專利名稱：基于抗重組ul51蛋白抗體的膠體金試紙及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中鴨瘟病毒抗原的檢測檢測，特別涉及基于抗重組 UL51蛋白抗體的膠體金試紙及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鴨瘟(Duckplague，DP),又稱鴨病毒性腸炎(Duck viral enteritis，DVE)，是
鴨、鵝、天鵝等雁形目動(dòng)物的一種急性接觸性傳染病，其致病特征是血管損傷、組織出 血、消化道和淋巴器官損傷。該病可導(dǎo)致商品水禽的產(chǎn)蛋量下降和死亡，對(duì)野生水禽也 有不同的致死率。DP的病原為DPV(Duck plague virus，DPV), DPV是一種泛嗜性全身
性感染的病毒，目前大多數(shù)學(xué)者把其暫時(shí)列為α皰疹病毒亞科，但尚未分屬。目前，已 報(bào)道的DPV檢測方法有病毒分離鑒定、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、熒光實(shí)時(shí)定量PCR、間 接免疫酶組化法、間接免疫熒光法、電鏡觀察、原位雜交、間接原位PCR法、血清中和 試驗(yàn)(SNT)、瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、反向被動(dòng)血凝試驗(yàn)、微 量固相放射免疫測定法、生物素標(biāo)記寡核苷酸探針原位檢測、地高辛標(biāo)記核酸探針法和 光敏生物素標(biāo)記法等，這些方法各有特點(diǎn)。但是，傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法大約需4 5d，且方法繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。一些免疫學(xué)方法以及PCR方法也往往需要特殊的儀器、設(shè) 備以及熟練的技術(shù)人員。此外，許多血清學(xué)檢測方法都是基于純化的DPV全病毒產(chǎn)生 的抗體來檢測DPV，由于病毒純化的復(fù)雜性和純化后的病毒中會(huì)摻雜有許多宿主細(xì)胞成 分，而導(dǎo)致許多假陽性結(jié)果出現(xiàn)。膠體金(ICS)法是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種將膠體金免疫技術(shù)和色譜層析 技術(shù)相結(jié)合的固相膜免疫分析方法，它是在免疫膠體金滲濾法基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。近年 來已在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用，如寄生蟲病、病毒病、細(xì)菌病和藥物殘 留等的檢測。該方法操作簡單、特異性強(qiáng)，并可在15min內(nèi)很直觀地判斷出待測物的有 無，大大提高了檢測的速度。ICS法現(xiàn)已成為當(dāng)今最快速、敏感的免疫學(xué)檢測技術(shù)之一， 特別適合于廣大基層獸醫(yī)人員以及大批量檢測和大面積普查等，因此該技術(shù)具有巨大的 發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，對(duì)蛋白功能的研究日趨增強(qiáng)，特別 是對(duì)有免疫原性蛋白的研究日益增多，以克隆表達(dá)的重組蛋白作為包被原檢測病毒抗血 清的ELISA方法和膠體金免疫層析法已被大量報(bào)道，同時(shí)也有以表達(dá)的重組蛋白制備的 抗體檢測病毒抗原的報(bào)道。但是，基于重組UL51蛋白的抗體檢測鴨瘟病毒抗原的ICS法 尚未見報(bào)到，重組UL51蛋白的抗體是否與DPV發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)尚需證實(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種膠體金試紙，該試紙是基于抗重組 UL51蛋白抗體標(biāo)記并嚴(yán)格控制金標(biāo)墊上免疫膠體金與硝基纖維膜上抗體的標(biāo)記濃度的基 礎(chǔ)上制備而成，其特異性和靈敏性高。
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為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為基于抗重組UL51蛋白抗體的膠體金試紙，由底板、硝基纖維膜、樣品墊、金標(biāo) 墊和吸收墊組成，硝基纖維膜上有測試線和對(duì)照線，所述硝基纖維膜上的測試線由濃度 大于或等于lmg/mL的A抗重組UL51蛋白抗體IgG包被而成，對(duì)照線由濃度大于或等 于lmg/mL C抗BIgG包被而成；所述金標(biāo)墊由膠體金標(biāo)記濃度大于或等于2mg/mL的B 抗重組UL51蛋白抗體IgG包被而成；所述A抗重組UL51蛋白抗體IgG為免疫學(xué)研究 中常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中除鴨外的任一種動(dòng)物抗重組UL51蛋白抗體IgG，所述B抗重組UL51 蛋白抗體IgG為免疫學(xué)研究中常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中除A外的任一種動(dòng)物抗重組UL51蛋白抗 體IgG，所述C抗B IgG為免疫學(xué)研究中常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中除A和B外的任一種動(dòng)物抗B IgG。進(jìn)一步，所述A抗重組UL51蛋白抗體IgG中的A為鼠抗重組UL51蛋白抗體 IgG,所述B抗重組UL51蛋白抗體IgG為兔抗重組UL51蛋白抗體IgG，所述C抗B IgG 為羊抗兔IgG;進(jìn)一步，所述硝基纖維膜上的測試線由濃度等于lmg/mL的A抗重組UL51蛋白 抗體IgG包被而成，對(duì)照線由濃度等于lmg/mL C抗B IgG包被而成；所述金標(biāo)墊包由膠 體金標(biāo)記濃度等于2mg/mL的B抗重組UL51蛋白抗體IgG包被而成；本發(fā)明的目的之二在于提供所述膠體金試紙的制備方法，該方法簡單實(shí)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為上述的基于抗重組UL51蛋白抗體的膠體金試紙的制作方法，具體步驟為a硝基纖維膜上測試線和對(duì)照線的噴制將濃度大于或等于lmg/mL的A抗重組 UL51蛋白抗體IgG噴點(diǎn)于硝基纖維膜上形成測試線，將濃度大于或等于lmg/mLC抗B IgG噴點(diǎn)于硝基纖維膜上形成對(duì)照線，干燥后低溫密封保存?zhèn)溆?；b金標(biāo)墊的制備將玻璃纖維素膜浸于膠體金標(biāo)記濃度大于或等于2mg/mL的B 抗重組UL51蛋白抗體IgG中，再將該膜浸于玻璃纖維素膜處理液中封閉非特異性結(jié)合位 點(diǎn)，干燥后得金標(biāo)墊；C膠體金免疫層析試紙條的組裝分別將硝基纖維膜、樣品墊、金標(biāo)墊和吸收墊 依次粘在所述底板上，硝基纖維膜上所述對(duì)照線靠近吸收墊端，所述測試線靠近樣品墊 端，再切割成一定寬度的試紙條，密封包裝，干燥低溫保存。進(jìn)一步，所述測試線與所述對(duì)照線的距離為0.7厘米，所述測試線與所述對(duì)照線 距硝基纖維膜的邊距分別為0.9厘米。本發(fā)明的目的之三在于提供所述膠體金試紙的運(yùn)用，所述運(yùn)用能夠保證在靈敏 性和特異性較高的情況下快速檢測鴨瘟病毒抗原。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為膠體金試紙?jiān)谥苽澍單敛《究乖瓩z測試紙中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于本膠體金試紙敏感性高，可檢測到最低含量為 0.125 μ g的DPV病毒蛋白；運(yùn)用該試紙對(duì)含DPV的DEF培養(yǎng)液、含DHV的鴨胚尿囊 液、含RA的菌體培養(yǎng)液和含E.coli菌體培養(yǎng)液，結(jié)果顯示僅含DPV的DEF培養(yǎng)液可見 兩條清晰的紅色條帶，其它樣品液均僅在C線處出現(xiàn)一條清晰的紅色條帶，表明此方法 具有良好的特異性；另外，運(yùn)用本試紙檢測鴨瘟病毒具有良好的批內(nèi)及批間重復(fù)性；本方法制備的試紙至少可在4°C或25°C保存半年，本運(yùn)用首次將抗重組UL51蛋白抗體IgG 制備成膠體金試紙用于檢測鴨瘟病毒。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作 進(jìn)一步的詳細(xì)描述，其中圖I-A為DPV UL51基因的PCR擴(kuò)增M指DL2000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1指 以正常DEF基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2指以DPV CHv毒株基因組DNA為 模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(箭頭所示的是其分子量大小，約為760bp);圖I-B為重組質(zhì)粒 PMD18-UL51的雙酶切鑒定M指相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)III，1指重組質(zhì)粒pMD18_UL51用 EcoR I和Xho I雙酶切得到的兩個(gè)片段(箭頭所示小片段的分子量大小約為760bp)；圖 I-C為重組表達(dá)載體pET28a-UL51的雙酶切鑒定M指相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)III，1指重組 表達(dá)載體pET28a_UL51，2指重組表達(dá)載體pET28a_UL51用EcoR I和Xho I雙酶切得到 的兩個(gè)片段(箭頭所示小片段的分子量大小約為760bp)。圖2-A為重組表達(dá)蛋白的SDS-PAGE鑒定M為蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，
1為陰性對(duì)照(未加IPTG誘導(dǎo))，2為IPTG誘導(dǎo)(箭頭所示的蛋白質(zhì)分子量大小約為 34KD)；圖2-B為誘導(dǎo)劑IPTG不同終濃度誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果1_7的IPTG濃度分別為O、 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2mmol/L ；圖 2-C 為不同溫度誘導(dǎo)pET28a_UL51 表達(dá)結(jié)果 1-3的溫度分別為20、30和37°C;圖2_D為不同時(shí)間誘導(dǎo)pET28a_UL51表達(dá)結(jié)果1_7 的誘導(dǎo)時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6、7和8h。圖3-A為重組UL51蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析M為蛋白質(zhì)分子量，1為 IPTG誘導(dǎo)的Iml菌液，2為粗提的UL51蛋白包涵體，3為50mM咪唑洗脫峰(不含純化 的重組UL51蛋白)；4為300mM咪唑洗脫峰(含有純化的重組UL51蛋白)；圖3_B為 純化的抗重組UL51蛋白抗體IgG的SDS-PAGE分析M指標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量，1指過柱 純化的兔抗UL51蛋白抗體IgG，2為過柱純化鼠抗UL51蛋白抗體IgG。圖4為瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)檢測兔抗重組UL51蛋白高免血清效價(jià)測定。圖5為膠體金免疫層析試紙條的組裝示意圖；圖6為基于抗重組UL51蛋白抗體的ICS法的敏感性檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu) 選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。本實(shí)施例中，試紙是基于抗重組UL51蛋白抗體標(biāo)記并嚴(yán)格 控制金標(biāo)墊上免疫膠體金與硝基纖維膜上抗體的標(biāo)記濃度的基礎(chǔ)上制備而成，所述重組 UL51蛋白的獲得是通過構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-UL51、轉(zhuǎn)化表達(dá)菌并發(fā)酵培養(yǎng)，收集 到了大量的含有重組UL51蛋白的菌體沉淀，再通過超聲波破碎菌體、重組UL51蛋白包 涵體冼滌、純化及梯度透析而獲得的；用所述重組UL51蛋白對(duì)兔和鼠進(jìn)行常規(guī)免疫程序 和純化，獲得兔抗重組UL51蛋白抗體IgG和鼠抗重組UL51蛋白抗體IgG ；進(jìn)一步確定 了兔抗重組UL51蛋白抗體IgG和鼠抗重組UL51蛋白抗體IgG的最佳濃度范圍及酶標(biāo)抗 體最適濃度，最終得到特異性和靈敏性高的檢測試紙。
實(shí)施例基于抗重組UL51蛋白抗體的膠體金試紙及其制備方法和應(yīng)用一鴨瘟病毒UL51基因的克隆、原核表達(dá)及UL51蛋白的純化1材料準(zhǔn)備1.1菌株、質(zhì)粒和毒株質(zhì)粒pMD18_T，購自大連寶生物工程有限公司；原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)， Novagen公司產(chǎn)品；克隆宿主菌E.coli DH5a、表達(dá)宿主菌E.coli BL21 (DE3)禾Π DPV CHv 強(qiáng)毒株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供。1.2試驗(yàn)動(dòng)物10日齡鴨胚，其種鴨DPV和抗體均為陰性；健康雄性白兔4只，體重2_3kg/ 只，購自雅安某兔場；健康Vista大鼠20只，購自四川大學(xué)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1DPVUL51 基因的克隆2.1.1引物設(shè)計(jì)禾Ij用Primer Premier5.0軟件，參考UL51基因序列(GenBank登錄號(hào) DQ072725),由寶生物生物技術(shù)有限公司合成。弓I物DPV-UL51F 5，-CCGGAATTCATGTTAGCTTTTATCTCCAG-3，(劃線 部分為 EcoRI 位點(diǎn))；引物 DPV-UL51R: 5，-TCCCTCGAGTTAGACGGCTACCAACG-3’(劃線部分為XhoI位點(diǎn))。合成后，以適量滅菌去離子水溶解，使其終濃度為20mmOl/ L，-20°C保存?zhèn)溆谩?.1.2DPV基因組DNA的提取a正常鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)的制作方法取IOd日齡健康鴨胚，分別用5%碘 酒和75%酒精消毒蛋殼表面。無菌操作條件下將胚體取出并用PBS將胚體洗凈，剪去 頭、翅、腿和內(nèi)臟，PBS沖洗后將胚體剪成Imm大小的小塊，力Π PBS適量，之后置于三 角瓶內(nèi)，加細(xì)胞分散劑(2.5%胰蛋白酶)150μ1/胚，于37°C水浴中消化3min。立即將細(xì) 胞懸液以4000r/min離心5min，傾棄上清，細(xì)胞沉淀用適量的MEM懸浮后，用5層紗布 過濾，向?yàn)V液中加入10%小牛血清和100IU/mL雙抗后，分裝于IOOmL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 7mL/瓶，水平靜置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。b DPV增殖取剛剛長成致密單層的DEF，棄生長營養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗細(xì) 胞表面2次后，加入DPV病毒液2 3mL覆蓋細(xì)胞表面進(jìn)行吸附，37°C吸附120min后棄 病毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/mL雙抗的MEM維持營養(yǎng)液，之后37°C培養(yǎng)。 同時(shí)做未接毒的DEF對(duì)照。c DNA提取方法直接從感染細(xì)胞中提取DPV基因組DNA的具體步驟如下 (1)選取用DPV種毒感染后細(xì)胞病變(CPE)達(dá)60% 70%的DEF (IOOmL細(xì)胞瓶)；同 時(shí)選取細(xì)胞形態(tài)正常的DEF作對(duì)照；(2)傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入500 μ L的細(xì)胞裂解液， 同時(shí)加蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度為ZOOyg/mL，輕輕混勻后，37°C孵育IOmin ； (3) 將細(xì)胞懸浮液倒入EP離心管中，并用500 μ L的飽和酚洗滌殘存于細(xì)胞瓶內(nèi)的裂解物， 倒入離心管中；(4)用飽和酚氯仿及氯仿抽提2次，再用水飽和乙醚處理2次；(5)加 1/10倍體積3mol/LNaAC，混勻后，加入2倍體積冷無水乙醇，-20°C放置30 60min ； (6) 13000r/min離心20min，沉淀用預(yù)冷的70 %乙醇洗滌兩次；(7)真空抽干后，溶于適量TE緩沖液中，加入IyLRNA酶，37°C作用30min，_20°C保存?zhèn)溆?.1.3PCR 擴(kuò)增 DPV UL51 基因PCR反應(yīng)體系為
2 χ 傻瓜 PCR Mixtrue DPV基因組DNA Pl(20pmol/pL) P2 ( 20pmol / μι) 超純水 Total volume
\2.5μΙ
Ι.Ομ
Ι.Ομ
Ι.Ομ
9.5μL
25μL /Sample輕輕混勻，2000r/min瞬時(shí)離心后進(jìn)行PCR。反應(yīng)參數(shù)95 °C預(yù)變性5min，95 "C變性lmin，56 °C退火lmin，72 "C延伸 Imin,循環(huán)40次，最后72°C延伸lOmin，于4°C保存?zhèn)溆?。? μ L PCR產(chǎn)物在1 %瓊 脂糖凝膠上電泳，設(shè)DL2000和空白對(duì)照，觀察擴(kuò)增片段的長度。2.1.4UL51基因PCR產(chǎn)物的回收按北京賽百盛基因技術(shù)有限公司DNA回收試劑盒說明書進(jìn)行，回收后的DNA 貯存于-20°C保存?zhèn)溆谩?.1.5純化的UL51基因與pMD18_T的連接連接反應(yīng)體系如下
PCR 產(chǎn)物4.5μ
pMD18-T0.5μ 2xDNA 連接酶 Mixtrue5.0|iL
超純水補(bǔ)足至IOpL將上述試劑加入0.2mL的EP管中，小心混勻，瞬時(shí)離心后，于16°C連接過夜。2.1.6DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備采用氯化鈣法制備新鮮的DH5a株大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，簡述如下(1)無菌挑 取平板上新鮮培養(yǎng)的DH5a單克隆菌落接種于5mL LB培養(yǎng)液中，于37°C振蕩培養(yǎng)過夜； (2)取ImL上述培養(yǎng)液接種于IOOmL LB培養(yǎng)液中，37°C 200r/min振蕩培養(yǎng)2.5 3h， 使OD_ = 0.5左右；(3)將細(xì)菌培養(yǎng)物倒入滅菌后用冰預(yù)冷的離心管中，冰浴IOmin ； (4)于4°C 4000r/min離心8min，棄上清；(5)加IOmL冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2,溫和 懸起細(xì)菌沉淀，冰浴30min; (6)于4°C 4000r/min離心8min，棄上清，力MmL冰預(yù)冷的 0.1mol/L的CaCl2再次重懸沉淀，加入終濃度為15%的滅菌甘油，混勻后分裝為200 μ L/ 管，直接用于轉(zhuǎn)化或置于-70°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?.1.7轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞將10 μ L連接體系全部取出加到200 yL DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min ；再置 于42°C溫浴90s，之后再冰浴2min;然后立即加入0.8mL LB培養(yǎng)基，37°C水浴振蕩培養(yǎng)45min,取200 μ L涂于含(X-gal/IPTG/Kan)的培養(yǎng)基上，置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。 次日挑取單個(gè)白色菌落接種于5mLLB(含50yg/mLKan)中，37°C水浴振蕩培養(yǎng)18h后 進(jìn)行質(zhì)粒抽提。2.1.8質(zhì)粒的抽提按北京賽百盛基因技術(shù)有限公司質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行，回收產(chǎn)物貯存 于-20°C保存?zhèn)溆谩?.1.9重組質(zhì)粒的PCR和酶切鑒定將上一步抽提的重組質(zhì)粒命名為pMD18_UL51，分別以EcoRl/XhoI雙酶切消化
與Xho I單酶切消化，1.0%凝膠電泳觀察結(jié)果。同時(shí)做PCR擴(kuò)增目的基因。
權(quán)利要求
1.基于抗重組UL51蛋白抗體的膠體金試紙，由底板、硝基纖維膜、樣品墊、金標(biāo)墊 和吸收墊組成，硝基纖維膜上有測試線和對(duì)照線，其特征在于所述硝基纖維膜上的測 試線由濃度大于或等于lmg/mL的A抗重組UL51蛋白抗體IgG包被而成，對(duì)照線由濃 度大于或等于lmg/mL C抗B IgG包被而成；所述金標(biāo)墊由膠體金標(biāo)記濃度大于或等于 2mg/mL的B抗重組UL51蛋白抗體IgG包被而成；所述A抗重組UL51蛋白抗體IgG 為免疫學(xué)研究中常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中除鴨外的任一種動(dòng)物抗重組UL51蛋白抗體IgG，所述B 抗重組UL51蛋白抗體IgG為免疫學(xué)研究中常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中除A外的任一種動(dòng)物抗重組 UL51蛋白抗體IgG，所述C抗B IgG為免疫學(xué)研究中常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中除A和B外的任一 種動(dòng)物抗B IgG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于抗重組UL51蛋白抗體的膠體金試紙，其特征在于所 述A抗重組UL51蛋白抗體IgG中的A為鼠抗重組UL51蛋白抗體IgG，所述B抗重組 UL51蛋白抗體IgG為兔抗重組UL51蛋白抗體IgG，所述C抗B IgG為羊抗兔IgG。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于抗重組UL51蛋白抗體的膠體金試紙，其特征在于所 述硝基纖維膜上的測試線由濃度等于lmg/mL的A抗重組UL51蛋白抗體IgG包被而成， 對(duì)照線由濃度等于lmg/mL C抗B IgG包被而成；所述金標(biāo)墊包由膠體金標(biāo)記濃度等于 2mg/mL的B抗重組UL51蛋白抗體IgG包被而成。
4.權(quán)利要求1所述的基于抗重組UL51蛋白抗體的膠體金試紙的制作方法，其特征在 于具體步驟為a硝基纖維膜上測試線和對(duì)照線的噴制將濃度大于或等于lmg/mL的A抗重組 UL51蛋白抗體IgG噴點(diǎn)于硝基纖維膜上形成測試線，將濃度大于或等于lmg/mLC抗B IgG噴點(diǎn)于硝基纖維膜上形成對(duì)照線，干燥后低溫密封保存?zhèn)溆?；b金標(biāo)墊的制備將玻璃纖維素膜浸于膠體金標(biāo)記濃度大于或等于2mg/mL的B抗重 組UL51蛋白抗體IgG中，再將該膜浸于玻璃纖維素膜處理液中封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)， 干燥后得金標(biāo)墊；c膠體金免疫層析試紙條的組裝分別將硝基纖維膜、樣品墊、金標(biāo)墊和吸收墊依次 粘在所述底板上，硝基纖維膜上所述對(duì)照線靠近吸收墊端，所述測試線靠近樣品墊端， 再切割成一定寬度的試紙條，密封包裝，干燥低溫保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于抗重組UL51蛋白抗體的膠體金試紙的制作方法，其特 征在于所述測試線與所述對(duì)照線的距離為0.7厘米，所述測試線與所述對(duì)照線距硝基纖 維膜的邊距分別為0.9厘米。
6.權(quán)利要求1所述的基于抗重組UL51蛋白抗體的膠體金試紙?jiān)谥苽澍單敛《究乖瓩z 測試紙中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于抗重組UL51蛋白抗體的膠體金試紙，其由吸收墊、底板、硝基纖維膜、金標(biāo)墊和樣品墊組成，所述硝基纖維膜上的測試線由濃度≥1mg/mLA動(dòng)物抗重組UL51蛋白抗體IgG包被而成，所述金標(biāo)墊由濃度≥2mg/mL膠體金標(biāo)記B動(dòng)物抗重組UL51蛋白抗體IgG包被而成，所述硝基纖維膜上的對(duì)照線由濃度≥1mg/mL C動(dòng)物抗B動(dòng)物IgG包被而成；所述膠體金試紙的制備方法包括硝基纖維膜上測試線和對(duì)照線噴制、金標(biāo)墊制備及膠體金免疫層析試紙條的組裝；本試紙用于檢測鴨瘟病毒抗原的檢測靈敏度和特異性高，本制備方法操作簡單實(shí)用，本運(yùn)用首次將抗重組UL51蛋白抗體制備成膠體金試紙用于檢測鴨瘟病毒抗原。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102012428SQ20101029952
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月30日
發(fā)明者汪銘書, 沈嬋娟, 程安春, 陳孝躍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工程技術(shù)中心