專利名稱：一種r-藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種R-藻藍(lán)蛋白(R-phycocyanin，RPC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方 法，屬于免疫熒光檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫熒光檢測法是一種歷史悠久的標(biāo)記分析法，兼具有抗原、抗體反應(yīng)的特異性 及熒光檢測的靈敏性，廣泛應(yīng)用于疾病檢測和生物學(xué)研究中。免疫熒光檢測法的特異性和 敏感性依賴于熒光染料、抗體及熒光探針的屬性和質(zhì)量。在實(shí)際應(yīng)用時，由于血清和其他生 物樣品發(fā)射波長為400 600nm的本底熒光，與常用的FITC等傳統(tǒng)熒光染料的熒光發(fā)射光 譜重疊，嚴(yán)重降低熒光檢測的靈敏度，造成一段時期內(nèi)免疫熒光檢測法發(fā)展緩慢。多管藻是生長在我國沿海地區(qū)潮間帶的特有海洋紅藻，含有大量的R-藻藍(lán)蛋 白，是提取R-藻藍(lán)蛋白的比較理想的試材。R-藻藍(lán)蛋白的穩(wěn)定態(tài)為(α β)3，分子量約為 104. 9kDa,是唯一同時含有PEB和PCB的藻膽蛋白。多管藻RPC有2個吸收峰，最大吸收峰 分別位于540、620nm。540nm激發(fā)光激發(fā)時室溫最大熒光發(fā)射峰位于632nm。與傳統(tǒng)的熒光 染料相比，RPC具有水溶性、無毒性、摩爾消光系數(shù)大、熒光量子產(chǎn)率高、斯托克位移大、發(fā)射 紅色熒光、背景光干擾小、不易淬滅等特點(diǎn)，因而是一類優(yōu)秀的熒光染料。RPC用于免疫熒光檢測需要將其與抗體或抗抗體交聯(lián)制備熒光探針，RPC與抗體 交聯(lián)得率低，造成RPC熒光標(biāo)記物生產(chǎn)成本居高不下，成為限制其應(yīng)用的瓶頸因素。本發(fā)明 選擇溫和型的異型雙功能化學(xué)交聯(lián)劑SPDP將RPC與抗抗體液相化學(xué)交聯(lián)制備通用型熒光 抗抗體，通過優(yōu)化交聯(lián)劑濃度既保證了交聯(lián)效率又不影響熒光亮度和抗體活性，成功制備 出RPC標(biāo)記的熒光二抗，可方便地用于傳染病病原的間接免疫熒光檢測，省去了直接免疫 熒光檢測時需要針對每種病原的抗體制備熒光標(biāo)記抗體的麻煩，同時采用標(biāo)記的抗抗體作 為信號放大系統(tǒng)，還能提高免疫熒光檢測的靈敏度。目前國內(nèi)外尚沒有RPC應(yīng)用到動物疫 病檢測中的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種R-藻藍(lán)蛋白(RPC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法。本發(fā)明采用的R-藻藍(lán)蛋白(RPC)是純化自多管藻的典型的二峰型藻藍(lán)蛋白，是唯 一同時含有PEB和PCB的藻膽蛋白，具有無毒性、水溶性大、熒光明亮且不易淬滅等特點(diǎn)。 RPC的組成和晶體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了低穩(wěn)定性，因此在蛋白質(zhì)交聯(lián)是控制交聯(lián)劑的濃度是關(guān) 鍵，濃度過高會造成RPC的變性和熒光喪失，濃度過低則交聯(lián)效率降低。本發(fā)明的解決方案如下RPC的制備RPC的制備由多管藻中采用陰離子交換層析法分離純化，純化過程 為取冷凍保存的多管藻，加入20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)，4°C下溶脹24h，多層紗布過濾、 擠壓獲得褐色浸提液，然后加入固體硫酸銨至濃度為60% (w/v)，4°C放置24h，離心收集 沉淀，將沉淀溶于20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)中，然后對20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)透析，透析液加到用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)(含50mM NaCl)預(yù)平衡過的陰離子交換柱，用 20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)沖洗掉陰離子交換柱上過量的R-藻藍(lán)蛋白，用20mM醋酸緩沖液 (pH4. 8)(含50mMNaCl) —步洗脫就可得到大量純的R-藻藍(lán)蛋白，純化的多管藻RPC純度達(dá) 電泳純，純度指數(shù)A62tZA28tl >4. 5，結(jié)構(gòu)式為(α β)3，分子量約為llOkDa，最大吸收峰分別 位于540、620nm，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于640nm，純化的RPC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前 用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為10mg/mL。RPC標(biāo)記熒光抗抗體的制備抗抗體為抗雞IgG抗體、抗豬IgG抗體，購自Sigma公 司，標(biāo)記時用PBS透析，調(diào)整蛋白濃度為5mg/ml。RPC與抗抗體的交聯(lián)采用蛋白質(zhì)交聯(lián)法。 利用異型雙功能交聯(lián)劑SPDP分別在RPC、抗抗體上衍生吡啶二硫基團(tuán)，然后用DTT還原抗 抗體的衍生物引入游離-SH，將攜帶吡啶二硫基的RPC與攜帶巰基的抗抗體按一定摩爾比 交聯(lián)制備熒光抗抗體。以DMSO準(zhǔn)確配制SPDP母液，SPDP與RPC、抗抗體的摩爾比分別為 20-30 1,50-100 1，混勻、鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的SPDP。 取DTT按50-100 1的摩爾比與抗抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)lh，超濾離心除去 多余的DTT，抗抗體-HS與RPC衍生物以摩爾比1 2-3混勻，鋁箔封好后于20-25°C振蕩 反應(yīng)20h。加NEM封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。RPC標(biāo)記抗熒光抗抗體的純化和交聯(lián)效率分析液相色譜工作站上采用HPLC法 進(jìn)行熒光抗抗體的交聯(lián)效率分析和純化，流動相為50mM PBS pH 7. 5，流速0. 5mL/min, 檢測波長190-800nm。采用分子篩高壓液相色譜柱純化，液相柱型號TSK G3000sw(規(guī)格 7. 5mmX60cm)，熒光標(biāo)記抗抗體最先被洗脫下來(附圖1)。目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫峰面積占所有 洗脫峰面積的比例即為交聯(lián)效率。收集各洗脫峰，進(jìn)行光譜學(xué)、抗體活性、電泳檢測。 RPC標(biāo)記熒光抗抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外-可見光分光光度計上測定，掃 描波長區(qū)間250-700nm。室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜在熒光分光光度計上測定，用540nm的激發(fā)光 激發(fā)，熒光發(fā)射波長掃描范圍為550-700nm，檢測步長為0. 2nm，狹縫寬度為3nm，檢測靈敏 度為中等，掃描速度為lOOOnm/min，每個樣品掃描3次取平均值，用不含蛋白的相同溶液作 背景扣除。在紫外區(qū)，RPC標(biāo)記熒光抗抗體的吸光度明顯高于對照RPC，吸收峰位置相同，這 是因?yàn)镽PC表面交聯(lián)了抗抗體分子，而抗抗體在280nm有較強(qiáng)的光吸收；在450-700nm范圍 內(nèi)，交聯(lián)物的吸收光譜與對照RPC的吸收峰及吸光度相似，是由于抗抗體在該范圍內(nèi)無光 吸收，因而不影響RPC的吸收光譜。通過吸收光譜檢測可判定交聯(lián)成功，同時交聯(lián)反應(yīng)沒有 導(dǎo)致RPC變性。RPC標(biāo)記熒光抗抗體與對照RPC在540nm激發(fā)光的激發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波 長均位于632nm，沒有發(fā)生斯托克位移的改變，仍具有RPC的特征熒光發(fā)射光譜，且熒光亮 度無明顯降低。熒光光譜檢測結(jié)果再次證實(shí)RPC與抗抗體交聯(lián)成功。RPC標(biāo)記熒光抗抗體的效價檢測對流免疫電泳法檢測RPC標(biāo)記熒光抗抗體的免 疫學(xué)活性。RPC標(biāo)記熒光抗抗體與動物IgG形成青色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地觀察 到沉淀線的位置。免疫沉淀線的形成說明抗抗體與RPC交聯(lián)成功，同時也說明交聯(lián)反應(yīng)對 抗抗體的免疫學(xué)活性影響不大，交聯(lián)物能夠進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，仍然保留較高的抗體活性。RPC標(biāo)記熒光抗抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續(xù)電泳裝置上進(jìn)行，分 離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%。恒壓電泳，電壓為218V。用0. 25% (w/v)考馬斯 亮藍(lán)R-250染色，脫色后觀察結(jié)果。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)RPC標(biāo)記熒光抗抗體既具有RPC的 α、β亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶(附圖2)，證實(shí)RPC與抗抗體交聯(lián)成功。
RPC標(biāo)記熒光抗抗體的穩(wěn)定性檢測純化的RPC標(biāo)記熒光抗抗體中加入0. 02%疊 氮化鈉，4°C避光保存，每隔30天測定一次熒光光譜和抗體效價。RPC標(biāo)記的熒光抗抗體穩(wěn) 定性較好，在0. 05mol/L的磷酸緩沖液中4°C保存60天，熒光抗抗體的熒光強(qiáng)度保持不變， 抗體效價維持在5Log 2。綜上所述，RPC標(biāo)記的通用熒光探針熒光明亮，穩(wěn)定性好，可用于動物傳染病的病 原或抗體的間接免疫熒光檢測，省去了直接免疫熒光檢測時需要針對每種病原的抗體制備 熒光標(biāo)記抗體的麻煩，采用標(biāo)記抗抗體還能起到信號放大作用。


附圖1為RPC標(biāo)記熒光抗抗體的HPLC洗脫圖。液相柱型號為TSK G3000sw，流動 相為50mM pH7. 5的PBS，流速0. 5mL/min, RPC標(biāo)記熒光抗抗體、抗抗體、RPC的洗脫時間為 分別為 19. 57min、27. 32,31. 26min。附圖2為RPC標(biāo)記熒光抗抗體的SDS-PAGE電泳。RPC標(biāo)記熒光抗抗體既具有RPE 的α、β亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶。附圖3為不同保存時間的RPC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的熒光亮度和抗體活性。 RPC標(biāo)記熒光抗抗體在0. 05mol/L的磷酸緩沖液中4°C保存60天，熒光強(qiáng)度保持不變，隨后 隨著保存時間推移熒光強(qiáng)度緩慢降低。熒光抗抗體4°C保存90天抗體效價維持在5Log 2， 隨后抗體效價隨保存時間推遲而緩慢降低。
具體實(shí)施例方式實(shí)施方式1 :RPC標(biāo)記的抗雞IgG熒光抗抗體的制備RPC的分離純化冷凍保存的多管藻加入6倍體積的20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)， 4°C下溶脹24h，多層紗布過濾、擠壓獲得褐色浸提液，然后加入固體硫酸銨至濃度為60% (w/v)，4°C放置24h，離心收集沉淀，將沉淀溶于20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)中，然后對 20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)透析，透析液加到用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)(含50mM NaCl) 預(yù)平衡過的陰離子交換柱，用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)沖洗掉陰離子交換柱上過量的樣 品及雜質(zhì)，用20mM醋酸緩沖液(pH4. 8)(含50mM NaCl) 一步洗脫就可得到大量純的RPC， 純化的多管藻RPC純度達(dá)電泳純，純度指數(shù)A62tZA28tl >4. 5，結(jié)構(gòu)式為(α β )3，分子量約為 IlOkDa,最大吸收峰分別位于540、620nm，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于632nm，純化的RPC硫酸銨沉 淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為10mg/mL。RPC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的高效制備抗雞IgG抗體購自Sigma公司，標(biāo)記時 用PBS透析，調(diào)整蛋白濃度為5mg/ml。以DMSO準(zhǔn)確配制SPDP母液，SPDP與RPC、抗抗體的 摩爾比分別為20 1、50 1，混勻、鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的 SPDP。取DTT按50 1的摩爾比與抗抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)lh，超濾離心除 去多余的DTT，抗抗體-HS與RPC衍生物以摩爾比1 2混勻，鋁箔封好后于20-25°C振蕩 反應(yīng)20h。加NEM封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。RPC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的交聯(lián)效率分析和高效純化液相色譜工作站 上采用HPLC法進(jìn)行熒光抗抗體的交聯(lián)效率分析和純化，流動相為50mM PBS pH 7. 5，流 速0. 5mL/min,檢測波長190-800nm。采用分子篩高壓液相色譜柱純化，液相柱型號TSKG3000SW(規(guī)格7. 5mmX60cm)，熒光標(biāo)記抗抗體最先被洗脫下來(附圖1)。收集第一個洗脫 峰，即為純化的熒光抗抗體。通過計算目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫峰面積與全部洗脫峰面積的比例即 交聯(lián)效率為88%。RPC標(biāo)記熒光抗抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外_可見光分光光度計上測定，掃 描波長區(qū)間250-700nm。室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜在熒光分光光度計上測定，用540nm的激發(fā)光 激發(fā)，熒光發(fā)射波長掃描范圍為550-700nm，檢測步長為0. 2nm，狹縫寬度為3nm，檢測靈敏 度為中等，掃描速度為lOOOnm/min，每個樣品掃描3次取平均值，用不含蛋白的相同溶液作 背景扣除。在紫外區(qū)，RPC標(biāo)記熒光抗抗體的吸光度明顯高于對照RPC，吸收峰位置相同，這 是因?yàn)镽PC表面交聯(lián)了抗抗體分子，而抗抗體在280nm有較強(qiáng)的光吸收；在450-700nm范圍 內(nèi)，交聯(lián)物的吸收光譜與對照RPC的吸收峰及吸光度相似，是由于抗抗體在該范圍內(nèi)無光 吸收，因而不影響RPC的吸收光譜。通過吸收光譜檢測可判定交聯(lián)成功，同時交聯(lián)反應(yīng)沒有 導(dǎo)致RPC變性。RPC標(biāo)記熒光抗抗體與對照RPC在540nm激發(fā)光的激發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波 長均位于632nm，沒有發(fā)生斯托克位移的改變，仍具有RPC的特征熒光發(fā)射光譜，且熒光亮 度無明顯降低。熒光光譜檢測結(jié)果再次證實(shí)RPC與抗抗體交聯(lián)成功。RPC標(biāo)記熒光抗抗體的效價檢測對流免疫電泳法檢測RPC標(biāo)記熒光抗抗體的免 疫學(xué)活性。RPC標(biāo)記熒光抗抗體與雞IgG形成青色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地觀察到 沉淀線的位置。免疫沉淀線的形成說明抗抗體與RPC交聯(lián)成功，同時也說明交聯(lián)反應(yīng)對抗 抗體的免疫學(xué)活性影響不大，交聯(lián)物能夠進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，仍然保留較高的抗體活性。RPC標(biāo)記熒光抗抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續(xù)電泳裝置上進(jìn)行，分 離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%。恒壓電泳，電壓為218V。用0. 25% (w/v)考馬斯 亮藍(lán)R-250染色，脫色后觀察結(jié)果。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)RPC標(biāo)記熒光抗抗體既具有RPC的 α、β亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶(附圖2)，證實(shí)RPC與抗抗體交聯(lián)成功。RPC標(biāo)記熒光抗抗體的穩(wěn)定性檢測純化的RPC標(biāo)記熒光抗抗體中加入0. 02 %疊 氮化鈉，4°C避光保存，每隔30天測定一次熒光光譜和抗體效價。RPC標(biāo)記的熒光抗抗體穩(wěn) 定性較好，在0. 05mol/L的磷酸緩沖液中4°C保存60天，熒光抗抗體的熒光強(qiáng)度保持不變， 抗體效價維持在5Log 2。實(shí)施方式2 =RPC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體制備RPC的分離純化RPC的制備由多管藻中采用陰離子交換層析法分離純化，取冷凍 保存的多管藻，加入6倍體積的20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)，4°C下溶脹24h，多層紗布過濾、 擠壓獲得褐色浸提液，然后加入固體硫酸銨至濃度為60% (w/v)，4°C放置24h，離心收集沉 淀，將沉淀溶于20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)中，然后對20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)透析，透 析液加到用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)(含50mM NaCl)預(yù)平衡過的陰離子交換柱，用20mM醋 酸緩沖液(PH5. 8)沖洗掉陰離子交換柱上過量的樣品及雜質(zhì)，用20mM醋酸緩沖液(pH4. 8) (含50mM NaCl) 一步洗脫就可得到大量純的RPC，純化的多管藻RPC純度達(dá)電泳純，純度指 數(shù)A62tZA28tl >4. 5，結(jié)構(gòu)式為(α β )3，分子量約為llOkDa，最大吸收峰分別位于540、620nm， 室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于640nm，純化的RPC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS 充分透析除鹽，調(diào)整濃度為10mg/mL。RPC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的高效制備抗豬IgG抗體購自Sigma公司，標(biāo)記時 用PBS透析，調(diào)整蛋白濃度為5mg/ml。以DMSO準(zhǔn)確配制SPDP母液，SPDP與RPC、抗抗體的摩爾比分別為30 UlOO 1，混勻、鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的 SPDP。取DTT按100 1的摩爾比與抗抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)lh，超濾離心除 去多余的DTT，抗抗體-HS與RPC衍生物以摩爾比1 3混勻，鋁箔封好后于20-25°C振蕩 反應(yīng)20h。加NEM封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。RPC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的交聯(lián)效率分析和高效純化液相色譜工作站 上采用HPLC法進(jìn)行熒光抗抗體的交聯(lián)效率分析和純化，流動相為50mM PBS pH 7. 5，流 速0. 5mL/min,檢測波長190-800nm。采用分子篩高壓液相色譜柱純化，液相柱型號TSK G3000SW (規(guī)格7. 5mmX 60cm)，熒光標(biāo)記抗抗體最先被洗脫下來，收集第一個洗脫峰，即為 純化的熒光抗抗體。通過計算目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫峰面積與全部洗脫峰面積的比例即交聯(lián)效率 為 90%。RPC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外_可見光分光光度計 上測定，掃描波長區(qū)間250-700nm。室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜在熒光分光光度計上測定，用580nm 的激發(fā)光激發(fā)，熒光發(fā)射波長掃描范圍為600-700nm，檢測步長為0. 2nm，狹縫寬度為3nm， 檢測靈敏度為中等，掃描速度為lOOOnm/min，每個樣品掃描3次取平均值，用不含蛋白的相 同溶液作背景扣除。RPC標(biāo)記熒光抗抗體與RPC的吸收峰位置相同，但在紫外區(qū)吸光度明 顯高于RPC，這是因?yàn)镽PC表面交聯(lián)了抗抗體分子，而抗抗體在280nm有較強(qiáng)的光吸收，在 450-700nm范圍內(nèi)抗抗體無光吸收。RPC標(biāo)記熒光抗抗體與對照RPC在540nm激發(fā)光的激 發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波長均位于632nm，沒有發(fā)生斯托克位移的改變，且熒光亮度無明顯降 低。RPC抗豬IgG熒光抗抗體的效價檢測對流免疫電泳法檢測RPC標(biāo)記熒光抗抗體 的免疫學(xué)活性。RPC標(biāo)記熒光抗抗體與動物IgG形成青色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地 觀察到沉淀線的位置。免疫沉淀線的形成說明抗抗體與RPC交聯(lián)成功，同時也說明交聯(lián)物 仍然保留較高的抗體活性。RPC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續(xù)電泳裝置上 進(jìn)行，分離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%。恒壓電泳，電壓為218V。用0. 25% (w/v) 考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色后觀察結(jié)果。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)RPC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗 體同樣既具有RPC的α、β亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶。RPC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的穩(wěn)定性檢測純化的RPC標(biāo)記熒光抗抗體中加入 0. 02%疊氮化鈉，4°C避光保存，每隔30天測定一次熒光光譜和抗體效價。RPC標(biāo)記的抗豬 IgG熒光抗抗體穩(wěn)定性同RPC標(biāo)記的抗雞IgG熒光抗抗體相似，在0. 05mol/L的磷酸緩沖液 中4°C保存60天，熒光抗抗體的熒光強(qiáng)度保持不變，抗體效價維持在5Log 2。
權(quán)利要求
一種R 藻藍(lán)蛋白(RPC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法，包括陰離子交換層析法制備多管藻RPC，分別用摩爾比20 30∶1、50 100∶1的交聯(lián)劑SPDP將RPC、抗抗體衍生，抗抗體的SPDP衍生物經(jīng)摩爾比50 100∶1的DTT還原獲得帶 HS的抗抗體，帶 HS的抗抗體與RPC的衍生物以摩爾比1∶2 3液相交聯(lián)，經(jīng)HPLC純化制備出熒光抗抗體，制備的熒光抗抗體得率高、純度高、穩(wěn)定性好、熒光呈明亮的紅色，可作為通用熒光探針用于雞、豬傳染病的間接免疫熒光檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中RPC的制備由多管藻中采用陰離子交換層析法分離 純化，純化步驟為取冷凍保存的多管藻，加入20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)，4°C下溶脹24h， 多層紗布過濾、擠壓獲得褐色浸提液，然后加入固體硫酸銨至濃度為60% (w/v)，4°C放置 24h，離心收集沉淀，將沉淀溶于20mM的醋酸緩沖液(pH5. 8)中，然后對20mM的醋酸緩沖液 (pH5. 8)透析，透析液加到用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)(含50mM NaCl)預(yù)平衡過的陰離子 交換柱，用20mM醋酸緩沖液(pH5. 8)沖洗掉陰離子交換柱上過量的樣品和雜質(zhì)，用20mM醋 酸緩沖液(PH4. 8)(含50mM NaCl) 一步洗脫就可得到大量純的RPC，純化的多管藻RPC純度 達(dá)電泳純，純度指數(shù)A62tZA28tl >4. 5，結(jié)構(gòu)式為(α β)3，分子量約為llOkDa，最大吸收峰分 別位于540、620nm，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于640nm，純化的RPC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用 前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為5mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抗抗體為抗雞IgG抗體、抗豬IgG抗體，購自Sigma公 司，電泳檢測純度達(dá)電泳純，對流免疫電泳法檢測抗抗體具有良好的生物學(xué)活性，標(biāo)記時用 PBS透析，調(diào)整蛋白濃度為5mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中熒光抗抗體的制備采用蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)在液相體系中 化學(xué)交聯(lián)制備，制備方法為以DMSO準(zhǔn)確配制SPDP母液，分別用雙功能化學(xué)交聯(lián)劑SPDP衍 生RPC、抗抗體，SPDP與RPC、抗抗體的摩爾比分別為20-30 1,30-60 1，混勻、鋁箔封好 后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT按30-60 1的摩爾比與抗抗體 衍生物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)lh，超濾離心除去多余的DTT，抗抗體-HS與RPC衍生物以 摩爾比1 2-3混勻，鋁箔封好后于20-25°C振蕩反應(yīng)20h，加NEM封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn) 反應(yīng)60mino
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中熒光抗抗體經(jīng)HPLC純化，純化在液相色譜工作站上進(jìn) 行，液相柱型號 TSK G3000SW (規(guī)格 7. 5mmX 60cm)，流動相為 50mM pH 7. 5PBS，流速 0. 5ml/ min，檢測波長190-800nm，收集洗脫19. 57min出現(xiàn)的產(chǎn)物峰，置4°C避光保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種R-藻藍(lán)蛋白(R-phycocyanin，RPC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法。制備過程為陰離子交換層析法制備RPC，分別用摩爾比20-30∶1、50-100∶1的雙功能化學(xué)交聯(lián)劑SPDP將RPC、抗抗體衍生，衍生物以適宜摩爾比液相交聯(lián)，經(jīng)高壓液相色譜純化制備出RPC標(biāo)記的熒光抗抗體。本法制備的RPC標(biāo)記的熒光抗抗體交聯(lián)效率高，純度達(dá)電泳純，紅色熒光明亮，熒光抗體活性穩(wěn)定，可作為通用熒光探針用于動物傳染病的間接免疫熒光檢測。
文檔編號G01N33/533GK101980020SQ201010284339
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者朱麗萍, 顏世敢, 顏士勇 申請人:顏世敢