專利名稱：一種K-ras基因12密碼子突變的雙熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地講，涉及一種κ-ras基因12密碼子突變的雙熒 光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法，及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
K-ras基因(GenBank:NC_000012)突變?cè)谝认侔┑陌l(fā)生發(fā)展中起重要作用。已 報(bào)道，在胰腺癌組織、胰液或糞便、血液中可檢測(cè)出K-ras基因第12、13或61密碼子點(diǎn) 突變(0MJCM Takahashi, et al. Spontaneous rupture of a biliary diverticulum in the distal common bile duct, with formation of a retroperitoneal biloma, Gastrointestinal Endo 2005 ；61 :76-9 ；Laghi L,et al. Common occurrence of multiple K-RAS mutations in pancreatic cancers with associated precursor lesions and in biliary cancers, Oncogene 2002 ；21 :4301-6 ；Tada Μ, et al. Detection of ras gene mutations in pancreatic juice and peripheral blood of patients with pancreatic adenocarcinoma, Cancer Res 1993 ；53 :2472-4 ；Lu XH, et al. An application value of detecting K~ras and p53 gene mutation in the stool and pure pancreatic juice for diagnosis of early pancreatic cancer, Natl Med J China 2001 ；81 :1050-3 ；N van Heek, et al. Comparison of the novel quantitative ARMS assay and an enriched PCR-ASO assay for K_ras mutations with conventional cytology on endobiliary brush cytology from 312 consecutive extrahepatic biliary stenoses, J. Clin. Pathol. 2005；58 ；1315-1320)。研究表明，檢測(cè)體細(xì)胞DNA中K-ras基因突變與否可作為胰腺癌早期診斷的一種 方法。但在一些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)慢性胰腺炎及膽道結(jié)石等良性疾病中也存在K-ras基因突變， 單純定性分析，特異性較差，定量分析能更好反映突變程度，以便于良惡性鑒別。目前普遍 應(yīng)用的κ-ras基因突變檢測(cè)方法為限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(RFIi^i)和擴(kuò)增受阻突 變體系法(ARMS法)。RFLP法原理是將PCR與限制性酶切相結(jié)合的方法。第一步PCR引物(K1-上游 5' -CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT-3'與K2-下游5' -TCAAAGAATGGTCCTGGACC-3 ‘)通過(guò)單一堿基錯(cuò)配，在 Κ-ras 基因 第12密碼子上游引入BstNI酶切位點(diǎn)，第一步PCR反應(yīng)中野生型與突變型基因同比擴(kuò)增， 之后內(nèi)切酶BstNI破壞了野生型片斷，在第二步PCR時(shí)主要就只能擴(kuò)增突變型基因片斷，使 突變型基因片斷“信號(hào)放大”，從而提高了檢測(cè)基因突變的敏感性。該方法的缺點(diǎn)是1.步 驟煩瑣，需要2天時(shí)間才能完成鑒定；2.這種方法只能作定性研究，即只能明確是否存在 K-ras基因突變，若要求定量，則需用其他的方法進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)；3.存在第一輪酶切不完 ^:^ 白勺fiP日個(gè)生(0MJCM Watanabe H, et al. Detection of K-ras point mutations at codon 12 in pure pancreatic juice for the diagnosis of pancreatic cancer byPCR-RFLP analysis, Pancreas 1996;12:18-24)。ARMS法原理是根據(jù)3'端錯(cuò)配原則，在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，若3‘端堿基對(duì)形成錯(cuò) 配，鏈延伸反應(yīng)就會(huì)因3' ,5' 二磷酸二酯鍵形成的障礙而受阻，因此，只有模板鏈?zhǔn)翘囟?的等位基因時(shí)，才會(huì)檢測(cè)出特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。在ARMS的反應(yīng)體系中，引物上標(biāo)記2個(gè)不同熒 光素，或加入熒光探針等方法都是以實(shí)時(shí)熒光PCR為基礎(chǔ)的基因分型方法。該方法的缺點(diǎn) 是1.每種特異性引物或探針只能針對(duì)某一種基因突變類型進(jìn)行鑒定，而K-ras基因在第 12、13密碼子的突變類型可有十余種，需要逐一檢測(cè)；2.可能出現(xiàn)由于單一堿基錯(cuò)配造成 的假陽(yáng)性(參見(jiàn)文獻(xiàn) Fox JC, et al. The detection of K_ras mutations in colorectal cancer using the amplification-refractory mutation system,Br J Cancer 1998 ；77 1267-74)。肽核酸是一種DNA類似物，其骨架由2-氨乙基甘氨酸取代了 DNA的磷酸二酯糖， 其較之傳統(tǒng)DNA探針具有不少優(yōu)點(diǎn)1. PNA十分穩(wěn)定，正確配對(duì)的DNA/PNA的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高 于相應(yīng)的DNA/DNA，同時(shí)在PCR反應(yīng)過(guò)程中PNA不可作為T(mén)aq酶的底物，亦不會(huì)被其他酶所 降解。2.對(duì)于錯(cuò)配的PNA/DNA，哪怕只有一個(gè)堿基的錯(cuò)配，也會(huì)造成其融解溫度下降9-10°C 左右。目前，肽核酸作為一種非常有用分子生物學(xué)工具已在疾病的診斷、治療等領(lǐng)域得到應(yīng) 用(參見(jiàn)文獻(xiàn)張兵波等，PNA探針與DNA探針的系統(tǒng)比較A Systemic Comparison between PNA Probe and DNA Probe，《高分子通報(bào)》2006 ；9 :62-68 ；Egholm M，et al. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules, Nature,1993，365 :566 568.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種既能定性并定量檢測(cè)K-ras基因12密碼子突變，又能分 辨κ-ras基因12密碼子突變不同類型的雙熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法，及其應(yīng)用。基于背景技術(shù)中肽核酸作為DNA探針的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明將其與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié) 合，針對(duì)于不同性質(zhì)的K-ras基因12密碼子突變分別設(shè)計(jì)由FAM和VIC兩種熒光標(biāo)記的 Taqman MGB探針，應(yīng)用于K_ras基因檢測(cè)，并且可分辨K_ras基因12密碼子突變的不同類 型。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種K-ras基因12密碼子突變的雙 熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法，包括如下步驟設(shè)計(jì)針對(duì)野生型κ-ras基因特定密碼子 的PNA，設(shè)計(jì)針對(duì)于不同性質(zhì)的κ-ras基因突變分別設(shè)計(jì)FAM和VIC熒光標(biāo)記的Taqman MGB 探針；利用PNA及探針，對(duì)已知突變量的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線； 提取、純化樣品DNA，測(cè)定濃度，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及FAM和VIC熒光 的類別，借以判別K-ras基因突變量和突變類型。其中所述PNA 為 NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-C00H(SEQ ID NO 1)；其中所述的K-ras-FAM Tagman MGB 探針和 K-ras-VIC Tagman MGB 探針為FAM_ CTACGCCADCAGCTCCAACT-MGB(FAM-SEQ ID NO :2_MGB)和 VIC-CTACGCCACDAGCTCCAACT-MGB( VIC-SEQ ID NO :3_MGB)；其中所述的PCR引物為上游引物F:5' -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3 ‘ (SEQ ID NO 4)；
下游引物R:5' -TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3‘ (SEQ ID NO 5)。其中所述的樣品DNA取自糞便、血液、組織液、細(xì)胞株或組織。本發(fā)明還提供了上述K-ras基因12密碼子突變的雙熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量檢測(cè) 方法在制備胰腺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。該試劑盒包括分別裝有核酸擴(kuò)增體系反應(yīng)液、熒光監(jiān)測(cè)體系反應(yīng)液、 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品等，并加蓋密封的試劑管/瓶；其中核酸擴(kuò)增體系反應(yīng)液中的PNA為 NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-C00H ；PCR 上游引物為 5 ‘ -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3 ‘； PCR下游引物為5 ‘ -TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3 ‘；熒光監(jiān)測(cè)體系反應(yīng) 液中的 K-ras-FAMI^agman MGB 探針和 K-ras-VIC Tagman MGB 探針?lè)謩e為 FAM-CTACGCCADCAGCTCCAACT-MGB 和 VIC-CTACGCCACDAGCTCCAACT-MGB。本發(fā)明采用聯(lián)合肽核酸(PNA)的實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)K_ras基因12密碼子點(diǎn)突 變量和突變類型。所述K-ras基因可以是從糞便、組織、組織液、細(xì)胞珠及血液中提取的DNA 中的基因。因?yàn)镻NA同時(shí)覆蓋了 K-ras基因第一外顯子中第12、13密碼子的6個(gè)堿基，任 一突變均可導(dǎo)致PNA/DNA的錯(cuò)配，使得融解溫度發(fā)生明顯改變，故只需設(shè)計(jì)一種針對(duì)野生 型的PNA，進(jìn)行一次PCR反應(yīng)，即可區(qū)分野生型與突變型。因此本發(fā)明是一種操作簡(jiǎn)便、敏感 性高、特異性高的K-ras基因?qū)崟r(shí)定量檢測(cè)方法，可實(shí)時(shí)定量檢測(cè)K-ras基因12密碼子突 變量和突變類型，并可用于胰腺癌等疾病的診斷。


圖1是K-ras-FAM Tagman MGB探針敏感性和特異性的結(jié)果。圖2是K-ras-VIC Tagman MGB探針敏感性和特異性的結(jié)果。圖3是K-ras基因12密碼子突變的雙熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲 線，其中橫坐標(biāo)為拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值；縱坐標(biāo)為:Ct值；Slope :-4.2 ;InterC印00; R2 :0.999。圖4是胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群K-ras基因突變率的比較。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例以在胰腺癌患者 K-ras基因的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)為例，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。應(yīng)理解，該實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例11.主要試劑來(lái)源1. 1 設(shè)計(jì) PNAPNA是針對(duì)野生型K-ras基因第12、13密碼子設(shè)計(jì)的PNA，由韓國(guó)panagene公司 合成，其組成為NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-C00H。1. 2 設(shè)計(jì) Tagman MGB 探針K-ras-FAM Tagman MGB 探針禾口 K-ras-VIC Tagman MGB 探針由美國(guó) AppliedBiosystems公司合成，其組成分別為K-ras-FAM Tagman MGB 探針5
FAM-CTACGCCADCAGCTCCAACT-MGB ；K-ras-VIC Tagman MGB 探針VIC-CTACGCCACDAGCTCCAACT-MGB。1.3PCR 引物PCR引物由美國(guó)AppliedBiosystems公司合成。上游引物F 5 ‘ -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3 ‘；下游引物R 5 ‘ -TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3 ‘。1. 4 TaqMan Gene Expression Master Mix購(gòu)買(mǎi)于美國(guó) AppliedBiosystems 公司。1. 5 K-ras基因野生型和突變型標(biāo)準(zhǔn)品K-ras基因野生型標(biāo)準(zhǔn)品GGT和K_ras基因突變型標(biāo)準(zhǔn)品GAT、GCT、GTT、AGT、CGT、 TGT由上海hvitrogen公司合成，其基因序列組成分別為1. 5. IGGT 野生型ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO 6)；1. 5. 2GAT 突變型ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ IDNO 7)；1.5. 3GCT 突變型ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGCTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO 8)；1. 5. 4GTT 突變型ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ IDNO 9)；1. 5. 5AGT 型突變ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO :10)；1. 5. 6CGT 型突變ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTCGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO :11)；1. 5. 7TGT 型突變ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT6
TGGAGCTTGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ IDNO :12)。
將模板倍比稀釋為106、105、104、103、102、10\0拷貝，作為標(biāo)準(zhǔn)品模板。2. ITaqMan MGB探針實(shí)時(shí)定量實(shí)驗(yàn)該方法選用針對(duì)K-ras基因靶序列的特異性Taqman MGB探針。K-ras-FAM Tagman MGB探針兩端分別以報(bào)告基團(tuán)FAM及淬滅基團(tuán)MGB標(biāo)記，其特異性和K-ras基因12密碼子 GAT、GCT、GTT等三種突變類型相結(jié)合；K-ras-VIC Tagman MGB探針兩端分別以報(bào)告基團(tuán) VIC及淬滅基團(tuán)MGB標(biāo)記，其特性性和K-ras基因12密碼子AGT、CGT、TGT等三種突變類型 相結(jié)合。同樣地，實(shí)驗(yàn)中PNA能將野生型基因完全抑制，因此儀器所檢測(cè)的熒光量可反應(yīng)突 變基因的拷貝量。該方法特異性高，由于不受引物二聚體影響，定量將更加準(zhǔn)確。2. 1. 1反應(yīng)體系及反應(yīng)條件儀器選用ABI公司的7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀。B. M W % ^ ^ TaqMan Gene Expression Master Mix 12. 5 μ 1，弓 | · F、 R(序列如 1. 3)0. 5 μ l(5pmol/y 1)，PNAl μ l(10pmol/y 1)，MGB 探針(序列如 1. 2)各 0. 3μ KlOpmol/μ 1), DNA標(biāo)準(zhǔn)品模板為ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、ΙΟ2、101、?？截?，用無(wú)菌雙蒸水定 容至25μ 1。PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性10m，之后95°C變性15s，76°C PNA結(jié)合15s，60°C退火 60s，共50個(gè)循環(huán)。2. 1. 2根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線判定探針的敏感性和特異性根據(jù)PCR標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線檢驗(yàn)K-ras-FAM Tagman MGB探針和K-ras-VIC Tagman MGB探針的敏感性(圖1)和特異性(圖2)。圖1示K-ras-FAM Tagman MGB能夠檢測(cè)出 GAT、GCT、GTT三種K-ras基因12密碼子突變而無(wú)法檢測(cè)出AGT、CGT、TGT其他三種K_ras 基因12密碼子突變。圖2示K-ras-VIC Tagman MGB能夠檢測(cè)出AGT、CGT、TGT三種K-ras 基因12密碼子突變而無(wú)法檢測(cè)出GAT、GCT、GTT其他三種K_ras基因12密碼子突變。由此 可見(jiàn)K-ras-FAM Tagman MGB探針和K-ras-VIC Tagman MGB有較高的特異性和敏感性。2. 1. 3定量方法選用同一系列倍比稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分成兩組，一組標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系中加入FAM 型標(biāo)準(zhǔn)品，另一組加入VIC型標(biāo)準(zhǔn)品。同一待檢模板同時(shí)設(shè)置FAM和VIC兩個(gè)待測(cè)探針為 兩組。反應(yīng)結(jié)束后，利用兩組標(biāo)準(zhǔn)品分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，分別進(jìn)行待檢樣本的定量， 可實(shí)時(shí)定量檢測(cè)K-ras基因12密碼子突變量。2. 1. 4突變類型檢測(cè)方法根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，可得知待測(cè)樣本發(fā)出熒光的不同來(lái)判斷K-ras基 因突變類型。檢測(cè)不到熒光提示GGT野生型K-ras基因；檢測(cè)到FAM熒光提示GAT、GCT、GTT 突變型K-ras基因；檢測(cè)到VIC熒光提示AGT、CGT、TGT突變型K_ras基因。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中收 集到的樣本發(fā)出熒光類型，可分辨K-ras基因的突變類型。3.收集臨床胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人血液，抽提DNA。3. 1標(biāo)本收集胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人，采抗凝全血1ml。3. 2血液DNA抽提方法①、抗凝全血0. 5_12ml ；②、加入500_700ul TT緩沖液，劇 烈振蕩后，低溫離心機(jī)12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；③、收集沉淀。重復(fù)2，3步驟，直至沉淀為 無(wú)色；④、加入200ulPCR裂解液A ；⑤、37°C水浴過(guò)夜；⑥、抽取PCR裂解物(約200ul)，加入200ul酚氯仿，充分混勻后，12000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘；⑦、取上清，加入200ul氯仿充分 混勻，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；⑧、取上清，加入IOOul乙酸銨及2倍體積無(wú)水乙醇(約 700ul)充分混勻，靜置1分鐘后，12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；⑨、棄上清加入lml70%乙醇洗 滌，12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；⑩、棄上清，自然風(fēng)干，用lOOulTE液溶解沉淀，分裝于_80°C保存。3. 3 DNA濃度測(cè)定應(yīng)用NanoDrop ND-1000全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)測(cè)出濃度。3. 4標(biāo)本進(jìn)行K-ras基因的PNA鉗制定量PCR法檢測(cè)按照方法2. 1. 3和2. 1. 4，進(jìn)行K_ras基因的PNA鉗制PCR法定量和突變類型檢 測(cè)。4.結(jié)果分析根據(jù)步驟2. 1. 3所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)樣本K-ras基因突變量。根據(jù)步驟2. 1. 4， 得出待測(cè)樣本本K-ras基因突變類型。經(jīng)過(guò)檢測(cè)及數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，得到胰腺癌、慢性胰腺炎以及正常人群血液中K-ras基因 的突變量。運(yùn)用SPSS18. 0軟件，采用卡方檢驗(yàn)得到胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群各個(gè)兩 組之間均有顯著差異(P<0. 05)，組間的比較如圖4所示。證實(shí)胰腺癌血液中K-ras基因 的突變率高于慢性胰腺炎和正常人群.更進(jìn)一步證實(shí)對(duì)于K-ras基因12密碼子突變的雙 熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量檢測(cè)的方法在現(xiàn)實(shí)實(shí)際中有可操作性，同時(shí)具有科學(xué)性。本實(shí)施例僅以胰腺癌、慢性胰腺炎、正常人群血液為檢測(cè)樣本，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方 案進(jìn)行了驗(yàn)證，但是根據(jù)本發(fā)明的公開(kāi)，也可以采集患者的胰液、糞便、組織、胰腺穿刺物等 為DNA樣本，也同樣運(yùn)用本實(shí)施例公開(kāi)的方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地定量檢測(cè)K-ras基因。
權(quán)利要求
1.一種κ-ras基因12密碼子突變的雙熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法，包括如下步 驟設(shè)計(jì)針對(duì)野生型K-ras基因特定密碼子的PNA，設(shè)計(jì)針對(duì)于不同性質(zhì)的K-ras基因突變 分別設(shè)計(jì)FAM和VIC熒光標(biāo)記的Taqman MGB探針；利用PNA及探針，對(duì)已知突變量的質(zhì)粒 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線；提取、純化樣品DNA，測(cè)定濃度，進(jìn)行實(shí)時(shí)定 量PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及FAM和VIC熒光的類別，借以判別K-ras基因突變量和突 變類型；其中所述PNA如SEQ ID NO 1所示；其中所述的 K-ras-FAM Tagman MGB 探針如 FAM-SEQ ID NO :2_MGB 所示，K-ras-VIC Tagman MGB 探針如 VIC-SEQ ID NO :3_MGB 所示；其中所述的PCR上游引物如SEQ ID NO 4所示，下游引物如SEQ ID NO 5所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的K-ras基因12密碼子突變的雙熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量檢測(cè) 方法，其中所述的樣品DNA取自糞便、血液、組織液、細(xì)胞株或組織。
3.—種如權(quán)利要求1所述的K-ras基因12密碼子突變的雙熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量檢 測(cè)方法在制備胰腺癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。K-ras基因突變?cè)谝认侔┑陌l(fā)生發(fā)展中起重要作用，但目前普遍應(yīng)用的K-ras基因突變檢測(cè)方法為限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析法和擴(kuò)增受阻突變體系法，但兩方法特異性不高，且不能同時(shí)定性和定量檢測(cè)K-ras基因的突變。本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性高的K-ras基因12密碼子突變的雙熒光標(biāo)記探針實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法，該方法設(shè)計(jì)針對(duì)野生型K-ras基因12密碼子的PNA及相應(yīng)的突變檢測(cè)探針K-ras-FAMTagman MGB探針和K-ras-VIC Tagman MGB探針；利用PNA及探針，對(duì)已知突變量的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線和熒光類型；提取、純化樣品DNA，測(cè)定濃度，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和熒光類型，借以判別K-ras基因突變量和突變類型。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102041313SQ20101051212
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者任艷, 李兆申, 王小瑋, 顧俊駿, 高軍, 黃浩杰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)