專利名稱：一種檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝 集方法。
背景技術(shù)：
特定血清型流感病毒感染、感染后恢復(fù)、隱性感染、以及疫苗接種的人或動 物，在其體液(如血清、支氣管灌洗液、血漿、組織液等)中會出現(xiàn)流感病毒血凝素抗 體，通過檢測特定血清型流感病毒的抗體，可以判斷、診斷或確診該人或該動物是否感 染(包括早期感染、隱性感染或感染后恢復(fù)等)該特定血清型的流感病毒、或接種過流感 病毒疫苗、或評價其對特定血清型流感病毒的抵抗力等。
目前檢測待檢樣品中是否存在某一特定血清型的流感病毒抗體的方法，主要有 血凝抑制實驗(HAI)和中和實驗，即將某一特定血清型的流感病毒先與待檢樣品混合， 然后加入紅細胞或敏感細胞中，判斷待檢樣品是否能夠抑制該病毒的血凝反應(yīng)或細胞病 變效應(yīng)來進行判定，其缺點是需要使用具有感染性的病毒，安全性存在隱患。在涉及病 毒的實驗中，根據(jù)國家有關(guān)法規(guī)(國務(wù)院《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、衛(wèi) 生部《人間傳染的病原微生物名錄》、《人間傳染的高致病性病原微生物實驗室和實驗 活動生物安全審批管理辦法》)及WHO的規(guī)定與建議，包括人H2N2以及部分禽流感病 毒的操作要求在BSL-III (P3)實驗室進行，因此，上述方法的開展對實驗室條件要求很 高，不適用于現(xiàn)場檢測和規(guī)模檢測。文獻也有報道，利用表達流感病毒HA的假病毒顆 粒來代替具有感染性的流感病毒進行HAI實驗，但技術(shù)過于復(fù)雜。
上述方法的缺點還在于只能檢測流感病毒HA的抗體。流感病毒表面主要存在 著2種抗原性較強的糖蛋白刺突，即血凝素NA和神經(jīng)氨酸酶NA，當(dāng)流感病毒感染或隱 性感染或接種疫苗后，人或動物的機體會針對HA和NA都產(chǎn)生抗體，正是如此，流感病 毒中的甲型流感病毒根據(jù)HA的抗原性分為Hl H16等16個亞型，NA的抗原性分為 Nl N9等9個亞型，在甲型流感病毒中根據(jù)HA和NA亞型的不同組合方式形成了眾多 亞型，如H5N1 (即H5亞型與Nl亞型組合)。因此，如檢測流感病毒抗體，除需檢測 HA血清型外，還需要對NA血清型進行檢測。而目前對NA血清型抗體的檢測則需要另 行通過神經(jīng)氨酸酶酶活抑制的方法進行檢測。
除經(jīng)典的HAI和中和實驗外，也有用ELISA方法和乳膠凝集實驗方法來進行檢 測的報道。ELISA和乳膠凝集的優(yōu)勢在于可以檢測HA和NA的抗體。其中，ELISA方 法是利用重組表達和純化的流感病毒HA和/或NA來檢測相應(yīng)的抗體，這需要獲保持抗 原特異性的重組蛋白的表達與純化，且由于流感病毒有眾多亞型，即使同種亞型的血清 交叉反應(yīng)強度不一，對不同血清型的HA和NA抗原都進行重組蛋白的表達與純化，其工 作量大、工藝要求高、批間穩(wěn)定性差。乳膠凝集方法相對于現(xiàn)有的其它方法(HAI、中 和實驗以及ELISA方法)而言，反應(yīng)時間短、適合現(xiàn)場檢測，但仍存在一些不足。乳膠 凝集實驗方法是將重組表達和純化的流感病毒HA和/或NA蛋白偶聯(lián)在惰性乳膠顆粒表面，利用凝集反應(yīng)進行檢測流感病毒相應(yīng)的抗體，這同樣需要重組表達和純化的流感病 毒HA和NA，并需要獲得保持抗原特異性的重組蛋白的表達與純化，如需要檢測不同血 清型的流感病毒HA和NA抗體，就需要對不同毒株的HA和NA進行重組表達和純化， 與ELISA方法一樣，存在工作量大、工藝要求高、批間穩(wěn)定性差等問題。
由于檢測流感病毒抗體對人或該動物是否感染(包括早期感染、隱性感染或感 染后恢復(fù)等)該特定血清型的流感病毒、或接種過流感病毒疫苗、或評價其對特定血清 型流感病毒的抵抗力等有重要意義，而目前的HAI、中和實驗、ELISA以及乳膠凝集 等檢測手段，或需要使用具有感染性的病毒，或需要特定的實驗條件和設(shè)備，或工藝復(fù) 雜，或檢測耗時長等缺點，因此，一種簡便、快速、工藝相對簡單易控的，可以同時檢 測流感病毒HA和NA抗體檢測方法具有廣泛的應(yīng)用價值。
使用重組表達流感病毒血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的真核細胞為凝集反應(yīng) 基質(zhì)，利用凝集反應(yīng)，檢測待檢樣品中是否存在相應(yīng)流感病毒的抗體，這一方法相對于 上述傳統(tǒng)方法而言，可以更安全更快速的檢測流感病毒抗體。但由于該方法存在通量受 限、細胞消耗量大的缺點，因此，需要一種適合高通量檢測、細胞用量更少、簡便、快 速、工藝相對簡單易控、可以同時檢測流感病毒HA和NA抗體檢測方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中用于檢測流感病毒抗體中存在的細胞消耗量 大、工藝復(fù)雜、檢測耗時長、通量受限等缺點，提供一種簡便、快速、細胞用量少、適 合高通量檢測的用于檢測流感病毒抗體的方法。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)
本發(fā)明是將流感病毒血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因克隆后轉(zhuǎn)染真核細胞，使真 核細胞表面重組表達流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，對重組表達細胞進行熒光標(biāo) 記，該細胞表面的重組表達的血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白與待測樣品的流感病毒血凝素抗 體和神經(jīng)氨酸酶抗體結(jié)合，發(fā)生凝集反應(yīng)，熒光檢測分析，根據(jù)熒光面積是否增加來判 定待測樣品中是否存在流感病毒抗體。
作為一種優(yōu)選方案，所述熒光標(biāo)記為熒光素、熒光蛋白或其它能夠發(fā)出熒光的 物質(zhì)；所述熒光檢測分析所用的設(shè)備為熒光顯微鏡、熒光光度計或多功能微孔板檢測 儀。
利用RT-PCR克隆特定血清型流感病毒的HA和NA基因或其片段，構(gòu)建真核表 達載體，轉(zhuǎn)染真核細胞，細胞表面會存在重組表達的HA和NA，經(jīng)醛化固定后，該細胞 即成為表面含有HA和NA抗原的致敏顆粒。該細胞在轉(zhuǎn)染時可同時轉(zhuǎn)染編碼熒光蛋白 (綠色熒光蛋白、增強型綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、青色熒光蛋白 等在激發(fā)光下可發(fā)射熒光的蛋白或多肽或突變體)的核酸，則該細胞即可被熒光標(biāo)記。 熒光標(biāo)記也可以使用熒光物質(zhì)，如CFSE、SYTO> Cy3、Cy5、FITC等，對細胞進行標(biāo) 記。熒光標(biāo)記后的細胞與待檢樣品在微量凝集板中混合后，如待檢樣品中含有流感病毒 的抗體，即會在數(shù)分鐘發(fā)生凝集反應(yīng)，在熒光顯微鏡下可以清晰觀察和判斷出是否出現(xiàn) 凝集。同時也可經(jīng)拍照成像后用圖像分析軟件，如Image Pro Plus等對各孔熒光面積進行 分析，利用細胞出現(xiàn)凝集后不易沉淀因而熒光免疫較大而判斷是否出現(xiàn)凝集。
具體地，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
將重組表達流感病毒血凝素(HA)的真核細胞，或重組表達神經(jīng)氨酸酶(NA)的 真核細胞，或同時表達有HA和NA的真核細胞，或單獨重組表達HA和NA的真核細胞 混合物，用熒光物質(zhì)進行標(biāo)記，熒光標(biāo)記后的細胞與待檢樣品在微量凝集板中混合后， 如待檢樣品中含有流感病毒的抗體，即會在數(shù)分鐘發(fā)生凝集反應(yīng)，在熒光顯微鏡下可以 清晰觀察和判斷出是否出現(xiàn)凝集。同時也可經(jīng)拍照成像后用圖像分析軟件，如Image Pro Plus等對各孔熒光面積進行分析，利用細胞出現(xiàn)凝集后不易沉淀因而熒光免疫較大而判 斷是否出現(xiàn)凝集。如出現(xiàn)凝集，表明檢測待檢樣品中是否存在相應(yīng)流感病毒的抗體。
作為一種優(yōu)選方案，所述重組表達為瞬時表達或穩(wěn)定表達。
流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒，其中甲型流感病 毒的HA可以分為16個亞型、NA可以分為9個亞型，同時，由于流感病毒HA和NA的突 變和進化，即使是同一亞型的HA和NA，其交叉反應(yīng)性的強弱不一。因此，檢測某一特 定血清型流感病毒抗體時，使用本發(fā)明的方法，將重組表達該特定血清型毒株的HA的真 核細胞與待檢樣品進行凝集實驗即可。上述的流感病毒HA，是指甲型流感病毒的HI、 H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、HlU H12、H13、H14、H15、H16 亞 型，以及乙型流感病毒、丙型流感病毒的血凝素，可以根據(jù)檢測目的的需要使用某一特 定血清型的HA或其部分。上述的流感病毒NA，是指甲型流感病毒的Ni、N2、N3、 N4、N5、N6、N7、N8、N9亞型以及乙型流感病毒、丙型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶。上 述的重組表達流感病毒HA和NA可以是上述不同HA和NA的任一組合方式。
作為一種優(yōu)選方案，所述流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體為tgG、IgM, IgA、IgE、IgD中的一種或幾種的混合物。
如是進行較廣泛血清型的流感病毒抗體檢測，則可以根據(jù)所檢測的目的血清型 毒株的HA和NA進行抗原性分析，選用抗原性保守或抗原交叉性強的HA和NA蛋白的 一部分進行重組表達真核細胞的構(gòu)建，利用凝集反應(yīng)對較廣泛血清型的流感病毒抗體檢 測。上述的流感病毒HA和NA，可以是某一流感病毒毒株HA和NA或其中一部分， 也可以是不同流感病毒毒株的HA和NA或其中一部分或不同HA和NA的拼接或混合， 也可以是對流感病毒HA和NA進行了突變和修飾，也可以是人工合成的天然不存在的序 列，但其核心是重組表達產(chǎn)物具有流感病毒HA和NA的抗原性。
上述的重組表達流感病毒HA和NA的真核細胞，是指將編碼有流感病毒HA和 NA的基因片段導(dǎo)入真核細胞，在真核細胞表面重組表達流感病毒的HA和NA。真核細 胞可以是酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞，以及其它的真核細胞，重組表達的流感病毒 HA和NA位于細胞膜或細胞壁表面。其中，真核細胞優(yōu)選哺乳動物細胞和昆蟲細胞， 其重組表達的流感病毒血凝素可以有更為接近病毒感染人或動物所獲得翻譯后修飾、空 間構(gòu)型和抗原性，其與流感病毒相應(yīng)抗體的反應(yīng)特異性更佳。進一步，優(yōu)選哺乳動物細 胞重組表達流感病毒HA和NA。重組表達可以是瞬時表達，也可以是穩(wěn)定表達。編碼 有流感病毒HA和NA的基因片段可以是DNA，也可以是RNA，可以是單純的含有啟動 子和編碼序列的片段，也可以是質(zhì)粒，也可以是病毒載體，其可以僅編碼流感病毒HA和 NA,也可以同時或獨立混合編碼其它蛋白或多肽或肽段，其目的是將編碼流感病毒HA 和NA的基因片段在真核細胞中獲得重組表達。導(dǎo)入真核細胞的方式可以使用電擊、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒介導(dǎo)等，目的是將編碼流感病毒HA和NA的基因片段進入真核細胞以得 到重組表達。上述的重組表達HA和NA的真核細胞，其核心在于獲得在細胞表面表達 有流感病毒HA和NA的真核細胞，且該細胞被熒光物質(zhì)進行了熒光標(biāo)記，其目的是利用 熒光，可以高通量地以較少的細胞量，即可通過凝集實驗檢測流感病毒抗體。在本發(fā)明 的實施方案中，公布了熒光標(biāo)記的重組表達流感病毒HA和NA的真核細胞的方法。
本發(fā)明檢測方法所用的真核細胞為酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或其它真核 細胞，重組表達的流感病毒血凝素位于細胞膜或細胞壁表面。使用真核細胞進行重組表 達的目的是活的具有翻譯后修飾(如糖基化等)的流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白或其 部分肽段，以更好的與流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體或兩者之一發(fā)生識別、結(jié) 合和凝集，獲得更好的親和性和特異性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法不涉及具有感染性的病毒顆 粒；相比ELISA、HAI和中和實驗所需的數(shù)小時至數(shù)天，熒光標(biāo)記的重組表達HA和NA 的細胞凝集反應(yīng)小于60分鐘，反應(yīng)時間快速；利用通用引物和載體可對不同血清型的 HA和NA基因進行克隆與轉(zhuǎn)染表達，即可得到不同HA和NA抗原的致敏細胞顆粒，可以 更加廣泛地對不同血清型流感病毒抗體進行檢測；相對于非熒光標(biāo)記的重組表達HA和 NA的細胞凝集反應(yīng)方法，本發(fā)明適合高通量檢測、細胞用量更少(僅需未用熒光標(biāo)記細 胞的 1/100 到 1/10)。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。
實施例1綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組表達流感病毒HA和NA的真核細胞的方法
本實施例以一株H5 亞型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1) 為例，進行重組表達流感病毒血凝素HA真核表達細胞的制備。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在廣東省的雞中分離得到的一株H5N1亞型流 感病毒，其HA和NA的基因序列可在公共數(shù)據(jù)庫GenBank上獲得，HA的序列號為 EU874899.2，NA的序列號為EU874900.2。將該株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit 提取病毒 RNA，用 Uni-12 引物(5，-AgCAAAAgCAgg-3，)和 SuperScript III 或 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，得到病毒cDNA。根據(jù)該毒株HA的基因序列，設(shè)計一對用于HA 全長基因克隆的引物，其引物序列具體如下上游引物H5HA-F，序列為5’ -GCAAAG CTTACCATGGAGAAAATACTTCTTC-3‘，從 5，端依次為 3 個保護性堿基、HindIII 酶 切位點、KOZAK序列、起始密碼子和配對區(qū)；下游引物H5HA-R，序列為5’ -CTCGG ATCCTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG-3‘，從5’ 端依次為 3個保護性堿基、BamH I酶切位點、終止密碼子和配對區(qū)。利用這對引物，用高保真Taq酶對病毒cDNA進行 PCR擴增，擴增HA片段。
根據(jù)該毒株NA的基因序列，設(shè)計一對用于NA全長基因克隆的引物，其引物序 列具體如下上游引物 NlNA-F 序列為 5，-GCAAAGCTTACCATGAATCCAAATCAG AAG-3，，從5’端依次為3個保護性堿基、HindIII酶切位點、KOZAK序列、起始密碼子和配對區(qū)；下游引物N1NA-R，序列為5，-CTCGGATCCCTACTTGTCAATGGTG AATG-3’，從5’端依次為3個保護性堿基、BamH I酶切位點、終止密碼子和配對區(qū)。 利用這對引物，用高保真Taq酶對病毒cDNA進行PCR擴增，擴增NA片段。
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后HA基因片段后，與表達載體pcDNA3分別進 行使用Hind III和BamH I雙酶切，再次電泳回收后利用T4DNA連接酶將酶切回收后的 HA片段與載體進行連接。NA片段與綠色熒光表達載體使用Hind III和BamH I雙酶切 后，電泳回收進行連接，該載體編碼的綠色熒光蛋白與多克隆位點間有一個核糖體進入 位點序列(IRES)，NA基因片段插入載體的啟動子后、IRES前，當(dāng)啟動子啟動轉(zhuǎn)錄時可 以得到一個編碼有NA、IRES和綠色熒光蛋白的mRNA，最終翻譯得到單獨的NA和綠色 熒光蛋白。
連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，涂布Amp抗性平板。菌落 經(jīng)PCR后，提取質(zhì)粒酶切鑒定和DNA測序，獲得含有HA基因片段的真核表達質(zhì)粒即 pcDNA-H5HA,獲得含有HA基因片段的真核表達質(zhì)粒即pIRES-EGFP_NlNA。含有 pcDNA-H5HA質(zhì)粒和pIRES-EGFP_NlNA質(zhì)粒的細菌，分別經(jīng)含有50 μ g/ml的氨芐 青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)過夜后，用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取pcDNA-H5HA質(zhì)粒和 pIRES-EGFP-ΝΙΝΑ質(zhì)粒，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染細胞和重組表達實驗。
根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑盒說明，將 2.5 μ g pcDNA_H5HA 質(zhì)粒、 0.5 μ gpIRES-EGFP-ΝΙΝΑ 質(zhì)粒和 10 μ 1 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染一個:35mm直徑培養(yǎng)皿含有生長密度約為80% -90%融合率的人胚腎HEK-239細胞，轉(zhuǎn)染后《ι去除 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，更換新鮮的完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)。
轉(zhuǎn)染后，HEK-239細胞即可瞬時重組表達HA、NA和綠色熒光蛋白，即得到瞬 時綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組表達流感病毒HA和NA的細胞。
為進一步優(yōu)化，可以篩選獲得穩(wěn)定綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組表達HA和NA的細 胞在轉(zhuǎn)染7Zh后將轉(zhuǎn)染細胞吹打分散，將細胞懸液的1/20接種一個新的35mm直徑培 養(yǎng)皿中，補充完全培養(yǎng)基至3ml，經(jīng)過夜貼壁后，補加G418至濃度為600 μ g/ml。此后 每3至5天的更換一次含有600 μ g/ml G418的完全培養(yǎng)基，約3周后可見篩選出現(xiàn)的抗性 細胞集落。將抗性細胞集落經(jīng)胰酶消化后，按10-20個細胞/ml接種96孔板培養(yǎng)，加入 含有600 μ g/ml G418的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至長至單層后，進行傳代，獲得用于檢測的備份 培養(yǎng)96孔板。將檢測用的96孔板的細胞用4%多聚甲醛室溫固定5分鐘，經(jīng)PBS漂洗 后，加入Cy3熒光標(biāo)記的抗H5亞型HA的抗體進行免疫熒光檢測，同時觀察綠色熒光， 選擇紅色和綠色熒光陽性信號強、紅色和綠色熒光陽性細胞比例高的孔，對細胞繼續(xù)重 復(fù)的克隆化和免疫熒光，至陽性細胞比例接近100%，即可得到穩(wěn)定綠色熒光蛋白標(biāo)記重 組表達該毒株HA和NA的細胞。
將綠色熒光蛋白標(biāo)記瞬時或穩(wěn)定重組表達該毒株HA和NA的細胞，經(jīng)貼壁或懸 浮培養(yǎng)后，用含有2% BSA的PBS將細胞吹打分散，將細胞懸液進行離心，去除上清后 用含有2% BSA的PBS按IO5個/ml細胞密度進行重懸。去除上清，用等體積的PBS重 懸、離心進行洗滌2次，再次加入等體積的PBS，加入等體積的10%的冷甲醛，于4°C固 定2小時。經(jīng)離心、PBS重懸的方式進行3次洗滌。最后將細胞沉淀，按IO5個/ml的 濃度重懸于含有0.2%尼泊爾金酯、2%BSA、20%甘油、0.5%肝素的PBS緩沖液中，使其能夠穩(wěn)定地長時間保存，即得到了處理后的綠色熒光蛋白標(biāo)記重組表達HA和NA抗原 的真核細胞。
將該綠色熒光蛋白標(biāo)記重組表達HA和NA抗原的真核細胞的細胞懸液25 μ 1與 待檢樣品25 μ 1，在微量凝集板中混合，室溫放置60分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察。如 未發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細胞會沉淀在凝集板底部，鏡下可見熒光細胞聚集在中 央；如發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細胞以絮狀懸浮在液體中，鏡下可見熒光細胞在視 野中分散，細胞與細胞間發(fā)生聚團。利用這一特征，也可以用熒光顯微鏡進行成像，利 用圖像分析軟件，通過設(shè)立熒光發(fā)光面積來實現(xiàn)軟件判讀凝集與否。待檢樣品發(fā)生凝集 時，說明待檢樣品中含有與該毒株HA和/或NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和/或NA 抗體。
實施例2熒光素CFSE (羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯)標(biāo)記的重組表達流 感病毒HA和NA的真核細胞的方法
本實施例以一株Η5 亞型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1) 為例，進行重組表達流感病毒血凝素HA真核表達細胞的制備。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在廣東省的雞中分離得到的一株H5N1亞型流 感病毒，其HA和NA的基因序列可在公共數(shù)據(jù)庫GenBank上獲得，HA的序列號為 EU874899.2，NA的序列號為EU874900.2。將該株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit 提取病毒 RNA，用 Uni-12 引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3，)禾Π SuperScript III 或 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，得到病毒cDNA。根據(jù)該毒株HA的基因序列，設(shè)計一對 用于HA全長基因克隆的引物，其引物序列具體如下上游引物H5HA-F，序列為5’ -G CAAAGCTTACCATGGAGAAAATAGTACTTCTTC-3‘，從 5，端依次為 3 個保護性堿 基、HindIII酶切位點、KOZAK序列、起始密碼子和配對區(qū)；下游引物H5HA-R，序列 為 5，-CTCGGATCCTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG-3，，從 5，端依次為 3 個保 護性堿基、BamH I酶切位點、終止密碼子和配對區(qū)。利用這對引物，用高保真Taq酶對 病毒cDNA進行PCR擴增，擴增HA片段。
根據(jù)該毒株NA的基因序列，設(shè)計一對用于NA全長基因克隆的引物，其引物序 列具體如下上游引物 NlNA-F 序列為 5，-GCAAAGCTTACCATGAATCCAAATCAG AAG-3，，從5’端依次為3個保護性堿基、HindIII酶切位點、KOZAK序列、起始密 碼子和配對區(qū)；下游引物N1NA-R，序列為5，-CTCGGATCCCTACTTGTCAATGGTG AATG-3’，從5’端依次為3個保護性堿基、BamH I酶切位點、終止密碼子和配對區(qū)。 利用這對引物，用高保真Taq酶對病毒cDNA進行PCR擴增，擴增NA片段。
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后HA和NA基因片段后，與表達載體pcDNA3 分別進行使用Hind III和BamH I雙酶切，再次電泳回收后利用T4DNA連接酶將酶切回 收后的HA片段與載體進行連接、NA片段與載體進行連接，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感 受態(tài)細胞，涂布Amp抗性平板。菌落經(jīng)PCR后，提取質(zhì)粒酶切鑒定和DNA測序，獲 得含有HA基因片段的真核表達質(zhì)粒即pcDNA-H5HA，獲得含有HA基因片段的真核表 達質(zhì)粒即pcDNA-NlNA。含有pcDNA_H5HA質(zhì)粒和pcDNA_NlNA質(zhì)粒的細菌，分別 經(jīng)含有50 μ g/ml的氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)過夜后，用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取 pcDNA-H5HA質(zhì)粒和pcDNA_NlNA質(zhì)粒，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染細胞和重組表達實驗。
根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑盒說明，將 2.5 μ g pcDNA_H5HA 質(zhì)粒、 0.5 μ gpcDNA-NlNA 質(zhì)粒和 10 μ 1 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染一個:35mm 直徑培養(yǎng)皿含有生長密度約為80% -90%融合率的人胚腎HEK-239細胞，轉(zhuǎn)染后《ι去除轉(zhuǎn)染 復(fù)合物，更換新鮮的完全培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)。
轉(zhuǎn)染后，HEK-239細胞即可瞬時重組表達HA和NA，即得到瞬時重組表達流感 病毒HA和NA的細胞。
為進一步優(yōu)化，可以篩選獲得穩(wěn)定重組表達HA和NA的細胞在轉(zhuǎn)染7Zh后將 轉(zhuǎn)染細胞吹打分散，將細胞懸液的1/20接種一個新的35mm直徑培養(yǎng)皿中，補充完全培 養(yǎng)基至3ml，經(jīng)過夜貼壁后，補加G418至濃度為600μ§/ιη1。此后每3至5天的更換一次 含有600yg/mlG418的完全培養(yǎng)基，約3周后可見篩選出現(xiàn)的抗性細胞集落。將抗性細 胞集落經(jīng)胰酶消化后，按10-20個細胞/ml接種96孔板培養(yǎng)，加入含有600 μ g/ml G418 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至長至單層后，進行傳代，獲得用于檢測的備份培養(yǎng)96孔板。將檢測 用的96孔板的細胞用4%多聚甲醛室溫固定5分鐘，經(jīng)PBS漂洗后，加入Cy3熒光標(biāo)記 的抗H5亞型HA的抗體和FITC熒光標(biāo)記的抗Nl亞型NA的抗體進行免疫熒光檢測，選 擇紅色和綠色熒光陽性信號強、紅色和綠色熒光陽性細胞比例高的孔，對細胞繼續(xù)重復(fù) 的克隆化和免疫熒光，至陽性細胞比例接近100%，即可得到穩(wěn)定重組表達該毒株HA和 NA的細胞。
瞬時或穩(wěn)定重組表達該毒株HA和NA的細胞，經(jīng)貼壁或懸浮培養(yǎng)后，用含有 2% BSA的PBS將細胞吹打分散，將細胞懸液進行離心，去除上清后用含有0.1% BSA的 PBS按IO7個/ml細胞密度進行重懸。每ml細胞懸液中，力卩入2 μ 1的5mmol/L的CFSE 母液，37°C放置10分鐘，再加入5ml冰預(yù)冷的PBS，于冰水混合物中放置5分鐘，離心 去除上清，用等體積的PBS重懸、離心進行洗滌2次，再次加入等體積的PBS，加入等 體積的10%的冷甲醛，于4°C固定2小時。經(jīng)離心、PBS重懸的方式進行3次洗滌。最 后將細胞沉淀，按105個/ml的濃度重懸于含有0.2%尼泊爾金酯、2%BSA、20%甘油、 0.5%肝素的PBS緩沖液中，使其能夠穩(wěn)定地長時間保存，即得到了熒光素CFSE標(biāo)記的 重組表達HA和NA抗原的真核細胞。
將該綠色熒光蛋白標(biāo)記重組表達HA和NA抗原的真核細胞的細胞懸液25 μ 1與 待檢樣品25 μ 1，在微量凝集板中混合，室溫放置60分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察。如 未發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細胞會沉淀在凝集板底部，鏡下可見熒光細胞聚集在中 央；如發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細胞以絮狀懸浮在液體中，鏡下可見熒光細胞在視 野中分散，細胞與細胞間發(fā)生聚團。利用這一特征，也可以用熒光顯微鏡進行成像，利 用圖像分析軟件，通過設(shè)立熒光發(fā)光面積來實現(xiàn)軟件判讀凝集與否。待檢樣品發(fā)生凝集 時，說明待檢樣品中含有與該毒株HA和/或NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和/或NA 抗體。
實施例3綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別標(biāo)記單獨重組表達流感病毒HA和 NA的真核細胞的方法
本實施例以一株Η5 型的毒株 A/Chicken/Guangdong/1/2005(H5N1)為例，進行重組表達流感病毒血凝素HA真核表達細胞的制備。A/Chicken/ Guangdong/1/2005 (H5N1)是2005年在廣東省的雞中分離得到的一株H5N1亞型流9感病毒，其HA和NA的基因序列可在公共數(shù)據(jù)庫GenBank上獲得，HA的序列號為 EU874899.2，NA的序列號為EU874900.2。將該株病毒增殖后使用Viral RNA Miniprep Kit 提取病毒 RNA，用 Uni-12 引物(5，-AGCAAAAGCAGG-3，)禾Π SuperScript III 或 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，得到病毒cDNA。根據(jù)該毒株HA的基因序列，設(shè)計一對 用于HA全長基因克隆的引物，其引物序列具體如下上游引物H5HA-F，序列為5’ -G CAAAGCTTACCATGGAGAAAATAGTACTTCTTC-3，，從 5，端依次為 3 個保護性堿 基、HindIII酶切位點、KOZAK序列、起始密碼子和配對區(qū)；下游引物H5HA-R，序列 為 5，-CTCGGATCCTTAAATGCAAATTCTGCATTGTAAG-3，，從 5，端依次為 3 個保 護性堿基、BamH I酶切位點、終止密碼子和配對區(qū)。利用這對引物，用高保真Taq酶對 病毒cDNA進行PCR擴增，擴增HA片段。
根據(jù)該毒株NA的基因序列，設(shè)計一對用于NA全長基因克隆的引物，其引物序 列具體如下上游引物 NlNA-F 序列為 5，-GCAAAGCTTACCATGAATCCAAATCAG AAG-3，，從5’端依次為3個保護性堿基、HindIII酶切位點、KOZAK序列、起始密 碼子和配對區(qū)；下游引物N1NA-R，序列為5，-CTCGGATCCCTACTTGTCAATGGTG AATG-3’，從5’端依次為3個保護性堿基、BamH I酶切位點、終止密碼子和配對區(qū)。 利用這對引物，用高保真Taq酶對病毒cDNA進行PCR擴增，擴增NA片段。
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后HA基因片段后，與紅色熒光表達載體分別 進行使用Hind III和BamH I雙酶切，再次電泳回收后利用T4DNA連接酶將酶切回收后 的HA片段與載體進行連接。該紅色熒光表達載體，在編碼的紅色熒光蛋白與多克隆位 點間有一個核糖體進入位點序列(IRES)，HA基因片段插入載體的啟動子后、IRES前， 當(dāng)啟動子啟動轉(zhuǎn)錄時可以得到一個編碼有HA、IRES和紅色熒光蛋白的mRNA，最終翻 譯得到單獨的HA和紅色熒光蛋白。NA片段與綠色熒光表達載體使用Hind III和BamH I雙酶切后，電泳回收進行連接，該載體編碼的綠色熒光蛋白與多克隆位點間有一個核糖 體進入位點序列(IRES)，NA基因片段插入載體的啟動子后、IRES前，當(dāng)啟動子啟動轉(zhuǎn) 錄時可以得到一個編碼有NA、IRES和綠色熒光蛋白的mRNA，最終翻譯得到單獨的NA 和綠色熒光蛋白。
連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，涂布Amp抗性平板。菌落 經(jīng)PCR后，提取質(zhì)粒酶切鑒定和DNA測序，獲得含有HA基因片段的真核表達質(zhì)粒即 pIRES-Red-H5HA,獲得含有HA基因片段的真核表達質(zhì)粒即pIRES-EGFP_NlNA。含 有pIRES-Red_H5HA質(zhì)粒和pIRES_EGFP_NlNA質(zhì)粒的細菌，分別經(jīng)含有50 μ g/ml的氨 芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)過夜后，用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取pIRES-Red_H5HA質(zhì) 粒和pIRES-EGFP-ΝΙΝΑ質(zhì)粒，用于后續(xù)轉(zhuǎn)染細胞和重組表達實驗。
根據(jù)Lipofectamine 2000 試劑盒說明，將 3 μ g pIRES-Red"H5HA 質(zhì)粒和 10 μ ILipofectamine 2000轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染一個35mm直徑培養(yǎng)皿含有生長密度約為 80%-90(%融合率的人胚腎1^尺-239細胞，轉(zhuǎn)染后《ι去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，更換新鮮的完全 培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)。
轉(zhuǎn)染后，HEK-239細胞即可瞬時重組表達HA，即得到紅色熒光蛋白標(biāo)記的瞬 時重組表達流感病毒HA的細胞。
為進一步優(yōu)化，可以篩選獲得穩(wěn)定重組表達HA的細胞在轉(zhuǎn)染7Zh后將轉(zhuǎn)染細胞吹打分散，將細胞懸液的1/20接種一個新的35mm直徑培養(yǎng)皿中，補充完全培養(yǎng)基至 3ml，經(jīng)過夜貼壁后，補加G418至濃度為600yg/ml。此后每3至5天的更換一次含有 600yg/mlG418的完全培養(yǎng)基，約3周后可見篩選出現(xiàn)的抗性細胞集落。將抗性細胞集 落經(jīng)胰酶消化后，按10-20個細胞/ml接種96孔板培養(yǎng)，加入含有600 μ g/ml G418的完 全培養(yǎng)基培養(yǎng)至長至單層后，于熒光顯微鏡下觀察細胞的紅色熒光，對細胞繼續(xù)重復(fù)的 克隆化，至紅色熒光陽性細胞比例接近100%，即可得到紅色熒光蛋白標(biāo)記的穩(wěn)定重組表 達該毒株HA的細胞。
根據(jù) Lipofectamine 2000 試劑盒說明，將 3 μ g pIRES-EGFP-NlNA 質(zhì)粒和 10 μ ILipofectamine 2000轉(zhuǎn)染復(fù)合物，轉(zhuǎn)染一個35mm直徑培養(yǎng)皿含有生長密度約為 80%-90(%融合率的人胚腎1^尺-239細胞，轉(zhuǎn)染后《ι去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，更換新鮮的完全 培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)。
轉(zhuǎn)染后，HEK-239細胞即可瞬時重組表達NA，即得到綠色熒光蛋白標(biāo)記的瞬時 重組表達流感病毒NA的細胞。
為進一步優(yōu)化，可以篩選獲得穩(wěn)定重組表達NA的細胞在轉(zhuǎn)染7Zh后將轉(zhuǎn)染 細胞吹打分散，將細胞懸液的1/20接種一個新的35mm直徑培養(yǎng)皿中，補充完全培養(yǎng)基 至3ml，經(jīng)過夜貼壁后，補加G418至濃度為600 μ g/ml。此后每3至5天的更換一次含 有600 μ g/ml G418的完全培養(yǎng)基，約3周后可見篩選出現(xiàn)的抗性細胞集落。將抗性細 胞集落經(jīng)胰酶消化后，按10-20個細胞/ml接種96孔板培養(yǎng)，加入含有600 μ g/ml G418 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至長至單層后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，選擇熒光陽性信號強、 熒光陽性細胞比例高的孔，對細胞繼續(xù)重復(fù)的克隆化和免疫熒光，至陽性細胞比例接近 100%,即可得到綠色熒光蛋白標(biāo)記的穩(wěn)定重組表達該毒株NA的細胞。
紅色熒光蛋白標(biāo)記的瞬時或穩(wěn)定重組表達該毒株HA的細胞，經(jīng)培養(yǎng)后，用低 濃度胰酶(0.05%)溫和消化細胞約5分鐘，加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，將細 胞懸液進行離心，去除上清后用含有2% BSA的PBS進行重懸，獲得胰酶處理后的細胞 懸液。為防止HA可能引起的細胞自凝集，在胰酶處理后的細胞懸液中加入神經(jīng)氨酸酶 (又稱神經(jīng)氨酸苷酶，Neuraminidase)進行處理，消除重組表達的HA與細胞自身受體的 作用，避免細胞自身凝集。即，將細胞懸液經(jīng)離心后，用50mM檸檬酸鈉(pH 6.0)緩 沖液，將細胞按IO7個/ml進行重懸，每ml細胞懸液中加入200單位的神經(jīng)氨酸酶，于 37°C條件下處理30分鐘后離心，去除上清，用等體積的PBS重懸、離心進行洗滌2次， 再次加入等體積的PBS。上述經(jīng)胰酶和神經(jīng)氨酸酶處理的細胞懸液，加入等體積的10% 的冷甲醛，于4°C固定2小時。經(jīng)離心、PBS重懸的方式進行3次洗滌。最后將細胞沉 淀，按IO5個/ml的濃度重懸于含有0.2%尼泊爾金酯、2%BSA、20%甘油、0.5%肝素的 PBS緩沖液中，使其能夠穩(wěn)定地長時間保存，即得到了處理后的重組表達HA抗原的真核 細胞。
綠色熒光蛋白標(biāo)記的瞬時或穩(wěn)定重組表達該毒株NA的細胞，經(jīng)貼壁或懸浮培養(yǎng) 后，用含有2% BSA的PBS將細胞吹打分散，將細胞懸液進行離心，去除上清后用含有 2% BSA的PBS按IO7個/ml細胞密度進行重懸。去除上清，用等體積的PBS重懸、離 心進行洗滌2次，再次加入等體積的PBS，加入等體積的10%的冷甲醛，于4°C固定2小 時。經(jīng)離心、PBS重懸的方式進行3次洗滌。最后將細胞沉淀，按IO5個/ml的濃度重懸于含有0.2%尼泊爾金酯、2%BSA、20%甘油、0.5%肝素的PBS緩沖液中，使其能夠 穩(wěn)定地長時間保存，即得到了處理后的重組表達NA抗原的真核細胞。
上述綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別標(biāo)記的單獨重組表達HA和NA的真核細 胞即可用檢測，同時也可將兩者按一定比例進行混合，混合比例為重組表達HA的真核細 胞含量為10%-95%，優(yōu)選70%-80%，重組表達HA的真核細胞含量為5%-90%，優(yōu) 選20% -30%,混合后的細胞在檢測效果上與共同重組表達HA和NA的真核細胞類似。
將綠色熒光蛋白單獨重組表達HA或NA的真核細胞懸液和紅色熒光蛋白分別標(biāo) 記的單獨重組表達HA或NA的真核細胞懸液25 μ 1與待檢樣品25 μ 1，在微量凝集板中混 合，室溫放置60分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察。如未發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細胞 會沉淀在凝集板底部，鏡下可見熒光細胞聚集在中央；如發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的 細胞以絮狀懸浮在液體中，鏡下可見熒光細胞在視野中分散，細胞與細胞間發(fā)生聚團。 利用這一特征，也可以用熒光顯微鏡進行成像，利用圖像分析軟件，通過設(shè)立熒光發(fā)光 面積來實現(xiàn)軟件判讀凝集與否。待檢樣品發(fā)生凝集時，說明待檢樣品中含有與該毒株HA 和/或NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和/或NA抗體。
將紅色熒光蛋白標(biāo)記重組表達HA抗原的真核細胞懸液(設(shè)為Α)、綠色熒光蛋 白標(biāo)記重組表達NA抗原的真核細胞懸液(設(shè)為B)、綠色熒光蛋白標(biāo)記的重組表達HA和 NA抗原的真核細胞懸液(或綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別標(biāo)記的單獨表達HA和NA 的真核細胞混合懸液，設(shè)為C)，各加25 μ 1加到潔凈的微量凝集板中，然后各加入25 μ 1 的待檢樣品(血清、支氣管灌洗液、血漿、組織液等)至3種不同的細胞懸液中混合，室 溫放置60分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察。如未發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細胞會沉淀 在凝集板底部，鏡下可見熒光細胞聚集在中央；如發(fā)生凝集，則發(fā)出綠色熒光的細胞以 絮狀懸浮在液體中，鏡下可見熒光細胞在視野中分散，細胞與細胞間發(fā)生聚團。利用這 一特征，也可以用熒光顯微鏡進行成像，利用圖像分析軟件，通過設(shè)立熒光發(fā)光面積來 實現(xiàn)軟件判讀凝集與否。待檢樣品發(fā)生凝集時，說明待檢樣品中含有與該毒株HA和/ 或NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和/或NA抗體。
設(shè)立陽性血清和陰性血清對照，如對照樣品符合預(yù)期結(jié)果，待檢樣品發(fā)生與上 述細胞懸液均未凝集時，說明待檢樣品中不含有與該毒株HA和NA具有反應(yīng)性的流感病 毒HA和NA抗體或抗體濃度低于該方法所能達到的檢測濃度。設(shè)立陽性血清和陰性血 清對照，如對照樣品符合預(yù)期結(jié)果，待檢樣品發(fā)生與上述細胞懸液均發(fā)生凝集時，說明 待檢樣品中含有與該毒株HA和NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和NA抗體。
設(shè)立陽性血清和陰性血清對照，如對照樣品符合預(yù)期結(jié)果，待檢樣品發(fā)生與細 胞懸液A和細胞懸液C均發(fā)生凝集時，而未與細胞懸液B發(fā)生凝集時，說明待檢樣品中 含有與該毒株HA具有反應(yīng)性的流感病毒HA抗體，而不含有與該毒株NA具有反應(yīng)性的 流感病毒NA抗體或抗體濃度低于該方法所能達到的檢測濃度。
設(shè)立陽性血清和陰性血清對照，如對照樣品符合預(yù)期結(jié)果，待檢樣品發(fā)生與細 胞懸液B和細胞懸液C均發(fā)生凝集時，而未與細胞懸液A發(fā)生凝集時，說明待檢樣品中 含有與該毒株NA具有反應(yīng)性的流感病毒NA抗體，而不含有與該毒株HA具有反應(yīng)性的 流感病毒HA抗體或抗體濃度低于該方法所能達到的檢測濃度。
待檢樣品發(fā)生凝集時，說明待檢樣品中含有與該毒株HA和/或NA具有反應(yīng)性的流感病毒HA和/或NA抗體。此時可以進一步進行相對定量分析，即，將待檢樣品1 進行連續(xù)的倍比稀釋，然后分別與實施例2中的處理后的重組表達HA和/或NA抗原的 真核細胞懸液進行凝集反應(yīng)，得到所能發(fā)生凝集的樣品最高稀釋度，設(shè)為dl。同樣方法 可得到待檢樣品2的凝集反應(yīng)陽性最高稀釋度d2。以此橫向比較不同待檢樣品中流感病 毒HA和/或NA抗體的濃度差異和相對比例。
權(quán)利要求
1.一種檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法，其特征在于所述方法是將流感 病毒血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因克隆后轉(zhuǎn)染真核細胞，使真核細胞表面重組表達流感 病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，對重組表達細胞進行熒光標(biāo)記，該細胞表面的重組表達 的血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白與待測樣品的流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體結(jié)合， 發(fā)生凝集反應(yīng)，熒光檢測分析，根據(jù)熒光面積是否增加來判定待測樣品中是否存在流感 病毒抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法，其特征在于所 述重組表達流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶的真核細胞為同時共同重組表達流感病毒血凝 素和神經(jīng)氨酸酶，或者分別重組表達流感病毒血凝素的真核細胞與重組表達神經(jīng)氨酸酶 的真核細胞的混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法，其特征在于所 述重組表達為瞬時表達或穩(wěn)定表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法，其特征在于所 述真核細胞表面重組表達的流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白為完整全長的流感病毒血 凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，或流感病毒血凝素蛋白和神經(jīng)氨酸酶的一部分，或流感病毒血 凝素和神經(jīng)氨酸酶的抗原表位，或?qū)⒘鞲胁《狙睾蜕窠?jīng)氨酸酶蛋白全長或部分肽段 中的部分氨基酸進行突變或修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法，其特征在于所 述真核細胞表面重組表達的血凝素為甲型流感病毒的HI、H2、H3、H4、H5、H6、H7、 H8、H9、H10, HlU H12、H13、H14、H15、H16亞型、乙型流感病毒或丙型流感病 毒的血凝素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法，其特征在于所 述真核細胞表面重組表達的神經(jīng)氨酸酶蛋白為甲型流感病毒的Ni、N2、N3、N4、N5、 N6、N7、N8、N9亞型、乙型流感病毒或丙型流感病毒的神經(jīng)氨酸酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法，其特征在于所 述流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體為IgG、IgM, IgA、IgE、IgD中的一種或幾種 的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法，其特征在于所 述熒光標(biāo)記為熒光素、熒光蛋白或其它能夠發(fā)出熒光的物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法，其特征在于所 述熒光檢測分析所用的設(shè)備為熒光顯微鏡、熒光光度計或多功能微孔板檢測儀。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9中任意一條權(quán)利要求所述的檢測流感病毒抗體的熒光微量細 胞凝集方法，其特征在于所述真核細胞為酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或其它真核細 胞，重組表達的流感病毒血凝素位于細胞膜或細胞壁表面。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測流感病毒抗體的熒光微量細胞凝集方法。本發(fā)明方法是將流感病毒血凝素基因和神經(jīng)氨酸酶基因克隆后轉(zhuǎn)染真核細胞，使真核細胞表面重組表達流感病毒血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白，對重組表達細胞進行熒光標(biāo)記，該細胞表面的重組表達的血凝素和神經(jīng)氨酸酶蛋白與待測樣品的流感病毒血凝素抗體和神經(jīng)氨酸酶抗體結(jié)合，發(fā)生凝集反應(yīng)，通過熒光顯微鏡拍照，根據(jù)熒光面積是否增加來判定待測樣品中是否存在流感病毒抗體。本發(fā)明檢測方法使用熒光標(biāo)記細胞，減少了細胞使用量，可進行高通量檢測，可以實現(xiàn)流感病毒抗體的快速檢測、早期檢測、現(xiàn)場檢測和評價。
文檔編號G01N33/569GK102023213SQ20101029718
公開日2011年4月20日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者吳嘉偉, 吳彬冰, 孟燕萍, 李衛(wèi)中, 李康生, 李蕊, 王革非, 蔡漢杰, 黃秀梅 申請人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院