專利名稱：土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙及其制備方法、利用該檢測試紙的檢測方法和定量檢測系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙及其制 備方法、利用該檢測試紙的檢測方法和定量檢測系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
土拉菌病(Tularaemia)是一種急性、感染性人獸共患疾病，其致病菌是土拉弗朗 西斯菌(Francisella tularensis)，易感動物為嚙齒類動物，人通過破損的皮膚、結(jié)膜感 染，吸入或食入極少量(10 50個)土拉菌便可發(fā)病，臨床表現(xiàn)為皮膚潰爛、淋巴腺腫大、 肺部感染和傷寒樣癥狀，病情嚴(yán)重甚至死亡。目前，國內(nèi)用的雙抗原夾心膠體金法檢測土拉菌時，常用土拉菌的脂多糖(LPS) 作為檢測血清中抗體的抗原。但脂多糖在大量的獲取、對環(huán)境的污染及操作人員安全等方 面存在缺陷，限制了這些方法的推廣和應(yīng)用。而FopA蛋白是一種具有土拉菌共有的特異性 強(qiáng)和保守性好的外膜蛋白，并具有良好的抗原性，可用作檢測土拉菌的檢測抗原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種土拉弗朗西斯菌檢測試紙及其制備方法、利用上述檢 測試紙快捷檢測土拉弗朗西斯菌的方法、和利用上述檢測試紙定量檢測土拉弗朗西斯菌的 檢測系統(tǒng)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙 條，包括反應(yīng)支撐物、緊密連接于反應(yīng)支撐物上表面中部的硝酸纖維膜，硝酸纖維膜起始端 的上表面與吸水墊部分重疊連接、硝酸纖維膜末端的下表面與金標(biāo)抗體保護(hù)膜部分重疊連 接，金標(biāo)抗體保護(hù)膜的下表面部分重疊連接有樣品墊，其中，金標(biāo)抗體保護(hù)膜包括膜本體、 及均勻涂布在其上的膠體金標(biāo)記的SPA涂層，硝酸纖維膜上靠近其起始端處設(shè)置有羊抗兔 IgG包被的質(zhì)控條帶、靠近其末端處設(shè)置有重組FopA蛋白包被的檢測條帶。進(jìn)一步，所述反應(yīng)支持物為PVC板，吸水墊為濾油紙。進(jìn)一步，所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜為玻璃纖維膜、聚脂膜或濾紙纖維。進(jìn)一步，所述樣品墊為玻璃纖維膜、聚脂膜或濾紙纖維。進(jìn)一步，所述試紙整體的外部包裹有外殼，該外殼上對應(yīng)于所述樣品墊處設(shè)置有 樣品孔，外殼上對應(yīng)于所述質(zhì)控條帶、檢測條帶處設(shè)置有觀察窗。一種上述土拉弗朗西斯菌檢測試紙的制備方法，具體為1)制備膠體金配制濃度為0.01%的HAuCl4水溶液，并調(diào)整其PH值為6-8，用PB 稀釋抗體至濃度為0. 2mg/ml ；2)制備金標(biāo)抗體保護(hù)膜取步驟1)中制備的膠體金以Iml/管分裝于若干個 1.5ml的離心管中，每支管中抗原量為2-10ug，輕搖混勻后放置；每管中加入10%的BSA lOOul，混勻放置；將上面初步制得的膠體金探針進(jìn)行第一步離心處理，棄上清液；每支離
4心管中加入Iml重懸液懸浮沉淀后進(jìn)行第二步離心處理；棄上清液，管底得到暗紅色的疏 松狀沉淀，加入500ul重懸液重懸后進(jìn)行第三步離心處理，取上清液后，將其均勻滴加在金 標(biāo)抗體保護(hù)膜的膜體上，并干燥處理；3)硝酸纖維膜的噴涂包被在膜體上噴涂羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶、重組FopA 蛋白包被的檢測條帶，再將膠體金標(biāo)記的SPA均勻涂布在膜體上；4)將反應(yīng)支撐物、硝酸纖維膜、吸水墊、金標(biāo)抗體保護(hù)膜和樣品墊按照試紙結(jié)構(gòu)形 式進(jìn)行組裝來制備檢測試紙。進(jìn)一步，所述步驟1)中的具體步驟為磁力攪拌下準(zhǔn)確加入Iml 的HAuCl4, 同時加入1. 5-3ml 的檸檬酸三鈉水溶液，顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱，冷卻至室溫后加純水至 100ml，4°C避光保存；用K2CO3調(diào)PH值為6 7、優(yōu)選為6. 3 6. 9、更優(yōu)選6. 4 6. 8后，用 PB稀釋抗體至0. 2mg/ml，并保持膠體金穩(wěn)定。進(jìn)一步，所述步驟2)中每支所述離心管中的抗原量優(yōu)選為3 8ug，更優(yōu)選為4 7ug，最優(yōu)選為5 6ug ；所述第一步離心處理中在12000rpm、4°C下離心30分鐘，所述第二 步離心處理在12000rpm、4°C下離心30分鐘，第三步離心處理在1000rpm、4°C下離心10分鐘。進(jìn)一步，所述步驟3)中利用隔流噴金劃線機(jī)以10-100mm/S的噴膜速度噴涂所述 質(zhì)控條帶和檢測條帶，該噴膜速度更優(yōu)選為45 55mm/s、最優(yōu)選為50mm/s ；所述重組FopA 蛋白的濃度為l_5mg/ml，采用PB稀釋液稀釋；所述羊抗兔IgG濃度為0. l_5mg/ml，該濃度 更優(yōu)選為0. 5-2. 5 mg/ml，最優(yōu)選為lmg/ml。進(jìn)一步，所述步驟3)中SPA用PB稀釋，其pH為6 7，優(yōu)選為6. 3 6. 9，更優(yōu)選 為 6. 4 6. 8。一種利用上述檢測試紙快捷檢測土拉弗朗西斯菌的方法，具體為將待測標(biāo)本與 樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，液體依靠虹吸作用向試紙另一端擴(kuò) 展，待測標(biāo)本中含有的土拉弗朗西斯菌將與膠體金標(biāo)記的SPA形成相應(yīng)的復(fù)合物，該復(fù)合 物與重組FopA蛋白結(jié)合，在檢測條帶處形成紅色線條來提示檢測到相應(yīng)的菌類；在質(zhì)控條 帶處，復(fù)合物與羊抗兔IgG形成紅色沉淀線，以檢驗試紙的有效性。一種利用上述檢測試紙定量檢測土拉弗朗西斯菌的檢測系統(tǒng)，包括檢測試紙和金 標(biāo)免疫分析儀，其中檢測試紙包括硝酸纖維膜和含有膠體金標(biāo)記的SPA的金標(biāo)抗體保護(hù) 膜，硝酸纖維膜上靠近其起始端處設(shè)置有羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶、靠近其末端處設(shè)置 有重組FopA蛋白包被的檢測條帶；金標(biāo)免疫分析儀能夠判讀該試紙條對土拉弗朗西斯菌 的檢測結(jié)果，以實現(xiàn)定性和定量檢測。本發(fā)明利用制備的重組抗原，采用間接法的膠體金免疫層析試紙條來檢測土拉菌 抗體，具有操作簡單，檢測時間短，無需專業(yè)人員，適合快速現(xiàn)場檢測等優(yōu)點。


圖1為本發(fā)明檢測試紙條的目測敏感性圖；圖2為特異性檢測試驗圖；圖3為本發(fā)明檢測試紙條穩(wěn)定性檢測圖；圖4為本發(fā)明檢測試紙的擬合直線圖5A為本發(fā)明檢測試紙的正面示意圖；圖5B為本發(fā)明檢測試紙的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖；圖6A為本發(fā)明檢測試紙的陽性檢測結(jié)果示意圖；圖6B為本發(fā)明檢測試紙的陰性檢測結(jié)果示意圖；圖6C為本發(fā)明檢測試紙的無效檢測結(jié)果示意圖。
具體實施例方式如圖1至圖4，圖5A、圖5B、圖6A、圖6B、圖6C所示，圖1是本發(fā)明檢測試紙條的目 測敏感性圖。1 陰性對照；2-7 土拉菌抗體濃度2400ng/mL、1200ng/mL、120ng/mL、60ng/ mL、30ng/mL、15ng/mL。圖2為特異性檢測試驗。測試條1-6 :lug/mL的馬秋波GP2抗體、天花MlR抗體、 黃熱YF-E-D3抗體、禽流感NP抗體、登革病毒Deng-E-D3抗體和普氏立克次體120N抗體圖3為本發(fā)明檢測試紙條的目測敏感性圖穩(wěn)定性檢測；測試條1 陰性對照，2 4 土拉菌抗體濃度 120ng/mL、60ng/mL、30ng/mL圖5A、圖5B中，1 吸水墊；2 硝酸纖維膜，T 包被重組FopA蛋白檢測條帶；C 包 被羊抗兔IgG的質(zhì)控條帶；3 含有膠體金標(biāo)記SPA的玻璃纖維膜；4 樣品墊；5 反應(yīng)支持 物。圖6A、圖6B、圖6C是本發(fā)明的檢測結(jié)果示意圖；T、C兩條線陽性；C 一條線陰性；無效。本發(fā)明檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，定性檢測土拉弗朗西 斯菌抗體靈敏度達(dá)到30ng/ml。在模擬樣品檢測中，檢測正常人血清中添加不同濃度土拉 弗朗西斯菌抗體的靈敏度達(dá)到到30ng/ml。另外，本發(fā)明的膠體金免疫層析試紙條在37°C 放置一周后檢測發(fā)現(xiàn)試紙條的檢測敏感性沒有下降，顯示了良好的穩(wěn)定性，相當(dāng)于4°C存放 12個月的效果；與馬秋波GP2抗體、天花MlR抗體、黃熱YF-E-D3抗體、禽流感NP抗體、登 革病毒Deng-E-D3抗體和普氏立克次體120N抗體等相似毒素沒有交叉反應(yīng)特異性良好。結(jié)合金標(biāo)免疫分析儀建立了膠體金免疫層法定量檢測土拉弗朗西斯菌抗體的工 作擬合曲線，在線性范圍內(nèi)，即R2 0. 9905 ；線性范圍30 960ng/ml，可以進(jìn)行定量檢測。經(jīng) 檢測發(fā)現(xiàn)，該方法回收率高(41. 0% 118. 6% )、重復(fù)性良好。本研究建立的膠體金定量檢 測方法可以在15min內(nèi)完成一定范圍內(nèi)的定量檢測，檢測時間縮短了 3 4個小時。并且 經(jīng)過整個檢測系統(tǒng)的優(yōu)化克服了檢測血清樣品時出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。本發(fā)明采用膠體金標(biāo)記，實質(zhì)是抗體蛋白等生物大分子被吸附到膠體金顆粒表面 的包被過程。本發(fā)明中的檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，同時可利用 金標(biāo)免疫分析儀進(jìn)行的定量檢測，該試紙的工作原理是利用特異性抗原-抗體的結(jié)合，用 膠體金標(biāo)記抗體，與待檢抗原結(jié)合后，使與試紙上結(jié)合的捕獲抗體顯色。本發(fā)明檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其中包括將待測標(biāo)本 與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用上行， 10-15分鐘判讀結(jié)果；所述檢測試紙條包括(1)反應(yīng)支持物；(2)吸水墊；
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(3)硝酸纖維膜，該膜包被有重組FopA蛋白和質(zhì)控抗體的檢測條帶和質(zhì)控條帶；(4)金標(biāo)抗體保護(hù)膜，其中含有膠體金標(biāo)記的SPA ；(5)樣品墊；其中反應(yīng)支持物選用PVC板；吸水墊選用濾油紙；硝酸纖維膜上靠近其起始端處 設(shè)置有羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶、靠近其末端處設(shè)置有重組FopA蛋白包被的檢測條帶。 金標(biāo)抗體保護(hù)膜的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，其上含有膠體金標(biāo)記的SPA ；樣 品墊材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。本發(fā)明檢測試紙中的吸水墊選用濾紙，反應(yīng)支持物選用PVC板，金標(biāo)抗體保護(hù)膜 的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，其上均勻涂布有膠體金標(biāo)記的抗體。本發(fā)明方法所涉及試紙中的所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜由將膠體金標(biāo)記的SPA均勻涂 布在聚脂膜、玻璃纖維膜或濾紙纖維膜上來制成。本發(fā)明檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條的結(jié)構(gòu)為反應(yīng)支持物 5位于底層，硝酸纖維膜2位于反應(yīng)支持物5上的中部，硝酸纖維膜2的T處是重組FopA蛋 白包被的檢測條帶，C處是羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶；金標(biāo)抗體保護(hù)膜3位于硝酸纖維膜 2上部的一側(cè)并與之部分重疊，該膜含有膠體金標(biāo)記的重組土拉弗朗西斯菌抗體；吸水墊1 位于硝酸纖維膜2上部的相對于金標(biāo)抗體保護(hù)膜3而言的另一側(cè)、并與硝酸纖維膜2部分 重疊；樣品墊4位于硝酸纖維膜2上與吸水墊1相反的一側(cè)并與金標(biāo)抗體保護(hù)膜3部分重 疊。上述試紙中，吸水墊1 一側(cè)為起始端，金標(biāo)抗體保護(hù)膜3 —側(cè)為末端，檢測條帶位 于接近末端，質(zhì)控條帶接近于起始端。上述試紙中，重組FopA蛋白的濃度為l_5mg/ml，質(zhì)控羊抗兔I gG的濃度為 0. l_5mg/ml0上述試紙中，羊抗兔IgG抗體濃度優(yōu)選為0. 5-2. 5mg/ml。上述試紙中，SPA標(biāo)記Iml膠體金的量為5_6ug。本發(fā)明再一個目的是提供一種檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙 條的制備方法，該方法包括以下步驟膠體金探針的制備，金標(biāo)墊的制備，硝酸纖維膜的噴 涂包被。1、膠體金探針的制備(1)將HAuCl 4先配制為0. 01 %水溶液。磁力攪拌下準(zhǔn)確加入Iml 1 %的HAuCl4, 同時加入1. 5-3ml 的檸檬酸三鈉水溶液。顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱，冷卻至室溫后加純水補 足至100ml，4 °C避光保存。(2)用K2CO3調(diào)pH值為約6_7，優(yōu)選為約6. 3-6. 9，更優(yōu)選約6. 4-6. 8。(3)將膠體金調(diào)至 pH 6. 4-6. 8，，用 PB (pH 7. 2)稀釋抗體至 0. 2mg/ml。(4)保持膠體金穩(wěn)定。本發(fā)明還在于提供一種獲得維持膠體金穩(wěn)定的抗原最佳標(biāo)記劑量的方法，該方法 包括a.取10支潔凈的1. 5ml離心管，分別加入膠體金溶液Iml。b.在 1-10 號管內(nèi)分別加入 10ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、 100ml的PB,再依次加入稀釋好的0. 2mg/ml的待標(biāo)記抗原90ml、80ml、70ml、60ml、50ml、40ml、30ml、20ml、10ml、0ml，混勻，靜置 2 分鐘。c.在10個管內(nèi)分別加入10% NaCl溶液100ml，混勻后室溫靜置2小時，觀察顏色變化。未加抗原及加入量不足以穩(wěn)定膠體金的試管中的液體顏色呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的變化， 而加入抗體量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定劑量的試管則保持紅色不變。與對照管(1號管)相比， 顏色最接近、含抗原劑量最低的試管所含的抗原劑量，即為Iml膠體金所必須的抗原穩(wěn)定 劑量，在此基礎(chǔ)上再加20%抗原，即為抗原最佳標(biāo)記劑量。本發(fā)明經(jīng)過反復(fù)試驗和分析，得 出的結(jié)果表明維持膠體金溶液適宜抗原量為2-lOug，優(yōu)選抗體量3-8ug，更優(yōu)選4-7ug，最 優(yōu)選為5-6ug。2、金標(biāo)墊的制備取上述pH的膠體金以Iml/管分裝于1. 5ml的離心管中。每支管中加入2-lOug， 優(yōu)選抗原量3-8ug，更優(yōu)選4-7ug，最優(yōu)選為5-6ug的抗原，輕搖混勻后放置。每管中加入 10%的BSAlOOul，混勻放置。將上面初步制得的膠體金探針在12000rpm、4°C下離心30分 鐘，棄上清液。每支離心管中加入Iml重懸液懸浮沉淀后同上離心。棄上清液，管底得到暗 紅色的疏松狀沉淀，加入500ul重懸液重懸后于4°C，lOOOrpm，離心10分鐘；取上清液，均 勻滴加在Icm寬的玻璃纖維上，37°C干燥。3、硝酸纖維膜的噴涂包被(1)利用隔流噴金劃線機(jī)以50mm/s的噴膜速度包被檢測重組FopA蛋白和質(zhì)控羊 抗兔IgG兩個條帶的硝酸纖維膜；在該噴涂包被膜的步驟中，噴膜速度優(yōu)選是lO-lOOmm/s，更優(yōu)選是45-55mm/s，最 優(yōu)選是50mm/s ；所述重組FopA蛋白，其加入量為l_5mg/ml，該蛋白的稀釋液還可以為PBS ； 質(zhì)控羊抗兔IgG可以購自鼎國生物技術(shù)公司，其濃度為0. l-5mg/ml更優(yōu)選是0. 5-2. 5mg/ ml,最優(yōu)選為lmg/ml ；(2)制備一種含有膠體金標(biāo)記的SPA的玻璃纖維膜，將膠體金標(biāo)記的SPA均勻涂布 在玻璃纖維膜上。SPA用PB稀釋，pH為6-7，優(yōu)選為約6. 3-6. 9，更優(yōu)選約6. 4-6. 8。本發(fā)明還公開了所述試紙在檢測土拉弗朗西斯菌抗體中的應(yīng)用。在本發(fā)明利用膠體金免疫檢測試紙條檢測土拉弗朗西斯菌抗體的方法中，先將待 測標(biāo)本放入裝有稀釋液的小瓶內(nèi)，再用移液器將樣品混合液加入試紙“4”處(即末端)，樣 品中的液體依靠虹吸作用上行，一般需10-15分鐘判讀結(jié)果如標(biāo)本中含有土拉弗朗西斯菌抗體，則它將與試紙上膠體金標(biāo)記的SPA形成相應(yīng) 的復(fù)合物，液體展開上行并與硝酸纖維膜上的重組FopA蛋白結(jié)合，形成紅色線條，即在“T” 處形成紅色條帶。無論是否含有相對應(yīng)的抗原，膠體金標(biāo)記SPA繼續(xù)隨液體繼續(xù)上行并與該膜上的 羊抗兔IgG形成紅色沉淀線，即在“C”處形成紅色條帶。此線是質(zhì)控條帶，如膠體金失效， 此線就不會出現(xiàn)，說明試紙失效。陽性結(jié)果會出現(xiàn)2條紅色沉淀線，陰性結(jié)果出現(xiàn)1條紅色沉淀線，如不出現(xiàn)線條說 明試紙失效。如若肉眼無法辨別T處紅色條帶，可利用金標(biāo)免疫分析儀進(jìn)行半定量檢測。本方法的技術(shù)方案是采用重組FopA蛋白、和羊抗兔IgG分別固相于硝酸纖維膜 上，結(jié)合膠體金標(biāo)記的SPA，應(yīng)用膜層析雙抗原夾心法的原理檢測標(biāo)本中的土拉弗朗西斯菌抗體。本發(fā)明還提供一種利用上述檢測試紙定量檢測土拉弗朗西斯菌的檢測系統(tǒng)，該系 統(tǒng)為將膠體金免疫檢測試紙條與膠體金生物傳感器有機(jī)整合的膠體金定量檢測系統(tǒng)。運 用金標(biāo)免疫分析儀的優(yōu)勢在于，判讀儀能夠在人眼無法正確識別可疑物檢測是否存在陽性 的情況下，正確判讀該試紙條檢測結(jié)果。減少了因人為主觀判讀帶來的錯誤率，增加了客觀 性、準(zhǔn)確性；并且可實現(xiàn)定量檢測。此外，金標(biāo)免疫分析儀攜帶方便、使用簡單、判定準(zhǔn)確、 結(jié)果客觀、易保留，為檢驗檢驗工作帶來了方便。純化的土拉菌FopA蛋白與兔抗重組土拉菌FopA蛋白的多克隆抗體由本實驗室制 備；SPA購自與Sigma公司；羊抗兔IgG購自北京鼎國技術(shù)有限公司；Biotin購自Pierce。本發(fā)明所述的方法和產(chǎn)品中使用層析測試條耗材，耗材例如是玻璃纖維的結(jié)合 墊，硝酸纖維素膜(例如NC膜，SHF 1350225)，樣品墊及吸水墊、濾紙，可購自Minipore公司。本發(fā)明涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙，它還包含金標(biāo)抗體保護(hù)膜。本發(fā)明涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙，其中反應(yīng)支持物選用PVC 板。本發(fā)明涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙，其中吸水墊選用濾紙。本發(fā)明涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙，其中金標(biāo)抗體保護(hù)膜選用聚 脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。一、膠體金免疫層析試紙條的制備材料和方法1、抗原及抗體純化的土拉菌FopA蛋白與兔抗重組土拉菌FopA蛋白的多克隆抗體由本實驗室制 備；SPA購自與Sigma公司；羊抗兔IgG購自北京鼎國技術(shù)有限公司；Biotin購自Pierce。2、層析測試條耗材結(jié)合墊(玻璃纖維)、硝酸纖維素膜(NC膜，SHF1350225)、樣品墊及吸水墊、濾紙 購自Minipore公司。3、實驗儀器金標(biāo)免疫分析儀可購自中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所、中國檢驗檢疫科學(xué) 研究院聯(lián)合研制的分析儀。4、膠體金免疫層析試紙條的制備4. 1膠體金結(jié)合墊將pH值6. 4 6. 8、濃度0. 2mg/ml的SPA標(biāo)記于檸檬酸鈉法制備25nm的膠體金 顆粒的膠體金顆粒，37 °C干燥。4. 2硝酸纖維素膜檢測帶重組FopA蛋白1mg/ml;質(zhì)控帶羊抗兔IgG:lmg/ml，37 °C干燥(參見文獻(xiàn):01sensS. "he history of ricin, abrin and relatedtoxins"Toxicon,2004, 44(4) :361-370 ；王景林.“麻毒素生物恐怖及其醫(yī)學(xué)防護(hù)”科技導(dǎo)報，2003，7 :35_37 ; Patocka J. Abrin and icin :twodangerouspoisonousproteins. available athttp:// www. asabktr. cin/news letter/01-4/articlem/Abrin&RicinRev. pd. f ；Grabar KC,Freeman RG, Hommer MB, et al. Preparation and characterization of Au colloid mono-layers[J]. Anal Chem, 1995，67 :735_743)。4. 3 組裝將樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊依次貼在帶有豁合劑的底襯卡，切成0. 4cm的條，干燥， 裝殼，室溫貯存?zhèn)溆?參見上述文獻(xiàn))。二、樣品的定性和定量檢測的判定1、模擬樣品的處理采用人的血清樣品進(jìn)行檢測，用樣品處理液進(jìn)行100倍稀釋后作為待檢樣品 ’另 外，把稀釋后的人血清中加入FopA抗體同時進(jìn)行檢測。2、定性檢測將處理后的樣品和樣品處理液(作為陰性樣品)IOOul加到制備好的層析條樣品 墊端，靜置15min，觀察結(jié)果。檢測帶和質(zhì)控帶均出現(xiàn)紅色判為陽性，僅質(zhì)控帶出現(xiàn)紅色為陰 性，檢測帶和質(zhì)控帶均不顯色，則為試紙條失效。3、定量檢測3. 1判定值(CUT-OFF)的確定按1.6. 1將陰性樣品檢測20次，用金標(biāo)免疫分析儀掃描讀取信號T/C比值。20個 樣品T/C比值的平均值(AVERAGE)與3倍標(biāo)準(zhǔn)差(STDEVA)之和為CUT-OFF值。3. 2定量檢測判定將顯色后的金標(biāo)條放入金標(biāo)免疫分析儀掃描，讀取信號T/C比值，大于判定值為 陽性。三、靈敏度試驗1、定量檢測的靈敏度檢測不同濃度土拉弗朗西斯菌抗體，經(jīng)過計算判定值(OTT-OFF)為0. 002，濃度為 15ng/ml的土拉菌FopA多抗的平均T/C比值均為0. 001，低于0. 002，為陰性；30 2400ng/ ml 的土拉菌 FopA 多抗的平均 T/C 比值分別為 0. 03,0. 061,0. 122,0. 211,0. 367,0. 627， 高于0. 002的結(jié)果為陽性；當(dāng)土拉菌FopA多抗?jié)舛却笥?0ng/ml時，T/C比值平均值大于 0. 002，故檢測靈敏度為30ng/ml。表1 土拉弗朗西斯菌抗體膠體金免疫層析試紙條各濃度檢測結(jié)果
權(quán)利要求
一種檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其特征在于，該檢測試紙條包括反應(yīng)支撐物、緊密連接于反應(yīng)支撐物上表面中部的硝酸纖維膜，硝酸纖維膜起始端的上表面與吸水墊部分重疊連接、硝酸纖維膜末端的下表面與金標(biāo)抗體保護(hù)膜部分重疊連接，金標(biāo)抗體保護(hù)膜的上表面部分重疊連接有樣品墊，其中，金標(biāo)抗體保護(hù)膜包括膜本體、及均勻涂布在其上的膠體金標(biāo)記的SPA涂層，硝酸纖維膜上靠近其起始端處設(shè)置有羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶、靠近其末端處設(shè)置有重組FopA蛋白包被的檢測條帶。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其特征在 于，所述反應(yīng)支持物為PVC板，吸水墊為濾油紙。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其特征在 于，所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜為玻璃纖維膜、聚脂膜或濾紙纖維；所述樣品墊為玻璃纖維膜、聚 脂膜或濾紙纖維。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其特征在 于，所述試紙整體的外部包裹有外殼，該外殼上對應(yīng)于所述樣品墊處設(shè)置有樣品孔，外殼上 對應(yīng)于所述質(zhì)控條帶、檢測條帶處設(shè)置有觀察窗。
5.一種上述土拉弗朗西斯菌檢測試紙的制備方法，其特征在于，該制備方法具體為1)制備膠體金配制濃度為0.01 %的HAuCl4水溶液，并調(diào)整其PH值為6_8，用PB稀釋 抗體至濃度為0. 2mg/ml ；2)制備金標(biāo)抗體保護(hù)膜取步驟1)中制備的膠體金以Iml/管分裝于若干個1.5ml的 離心管中，每支管中抗原量為2-10ug，輕搖混勻后放置；每管中加入10%的BSA lOOul，混 勻放置；將上面初步制得的膠體金探針進(jìn)行第一步離心處理，棄上清液；每支離心管中加 入Iml重懸液懸浮沉淀后進(jìn)行第二步離心處理；棄上清液，管底得到暗紅色的疏松狀沉淀， 加入500ul重懸液重懸后進(jìn)行第三步離心處理，取上清液后，將其均勻滴加在金標(biāo)抗體保 護(hù)膜的膜體上，并干燥處理；3)硝酸纖維膜的噴涂包被在膜體上噴涂羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶、重組FopA蛋白 包被的檢測條帶，再將膠體金標(biāo)記的SPA均勻涂布在膜體上；4)將反應(yīng)支撐物、硝酸纖維膜、吸水墊、金標(biāo)抗體保護(hù)膜和樣品墊按照試紙結(jié)構(gòu)形式進(jìn) 行組裝來制備檢測試紙。
6.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1)中的具體步驟為磁力攪 拌下準(zhǔn)確加入Iml 1 %的HAuCl4,同時加入1. 5_3ml 1 %的檸檬酸三鈉水溶液，顏色穩(wěn)定后 繼續(xù)加熱，冷卻至室溫后加純水至100ml，4°C避光保存；用K2CO3調(diào)PH值為6 7、優(yōu)選為 6. 3 6. 9、更優(yōu)選6. 4 6. 8后，用PB稀釋抗體至0. 2mg/ml，并保持膠體金穩(wěn)定。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中每支所述離心管中的 抗原量優(yōu)選為3 8ug，更優(yōu)選為4 7ug，最優(yōu)選為5 6ug ；所述第一步離心處理中在 12000rpm、4°C下離心30分鐘，所述第二步離心處理在12000rpm、4°C下離心30分鐘，第三步 離心處理在1000rpm、4°C下離心10分鐘。
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中利用隔流噴金劃線機(jī)以 10-100mm/s的噴膜速度噴涂所述質(zhì)控條帶和檢測條帶，該噴膜速度更優(yōu)選為45 55mm/s、 最優(yōu)選為50mm/s ；所述重組FopA蛋白的濃度為l_5mg/ml，采用PB稀釋液稀釋；所述羊抗兔 IgG濃度為0. l_5mg/ml，該濃度更優(yōu)選為0. 5-2. 5mg/ml，最優(yōu)選為lmg/ml ；所述步驟3)中SPA用PB稀釋，其pH為6 7，優(yōu)選為6. 3 6. 9，更優(yōu)選為6. 4 6. 8。
9.一種利用上述檢測試紙快捷檢測土拉弗朗西斯菌的方法，其特征在于，該方法具體 為將待測標(biāo)本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，液體依靠虹吸作用 向試紙另一端擴(kuò)展，待測標(biāo)本中含有的土拉弗朗西斯菌將與膠體金標(biāo)記的SPA形成相應(yīng)的 復(fù)合物，該復(fù)合物與重組FopA蛋白結(jié)合，在檢測條帶處形成紅色線條來提示檢測到相應(yīng)的 菌類；在質(zhì)控條帶處，復(fù)合物與羊抗兔IgG形成紅色沉淀線，以檢驗試紙的有效性。
10.一種利用上述檢測試紙定量檢測土拉弗朗西斯菌的檢測系統(tǒng)，其特征在于，該檢測 系統(tǒng)包括檢測試紙和金標(biāo)免疫分析儀，其中檢測試紙包括硝酸纖維膜和含有膠體金標(biāo)記的 SPA的金標(biāo)抗體保護(hù)膜，硝酸纖維膜上靠近其起始端處設(shè)置有羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶、 靠近其末端處設(shè)置有重組FopA蛋白包被的檢測條帶；膠體金測試條判讀儀能夠判讀該試 紙條對土拉弗朗西斯菌的檢測結(jié)果，以實現(xiàn)定性和定量檢測。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙及其制備方法、利用該檢測試紙的檢測方法和定量檢測系統(tǒng)、利用該檢測試紙的檢測方法和定量檢測系統(tǒng)，其利用膠體金標(biāo)記和雙抗體夾心免疫層析技術(shù)，建立土拉弗朗西斯菌抗體的快速檢測方法，建立的檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫層析方法，能快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測樣品中的土拉弗朗西斯菌抗體，并可實現(xiàn)定量，適用于現(xiàn)場快速檢測。
文檔編號G01N33/569GK101982776SQ201010295330
公開日2011年3月2日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者孫肖紅, 景瀅瀅, 楊宇, 楊永莉, 王靜, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院