用PGlO柱子除鹽，收集洗脫蛋白。將收集的胱抑素C抗體與收集的ALP混合，4 °C反應(yīng)20個(gè)小時(shí)，然后使用 Supperdex200凝膠層析柱分離純化，收集第二峰和第三峰即偶聯(lián)物，并將其保存于4°C。實(shí)施例3 檢測血清中乙型肝炎病毒表面抗原用本試劑盒對680例臨床血清血清進(jìn)行檢測，確定了 CutOff值的計(jì)算方法。材料與儀器(1)乙型肝炎病毒表面抗原試劑盒；(2)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀MAGLIA60 北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；(3)磁分離器北京倍愛康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；(4)水浴箱(用于37 °C溫浴)。檢測步驟如下(1)加樣與免疫反應(yīng)在試管中加入100μ L處理好的樣本、定標(biāo)液和對照品，然后 分別加入30 μ L乙型肝炎病毒表面抗原抗試劑1號和2號，混勻，37°C溫育30分鐘；(2)免疫復(fù)合物與磁微粒結(jié)合向試管中加入60μ L磁分離試劑，混勻，37°C溫育6 分鐘；(3)磁分離與洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清；加入300 μ L清洗液，去除 磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清。再重復(fù)兩次加 入300 μ L清洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后再次使磁微粒在磁場中沉降，去 除上清；(4)加底物溶液并讀出濃度每管加入200 μ L底物溶液，酶促底物發(fā)光，根據(jù)樣本的發(fā)光值和Cut Off值讀出樣本中乙肝表面抗原的S/C0值，判定樣本陰陽性。檢測結(jié)果當(dāng)CutOff值為定標(biāo)液發(fā)光平均值除以6時(shí)，樣本的陰陽性區(qū)分較好，符合率大于 97%。實(shí)施例4 本試劑盒的性能評價(jià)根據(jù)體外診斷試劑的特點(diǎn)，按慣例檢測本試劑盒的靈敏度、陰、陽性符合率、精密 度和穩(wěn)定性。材料與儀器、檢測步驟同實(shí)施例3。檢測結(jié)果(1)靈敏度對國家參考品的三種亞型的靈敏度參考品進(jìn)行檢測，結(jié)果如下表
Ay2. 0+Ayl.O+AyO. 5-Adw2. 0+Adwl. 0+AdwO. 5+Adrl. 0+AdrO. 5+AdrO. 2-(2)陰、陽性符合率對國家參考品的3支陽性參考品和20支陰性參考品進(jìn)行檢 測，結(jié)果全部符合；(3)精密度對三種濃度的內(nèi)控物質(zhì)進(jìn)行精密度檢測，每種物質(zhì)平行測定10次，計(jì) 算測得的S/C0值的變異系數(shù)，結(jié)果表明變異系數(shù)在1. 2% 7. 5%之間。(4)穩(wěn)定性將試劑盒放置37°C 8天后，測試內(nèi)控品低、中、高，結(jié)果仍然在質(zhì)控范 圍內(nèi)；將試劑盒2 8°C放置12個(gè)月后，能通過國家參考品標(biāo)準(zhǔn)，表明試劑盒穩(wěn)定性良好， 符合臨床應(yīng)用需要。
權(quán)利要求
一種乙型肝炎病毒表面抗原磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測方法，其特征在于結(jié)合了酶標(biāo)記技術(shù)、磁微粒分離技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)，并生成了檢測試劑盒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶標(biāo)記技術(shù)，其特征在于生物酶標(biāo)記乙肝表抗原的抗體的方 法如下所述的生物酶可以是辣根過氧化物酶(HRP)，也可以是堿性磷酸酶(ALP)。偶 聯(lián)方法可以是過碘酸鈉氧化法、戊二醛法或Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、2-Iminothiolane · HCl (2IT)交聯(lián)等多種方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁分離技術(shù)，其特征在于磁分離試劑的制備方法如下將FITC抗體連接在磁微粒表面。所述的磁微粒直徑在0. 01-5. 0 μ m之間，具有超 順磁性，表面含有氨基(NH2-)或羧基(C00H-)活性基團(tuán)。所述的FITC抗體與磁微粒 可以通過化學(xué)交聯(lián)劑，如戊 二酸、l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)等以共價(jià)鍵的形式，也可以通過物理吸附(靜電作用、離子鍵或疏水 作用等)的形式進(jìn)行偶聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光發(fā)光檢測技術(shù)，其特征在于化學(xué)發(fā)光所用的底物 溶液可以是HRP催化的發(fā)光底物魯米諾(Luminol)，也可以是ALP催化的發(fā)光底物AMPPD， CSPD 和 CSPD-Star 等。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒中的對照品和定標(biāo)液是選取經(jīng)滅 活的人血清，將其混合后用稀釋液按一定比例稀釋而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒中乙肝表面抗原抗試劑包含偶聯(lián) 有生物酶的乙肝表面抗原的抗體和偶聯(lián)有FITC的乙肝表面抗原的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于偶聯(lián)FITC的抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于檢測步驟如下(1)加樣與免疫反應(yīng)在試管中加入5-100yL處理好的樣本、定標(biāo)液和對照品，然后加 入10-500 μ L乙肝表面抗原抗試劑，混勻，37°C溫育5-60分鐘；(2)免疫復(fù)合物與磁微粒結(jié)合向試管中加入20-100μ L，0. l-10mg/mL磁分離試劑，混 勻，37°C溫育0-30分鐘(也可不溫育)；(3)磁分離與洗滌使磁微粒在磁場中沉降，去除上清；加入100-600μ L清洗液，去除 磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后再次使磁微粒在磁場中沉降，去除上清；可再次加入洗 液清洗兩次(也可省去)；(4)加底物溶液并讀出樣本濃度每管加入50-300μ L生物酶催化的發(fā)光底物，酶促底 物發(fā)光，根據(jù)樣本的發(fā)光值和Cut Off值讀出樣本中乙肝表面抗原的S/C0值，判定樣本陰 陽性。
全文摘要
本發(fā)明提供了乙型肝炎病毒表面抗原的體外檢測方法，該方法采用了磁微粒分離化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，它是酶標(biāo)記技術(shù)、磁微粒分離技術(shù)和化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，兼具靈敏度高、特異性好、重復(fù)性好等特點(diǎn)。可用于人血清、血漿中乙肝表面抗原含量的測定，臨床上該指標(biāo)多用于判斷是否感染過乙肝病毒，主要用于監(jiān)測乙型肝炎的病情及治療效果和預(yù)后。
文檔編號G01N33/576GK101975859SQ201010279319
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者仝文斌, 朱世偉, 王佳昳, 郭健夫 申請人:北京倍愛康生物技術(shù)有限公司