專利名稱：一種適配體功能化磁性納米材料磁分離-上轉(zhuǎn)換熒光納米材料標記檢測赭曲霉毒素a的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用磁性納米材料和上轉(zhuǎn)換熒光納米材料結(jié)合核酸適配體識別對赭 曲霉毒素A進行檢測，特點在于利用赭曲霉毒素A適配體功能化的磁性納米材料對大宗 樣品中赭曲霉毒素A分離富集，使得檢測周期縮短并使得檢測靈敏度提高，同時利用上 轉(zhuǎn)換熒光納米材料作為標記物通過檢測激光誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換熒光信號進一步提高檢測的靈敏 度，該方法屬于納米材料與分子生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
赭曲霉毒素AfochratoxinA，OTA)是曲霉菌屬和青霉菌屬的某些種產(chǎn)生的空間 代謝產(chǎn)物，毒理學研究表明，OTA具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性，以及致畸、致 癌和致突變作用等多種毒性，對動物和人體健康有很大的潛在危害。OTA在自然界分 布廣泛，主要存在于谷類、豆類及豆制品、干果、咖啡、葡萄及葡萄酒、香科、汕料作 物、啤酒、茶葉等中。因此，建立準確、靈敏、快速的OTA檢測技術(shù)對于食品安全具行 重要意義。
目前已建立的OTA檢測方法主要包括薄層層析法、高壓液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用、 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、膠體金免疫層析分析法(GICA)等?，F(xiàn)場快速篩檢方法中則以 ELISA和GICA方法應(yīng)用最多，這兩種方法均是基于抗原一抗體親和反應(yīng)，以抗體作為識 別分子。但抗體易受外界條件尤其是溫度的影響，對保藏條件要求苛刻，在很大程度上 限制了方法的靈活應(yīng)用。此外，抗體制備需要經(jīng)過動物實驗或細胞實驗，繁瑣費時，制 備的抗體成本高，發(fā)展的方法檢測成本也相應(yīng)偏高。所以有必要發(fā)展一種快速方便，穩(wěn) 定性好、靈敏度高、特異性強、使用成本低的新型檢測方法。
核酸適配體(aptamer)是從體外合成的隨機寡核苷酸文庫中通過指數(shù)富集配體的 系統(tǒng)進化(systematiccvolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技術(shù)蹄選得至Ll的與靶物質(zhì)特異性結(jié)合的一簇DNA或RNA片段。這種寡核苷酸序列形成的高級結(jié)構(gòu)具有 能識別與之相對應(yīng)的任何類型的蛋白和低分子的靶物質(zhì)，并與靶物質(zhì)有高親和力而形成 靶物質(zhì)一適配子的復(fù)合物。與抗體相比，核酸適配體具有易合成、易修飾、易固定、可 反復(fù)使用和長期保存的優(yōu)點，并且核酸適配體作為識別分子在蛋白質(zhì)研究、藥物檢測、 醫(yī)學診斷和食品安全等方面得到了廣泛應(yīng)用。
另一方面，近年來納米材料與分子生物技術(shù)兩者之間的關(guān)系越米越緊密，新型 納米材料在分析檢測中的發(fā)展前景也越來越廣闊。其中上傳換納米熒光納米材料和磁性 納米材料具備獨特的功能被所人們關(guān)注。
在稀土摻雜的無機納米材料中一類特殊的發(fā)光材料，它能夠通過多光子機制把 長波輻射(近紅外光)轉(zhuǎn)換成短波輻射，發(fā)射出比激發(fā)光波長短的熒光(紫外可見光)， 即上轉(zhuǎn)換熒光。它是一種反Stokes發(fā)光，已成為把紅外光轉(zhuǎn)換成可見光的有效方法。上 轉(zhuǎn)換材料具有如下諸多優(yōu)點光化學穩(wěn)定，檢測背景低，穿透性強，且可以通過選擇不同的基質(zhì)材料和摻雜離子來調(diào)節(jié)上轉(zhuǎn)換發(fā)光，不同稀土離子摻雜的納米粒子發(fā)射不同的 上轉(zhuǎn)換熒光，真正實現(xiàn)單激發(fā)多發(fā)射，從而有利于生物體系中多組分同時檢測。鑒于上 述優(yōu)點，上轉(zhuǎn)換納米材料已成為一種優(yōu)秀的生物標記材料。同時在實際生物樣品的檢測 中，由于被測樣品很少，標記與檢測中的分離步驟復(fù)雜，如何有效地進行標記與未標記 樣品的分離以及對痕量樣品的富集，將直接影響檢測的靈敏度和準確性。由于磁性納米 顆粒性能穩(wěn)定，較易制備，且與多種分子復(fù)合可使粒子表面功能化。利用磁性納米材料 和上轉(zhuǎn)換納米擦了可快速有效地將目標物質(zhì)分離與富集，具有特異性高、分離快、重現(xiàn) 性好等優(yōu)點，可有效提高分析檢測的靈敏度和準確性。
本發(fā)明首先合成得到了表面生物功能化的磁性納米材料和上轉(zhuǎn)換納米材料，再 通過磁性納米材料結(jié)合的核酸適配體和上轉(zhuǎn)換納米材料結(jié)合的核酸適配體互補鏈之間的 DNA雜交將兩者組裝構(gòu)成復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，以980nm激光激發(fā)誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換熒光為檢測信 號，通過對不同濃度赭曲霉毒素A標準品的檢測，建立標準曲線，達到對含赭曲霉毒素 A樣品進行定量檢測的目的。該發(fā)明可以用于小麥、谷物，飼料及其制品等樣品中赭曲 霉毒素A含量的檢測。發(fā)明內(nèi)容
一種適配體功能化磁性納米材料磁分離一上轉(zhuǎn)換熒光納米材料標記檢測赭曲霉 毒素A的方法分別制備得到NaYF4:Yb，&上轉(zhuǎn)換熒光納米材料和氨基化的R3O4磁性 納米球，對納米粒子進行表面功能化修飾并與親和素(Avidta)偶聯(lián)，隨后氨基化的Fe3O4 磁性納米球通過親和素(AvicHn)與生物素(Biotin)之間的作用與生物素(Biotin)修飾的 適配體DNA特異性結(jié)合，用作磁分離試劑，而同樣原理NaYF4:Yb，&上轉(zhuǎn)換熒光納米 材料與適配體互補核酸單鏈結(jié)合，構(gòu)成標記探針。將兩者經(jīng)過一段時間的孵育，通過 DNA互補雜交使得兩者組裝成復(fù)合納米材料。利用外界磁場對納米材料進行分離并且利 用980nm激光激發(fā)，記錄此時發(fā)光信號為最大值，當加入目標分析物赭曲霉毒素A時， 適配體DNA的空間構(gòu)象發(fā)生變化，與赭曲霉毒素A發(fā)生特異性結(jié)合，使得適配體DNA 與互補單鏈DNA解鏈，從而導(dǎo)致上轉(zhuǎn)換熒光納米材料與磁性納米球分離，此時再富集后 檢測，得到發(fā)光信號減小。在一定范圍內(nèi)赭曲霉毒素A的含量與發(fā)光信號減小的數(shù)值相 關(guān)，基于此對赭曲霉毒素A標準品進行檢測，建立標準曲線，以達到對實際樣品中赭曲 霉毒素A進行定量檢測的目的；步驟為
(1)通過水熱一溶劑熱技術(shù)，制備NaYF4:Yb，上轉(zhuǎn)換納米顆粒，并對其做表 面修飾。稱取 0.18gY203 (28% ), 0.788g Yb2O3 (70% )和 0.022g Er2O3 (2% )混合物加入 硝酸中加熱溶解并揮發(fā)掉多余硝酸，得到稀土元素的硝酸鹽粉末，將其溶解在SmL去離 子水中，再加入二水合乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA) 1.0635g并調(diào)節(jié)pH至弱堿性，形成澄 清透明的EDTA-Ln溶液。取25mL乙二醇，加入3mL HF和0.4g十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)，攪拌下加入SmL上述EDTA-Ln溶液，得到白色乳狀膠體。最后再加入5.5mL 濃硝酸，攪拌均勻后，轉(zhuǎn)移到50mL帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，195°C反應(yīng)24h。反 應(yīng)結(jié)束后，讓其在空氣中自然冷卻至室溫，棄上層液體，釜底的固體用熱水沖洗到燒杯 中，超聲10分鐘，然后靜置數(shù)分鐘，待固體沉淀至底部后，將上層液體倒掉，再加熱水 超聲，重復(fù)3次。然后加乙醇超聲分散，最后離心所得固體置于70°C烘箱干燥10h，固體粉末儲存?zhèn)溆谩?br> (2)利用改進的Steber法對上轉(zhuǎn)換納米粒子進行表面氨基化修飾。將處理后的上 轉(zhuǎn)換熒光納米材料20mg加入盛有60mL異丙醇的250mL錐形瓶中，超聲40min達到完全 分散。在快速磁力攪拌下依次加入約20mL的蒸餾水、2.5mL的25%的氨水，封口。在 :35°C下，磁力攪拌1011^11后加入逐滴加入2011^異丙醇和5(^]^正硅酸乙酯的混合溶液。 反應(yīng)3h后，再逐滴加入30mL異丙醇和200 μ L的3-氨丙基三乙氧基硅烷的混合溶液，繼 續(xù)反應(yīng)Ih后停止攪拌室溫下陳化Zh。最后將產(chǎn)物離心分離，水洗多次，60°C烘干12h， 得到表面有氨基修飾的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料。
C3)采用一步法制備表面氨基化的磁性納米顆粒。向30mL乙二醇中，加入6. 1，6-己二胺、2.0g無水醋酸鈉(CH3COONa)和l.Og六水合三氯化鐵(FeCl36H20)。然 后在加熱(50°C )條件下攪拌，形成較均勻的膠體溶液。將所得溶液轉(zhuǎn)移到50mL帶聚四 氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，在198°C件下反應(yīng)《1。取出反應(yīng)釜后，在室溫下自然冷卻，棄 釜內(nèi)上層液體，下層黑色固體用去離子水沖洗至燒杯中，然后利用磁分離收集。超聲條 件下，再用水分散，然后磁分離收集，按上面方法再用乙醇洗滌2次，所得黑色固體在 50°C條件下干燥5-10h。
(4)利用戊二醛法將氨基化的納米材料與親和素(Avidin)偶聯(lián)。稱取IOmg納米 材料溶解在5mL10mM PBS中超聲分散15η ι，加入1.25mL 25%的戊二醛溶液。將混合 溶液在室溫下緩慢搖晃Zh，反應(yīng)結(jié)束后上轉(zhuǎn)換納米材料通過離心分離，磁性納米材料經(jīng) 過磁分離，得到的固體粉末用IOmMPBS洗三次。將粉末再用IOmM PBS溶解，超聲分 散開，加入1.0mg/ml親和素(Avidin)。此溶液在室溫下緩慢搖晃12h，反應(yīng)結(jié)束后清洗 多次，棄上清。所得沉淀物在37°C條件下干燥12h。
(5)利用通過親和素(Avidin)與生物素(Biotin)之間的特異性結(jié)合將表面修飾有 親和素(AvicHn)的磁性納米球與生物素(Biotin)修飾的赭曲霉毒素A適配體DNA單鏈 連接，同理將表面修飾有親和素(AvicHn)的上材料與轉(zhuǎn)換納米生物素(Biotin)修飾互補 DNA單鏈連接。具體方法為取2mg納米材料溶孵于11110011^ 33中超聲分散51^11， 隨后加入50nM適配體DNA單鏈(對于上轉(zhuǎn)換材料加入互補的DNA單鏈)。37°C孵育 過夜，分別用磁分離和離心分離，棄上清，并且用PBS緩沖液清洗多次以保證去除未與 納米材料連接的DNA單鏈，最后將沉淀重懸于ImL PBS緩沖液中，4°C保存。
(6)通過赭曲霉毒素A適配體DNA與其互補DNA單鏈的雜交，將磁性納米球與 上轉(zhuǎn)換納米材料連接起來構(gòu)成一個納米材料復(fù)合物。具體方法為取400 μ L上轉(zhuǎn)換材料 標記的互補DNA單鏈溶液與100 μ L適配體功能化磁性納米球混合，在雜交緩沖液(0.1Μ NaCL IOmMPBS)體系中37°C反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后磁分離棄上清，反復(fù)清洗以保證游 離的納米材料完全除去。
(7)對赭曲霉毒素A標準品進行檢測，建立標準曲線將組裝好的納米材料復(fù) 合物溶解在 pH 7.0 的解離緩沖液中(IOmM HEPES, 120mM NaCl, 5mM KCl, 20mM MgCl2, 20mM CaCl2),配制不同濃度的赭曲霉毒素A標準品加入解離體系中，孵育 30-40min后再經(jīng)過磁分離棄上清，清洗三遍以保證解離脫落的上轉(zhuǎn)換納米材料不在磁性 納米球表面附著，從而保證檢測的靈敏度和準確性。在980nm激光激發(fā)下得到660nm 處的上轉(zhuǎn)換熒光信號，空白組檢測得到的熒光信號(Itl)最大，隨著赭曲霉毒素A濃度的增加熒光信號⑴逐步減小。根據(jù)熒光差值(ΔΙ = I0-I)與對應(yīng)的赭曲霉毒素A標準品 濃度建立標準曲線。實驗結(jié)果分別在IX 1(Γ13-1Χ KT11gAnL ； 1 X KT11-I X K^g/mL ； 1 X KTltl-I X KT9gAnL三段區(qū)間內(nèi)得到良好線性關(guān)系。
(8)對赭曲霉毒素A樣品進行檢測對樣品做簡單的處理，隨后直接加入到上述 解離體系中孵育30-40η ι后再經(jīng)過磁分離棄上清，清洗三遍。根據(jù)在980nm激光激發(fā) 下得到660nm處的上轉(zhuǎn)換熒光信號，從標準曲線中求得對應(yīng)的赭曲霉毒素A的濃度。
有益效果
(1)本發(fā)明利用適配體對被檢物質(zhì)實現(xiàn)特異性識別捕獲，有效提高了檢測的穩(wěn)定 性和準確性。
(2)本發(fā)明利用980nm激光誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換熒光為檢測信號，無背景光及自發(fā)熒光干 擾，大大提高了檢測靈敏度。
(3)本發(fā)明利用磁性納米球?qū)δ繕藰悠愤M行分離富集濃縮，可以有效的提高檢測 靈敏度、縮短檢測周期，而且操作簡單。


圖1 基于適配體功能化磁性納米材料磁分離一上轉(zhuǎn)換熒光納米材料標記檢測 赭曲霉毒素A的實驗原理圖。
圖2: NaYF4:Yb, 上轉(zhuǎn)換熒光納米材料電鏡圖(a) ； NaYF4:Yb, Er@Si02上轉(zhuǎn)換熒光納米材料電鏡圖(b)。
圖3 氨基化磁性納米材料電鏡圖。
圖4:赭曲霉毒素A檢測標準曲線圖，濃度范圍在IXKr13-IXKr11gAnL內(nèi) (a)；濃度范圍在 lXlO-n-lXlO—g/mL 內(nèi)(b)；濃度范圍在 1 X 10_1(1-1 X 10_9g/mL 內(nèi)(C)。
圖5 本發(fā)明和ELISA方法檢測同樣的實際樣品得到的相關(guān)性曲線。
具體實施方式
實施例1 玉米實際樣品中赭曲霉毒素A檢測標準曲線的建立及檢測
樣品預(yù)處理小麥高速粉碎過篩，稱取20g于IOOmL燒瓶中，加入相NaCl， 80%乙醇水溶液，充分混勻后置于均質(zhì)器中高速攪拌提取2η ι，靜止片刻，過濾，取 IOmL濾液置于50mL燒瓶中，再次在均質(zhì)器中高速攪拌提取2η ι，靜止后用超細玻璃纖 維過濾紙過濾，直至濾液澄清，收集濾液備用。
從本地六家農(nóng)貿(mào)市場購買16種不同類別的小麥，利用本發(fā)明方法和國標方法分 別測定其中赭曲霉毒素A的含量，結(jié)果見表一，將得到的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性比較，結(jié)果P < 0.0001,兩者無顯著差異。說明該發(fā)明方法快速可靠，靈敏度高，穩(wěn)定性好，適合用 于玉米實際樣品中赭曲霉毒素A的檢測。
表一小麥實際樣品檢測，本發(fā)明方法與Elisa方法對比
權(quán)利要求
1.一種適配體功能化磁性納米材料磁分離一上轉(zhuǎn)換熒光納米材料標記檢測赭曲霉 毒素A的方法，其特征在于經(jīng)過組裝得到了赭曲霉毒素A適配體功能化磁性納米材料 和表面修飾了適配體互補DNA單鏈的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料，再通過DNA互補雜交將兩 者組裝復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，以980nm激光誘導(dǎo)上轉(zhuǎn)換熒光為檢測信號。當加入目標分析物赭 曲霉毒素A時，適配體DNA的空間構(gòu)象發(fā)生變化與赭曲霉毒素A發(fā)生特異性結(jié)合，使得 適配體DNA與適配體互補單鏈DNA解鏈，從而導(dǎo)致部分上轉(zhuǎn)換熒光納米材料與磁性納 米球分離，使得磁性納米球表面組裝的上轉(zhuǎn)換熒光納米材料的發(fā)光信號減小，基于此對 赭曲霉毒素A標準品進行檢測，建立標準曲線，以達到對含赭曲霉毒素A樣品進行定量 檢測的目的。
2.如權(quán)利要求1所述的一種適配體功能化磁性納米材料磁分離——上轉(zhuǎn)換熒光納米材 料標記檢測赭曲霉毒素A的方法，其特征在于利用氨基化的Fe3O4磁性納米球通過親和 素(Avidin)與生物素(Biotin)之間的作用與生物素(Biotin)修飾的適配體DNA特異性結(jié) 合，用作磁分離試劑。
3.如權(quán)利要求1所述的一種適配體功能化磁性納米材料磁分離——上轉(zhuǎn)換熒光納米材 料標記檢測赭曲霉毒素A的方法，其特征在于親和素(Avidin)修飾的上轉(zhuǎn)換熒光納米材 料與生物素(Biotin)修飾的核酸適配體互補核酸單鏈結(jié)合，構(gòu)成核酸標記探針。
全文摘要
一種適配體功能化磁性納米材料磁分離上轉(zhuǎn)換熒光納米材料標記檢測赭曲霉毒素A的方法，用于小麥、谷物，飼料及其制品等中赭曲霉毒素A含量的檢測。本發(fā)明充分利用赭曲霉毒素特異核酸適配體功能化磁性納米材料磁分離樣品富集效應(yīng)，讓大宗樣本能很快濃縮有效提高樣本濃度(上千倍)，可以大大縮短檢測周期并提高檢測靈敏度；同時結(jié)合上轉(zhuǎn)換熒光納米材料激光誘導(dǎo)熒光的高靈敏度和有效避免樣本生物背景熒光干擾的特點，構(gòu)建一種從樣品處理到分析檢測都非?？焖俚聂髑苟舅谹新型分析方法。
文檔編號G01N21/64GK102023147SQ20101029578
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者吳世嘉, 段諾, 王周平 申請人:江南大學