專利名稱：殼聚糖-量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于納米材料用于標記生物及生物體系的分析檢測技術領域，更具體涉及 一種殼聚糖-量子點熒光探針用于狗腎細胞標記的方法，通過對細胞組分以及亞細胞結構 的標記，可以用于的細胞的生理活動研究，也可用于細胞內(nèi)外各類受體的運輸途徑研究及 外源性污染物與細胞相互作用的研究。
背景技術：
殼聚糖是由甲殼素脫去乙?；漠a(chǎn)物，其大分子鏈上分布著許多羥基和氨基。殼 聚糖除具有多功能性、生物相容性、生物降解性，和低細胞毒性等優(yōu)越性之外，還具有獨特 的跨細胞膜能力。但是由于殼聚糖只溶于稀酸和某些特定的溶劑，大大限制了它的應用。羧 甲基殼聚糖是殼聚糖經(jīng)羧甲基化反應后的形成的一類甲殼素衍生物，由于羧甲基殼聚糖上 所含的-C00-降低了 -NH3+的電荷密度，使得羧甲基殼聚糖的細胞毒性降低，具有比殼聚糖 更好的細胞相容性；并且由于羧甲基殼聚糖溶于水，擴展了它的應用范圍。量子點(Quantum dots, QDs) 又稱半導體納米微晶體(Semiconductor nanocrystals)，是半徑小于或接近于激子玻爾半徑的一類半導體納米粒子。量子點具有一 般納米微粒的基本性質(zhì)如表面效應、體積效應和量子尺寸效應，具有寬的激發(fā)光譜、窄的發(fā) 射光譜、可精確調(diào)諧的發(fā)射波長、可忽略的光漂白等優(yōu)越的熒光特性。正是基于量子點獨特 的光學性質(zhì)使得它在生物化學、分子生物學、細胞生物學、基因組學以及蛋白質(zhì)組學等研究 中有著極大的應用前景。但是作為一種納米材料，由于自身的物理化學性質(zhì)和環(huán)境因素的 影響，量子點在應用的過程中也表現(xiàn)出了一定的生物毒性效應，如何提高量子點熒光探針 的穩(wěn)定性和生物相容性是目前迫切需要解決的問題。狗腎細胞通常用于流感病毒的分離與鑒定，1958年從正常的雄性考克斯班尼犬的 腎臟建立了該細胞系。該細胞系是一種小犬腎細胞，其特點是細胞匯合后表達分化的上皮 細胞特性，易于培養(yǎng)和傳代。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前各類量子點熒光探針在應用上的缺陷，提供了一種殼 聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，把羧甲基殼聚糖良好的細胞相容性和量子點 優(yōu)越的熒光性能結合起來，利用它們在水相通過自組裝形成熒光探針，然后用于細胞標記。 用熒光顯微鏡觀察狗腎細胞的標記情況，用流式細胞儀檢測培養(yǎng)皿中狗腎細胞的平均熒光 強度。本發(fā)明操作簡便，熒光效率高、生物相容性好、穩(wěn)定時間長，熒光探針無細胞毒性，可 用于細胞的長時間的觀測。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術措施
本發(fā)明的基本構思是根據(jù)羧甲基殼聚糖和CdTe量子點自身的特性，在水相通過自組 裝形成殼聚糖_量子點熒光探針，將該熒光探針與狗腎細胞在DMEM營養(yǎng)液中、于37°C、5% 體積分數(shù)的CO2細胞培養(yǎng)箱(下同)中共同孵育，殼聚糖_量子點熒光探針通過狗腎細胞的
3胞飲、胞吞或吞噬等方式進入細胞內(nèi)部，與細胞中的蛋白質(zhì)結合，達到對狗腎細胞進行熒光 標記的目的?！N殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，包括如下步驟
1、配制0.0000025-0. 001mol/L的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液(羧甲基殼聚 糖-CdTe量子點自制，制備的簡要過程如下=CdCl2溶液和巰基乙酸溶液混合均勻后用NaOH 溶液調(diào)整其PH值為堿性，再向該溶液中加入新制備的KTeH4溶液。將此混合液轉入聚四 氟乙烯微波消解罐，放入可控溫的微波加熱系統(tǒng)進行加熱，反應完成后待溶液冷卻至室溫 20-25°C，即可得到CdTe量子點溶液。根據(jù)微波加熱的溫度不同，CdTe量子點的熒光將 會由綠色逐漸變化為紅色。將不同顏色的CdTe量子點與羧甲基殼聚糖溶液混合反應即 可生成相應熒光的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針，本領域的普通技術人員不付出任 何創(chuàng)造性勞動均能制備)根據(jù)羧甲基殼聚糖-CdTe量子點的濃度，用移液管移取0.廣5ml 的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于滅菌的IOml容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 ΜΩ 定容，備用；所選用的殼聚糖-量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點 在水相反應形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2、將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細胞(MDCK)用0.05%體積比的 EDTA-胰蛋白酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數(shù)后取1 X IO4^l X IO7的狗腎細胞接種到到細 胞培養(yǎng)皿中，加入含10%體積比的胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2細胞 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞正常貼壁生長繁育，得到用于實施標記的狗腎細胞。3、待步驟2狗腎細胞貼壁生長12 36小時后，向培養(yǎng)皿中加入殼聚糖-量子點熒 光探針，于37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中與細胞共同孵育6 48小時，即可得到帶有 熒光的狗腎細胞。棄去營養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液(PH=7. 4)洗滌2次，即可用熒光顯微鏡 觀察標記情況。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡合、共價結合、螯合方式自組裝形成。所述的標記的細胞為狗腎細胞。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果
本發(fā)明的殼聚糖-量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法操作簡便，細胞對熒光探 針的生物相容性好，熒光探針未顯示細胞毒性，標記后細胞的平均熒光強度及顏色可控，穩(wěn) 定時間長，不影響細胞的正常生長。細胞能夠根據(jù)需要標記為不同的顏色且細胞的熒光強 度穩(wěn)定。該方法可用于活細胞的較長時間(48小時)觀測及細胞的生理活動研究，也可用于 細胞內(nèi)外各類受體的運輸途徑研究及外源性污染物與細胞相互作用的研究。


圖IA為綠色殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的熒光顯微鏡照片示意圖。圖IB為紅色殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的熒光顯微鏡照片示意圖。圖2A為未標記時狗腎細胞的生長狀況明場照片示意圖。圖2B為標記12小時后狗腎細胞的生長狀況明場照片示意圖。圖2C為標記24小時后狗腎細胞的生長狀況明場照片示意圖。圖2D為標記48小時后狗腎細胞的生長狀況明場照片示意圖。
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圖2E為殼聚糖_量子點熒光探針進入狗腎細胞的不同階段(從1到4顯示的是熒 光探針剛進入細胞到充滿整個細胞的過程)熒光照片示意圖。圖2F為殼聚糖_量子點熒光探針進入狗腎細胞的不同階段(從1到4顯示的是熒 光探針剛進入細胞到充滿整個細胞的過程)明場照片示意圖。圖3A為流式細胞儀檢測未標記時狗腎細胞的平均熒光強度示意圖(陰性對照)。圖3B為流式細胞儀檢測用0. 00005mol/L的熒光探針標記狗腎細胞后細胞的平均 熒光強度示意圖。圖3C為流式細胞儀檢測用0. 0001mol/L的熒光探針標記狗腎細胞后細胞的平均
熒光強度示意圖。圖3D為流式細胞儀檢測用0. 00025mol/L的熒光探針標記狗腎細胞后細胞的平均
熒光強度示意圖。圖3E為流式細胞儀檢測用0. 0005mol/L的熒光探針標記狗腎細胞后細胞的平均
熒光強度示意圖。圖3F為流式細胞儀檢測用0. OOlmol/L的熒光探針標記狗腎細胞后細胞的平均熒
光強度示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍，以下所述實施實例所用溶劑均為電阻率大于18 ΜΩ · cm的高純水，所用試劑均為分析純試劑。實施例1
一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，包括如下步驟 1.配制0. 0005mol/L的綠色和紅色羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液 分別用移液管移取2. 5mL0. 002mol/L的綠色和紅色羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于 滅菌的IOmL容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 ΜΩ · cm)定容，備用。所選用的殼聚 糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡合、共價結合、螯 合作用等方式自組裝形成，具有良好的水溶性和生物相容性；(羧甲基殼聚糖-CdTe量子點 自制，制備的簡要過程如下=CdCl2溶液和巰基乙酸溶液混合均勻后用NaOH溶液調(diào)整其pH 值為堿性，再向該溶液中加入新制備的KTeH4溶液。將此混合液轉入聚四氟乙烯微波消解 罐，放入可控溫的微波加熱系統(tǒng)進行加熱，反應完成后待溶液冷卻至室溫20-25°C，即可得 到CdTe量子點溶液。根據(jù)微波加熱的溫度不同，CdTe量子點的熒光將會由綠色逐漸變化 為紅色。將不同顏色的CdTe量子點與羧甲基殼聚糖溶液混合反應即可生成相應熒光的羧 甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針，本領域的普通技術人員不付出任何創(chuàng)造性勞動均能制
2.狗腎細胞的培養(yǎng)
將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數(shù)后取1 X IO6的狗腎細胞分別接種到2個細胞培養(yǎng)皿中， 加入含10%體積比的胎牛血清的DMEM(美國Gbico公司)營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。得到用于實施熒光標記的狗腎細胞。
3.羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針對狗腎細胞的標記
待步驟2所述的狗腎細胞貼壁生長18小時后，向培養(yǎng)皿中分別加入步驟1所述的綠色 和紅色殼聚糖_量子點熒光探針，于37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中與細胞共同孵育， 24小時后棄去營養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(pH=7. 4)洗滌2次，用熒光顯微鏡觀察標記情況，結 果表明狗腎細胞已成功標記上綠色和紅色熒光(見圖IA和圖1B)。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡合、共價結合、螯合方式自組裝形成。所述的標記的細胞為狗腎細胞。實施例2:
一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其步驟如下
1.配制0.0001mol/L的的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液
用移液管移取0. 5mL0. 002mol/L的黃綠色羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于滅菌的 IOmL容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 M Ω · cm)定容，備用。所選用的殼聚糖-量子 點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡合、共價結合、螯合作用等 方式自組裝形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2.狗腎細胞的培養(yǎng)
將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數(shù)后取1 X IO5的狗腎細胞接種到細胞培養(yǎng)皿中，加入含10% 胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到用于實施熒光 標記的狗腎細胞。3.羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針對狗腎細胞標記后形態(tài)學觀察 待步驟2所述的狗腎細胞貼壁生長28小時后，向培養(yǎng)皿中加入步驟1所述的殼聚
糖_量子點熒光探針，于37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中與細胞共同孵育。于0、12、 24,48小時用顯微鏡觀察細胞生長情況，結果表明標記后的狗腎細胞在(Γ48小時的時間內(nèi) 均能正常貼壁生長，沒有出現(xiàn)溶脹、脫落及凋亡，說明細胞對熒光探針的生物相容性良好， 熒光探針未顯示細胞毒性(見圖2A、2B、2C、2D、2E、2F)。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡合、共價結合、螯合方式自組裝形成。所述的標記的細胞為狗腎細胞。其它步驟與實施例1相同。實施例3
一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其步驟如下
1.配制0、0· 00005,0. 0001,0. 00025,0. 0005,0. 001mol/L 的的羧甲基殼聚糖-CdTe 量 子點溶液
用移液管移取0、0. 25,0. 5,1. 25,2. 5、5mL0. 002mol/L的黃綠色羧甲基殼聚糖-CdTe量 子點溶液于滅菌的IOmL容量瓶中，加入高純水(電阻率大于18 ΜΩ 定容，備用。所選 用的殼聚糖-量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡合、共價 結合、螯合作用等方式自組裝形成，具有良好的水溶性和生物相容性；
2.狗腎細胞的培養(yǎng)
6將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿且生長狀態(tài)良好的狗腎細胞(MDCK)用0. 05%EDTA-胰蛋白 酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數(shù)后取1 X IO7的狗腎細胞分別接種到6個細胞培養(yǎng)皿中， 加入含10%胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液。在37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到用 于實施熒光標記的狗腎細胞。3.羧甲基殼聚糖-CdTe量子點熒光探針對狗腎細胞標記后細胞顯示不同的平均 熒光強度；
待步驟2所述的狗腎細胞貼壁生長24小時后，向培養(yǎng)皿中分別加入步驟1所述的殼 聚糖_量子點熒光探針，于37°C、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中與細胞共同孵育，同時做陰 性對照。24小時后棄去營養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖溶液(pH=7. 4)洗滌2次，用0. 05%EDTA_胰蛋 白酶將培養(yǎng)皿上的細胞消化為單細胞懸浮液，置于載玻片上用熒光顯微鏡觀察標記情況， 同時用流式細胞儀檢測不同培養(yǎng)皿中狗腎細胞的平均熒光強度。結果表明狗腎細胞已成功 標記上熒光，并顯示出不同的熒光強度，隨熒光探針濃度的增加，細胞平均熒光強度由50 a. u.變化到5000 a. u.(見圖3A、3B、3C、3D、3E、3F)，說明可以通過改變熒光探針的濃度來 控制標記后細胞的熒光強度。所述的殼聚糖_量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜 電絡合、共價結合、螯合方式自組裝形成。所述的標記的細胞為狗腎細胞。其它步驟與實施例1相同。
權利要求
一種殼聚糖 量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其步驟是A、配制0.0000025 0.001mol/L的羧甲基殼聚糖 CdTe量子點溶液根據(jù)羧甲基殼聚糖 CdTe量子點的濃度，用移液管移取0.1~5ml的羧甲基殼聚糖 CdTe量子點溶液于滅菌的10ml容量瓶中，加入高純水，電阻率大于 18 MΩ·cm，定容，備用；B、將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿的狗腎細胞用0.05%體積比的EDTA 胰蛋白酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數(shù)后取1×104~1×107的狗腎細胞接種到到細胞培養(yǎng)皿中，加入含10%體積比的胎牛血清的DMEM營養(yǎng)液，在37℃、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細胞正常貼壁生長繁育，得到用于實施標記的狗腎細胞；C、待步驟(B)狗腎細胞貼壁生長12~36小時后，向培養(yǎng)皿中加入殼聚糖 量子點熒光探針，于37℃、5%體積比的CO2細胞培養(yǎng)箱中與細胞共同孵育6~48小時，得到帶有熒光的狗腎細胞，棄去營養(yǎng)液，用pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，用熒光顯微鏡觀察標記情況。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其特征 在于所述的殼聚糖-量子點熒光探針是由羧甲基殼聚糖和CdTe量子點在水相通過靜電絡 合、共價結合、螯合方式自組裝形成。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其特征 在于所述的標記的細胞為狗腎細胞。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種殼聚糖_量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其特征 在于所述的羧甲基殼聚糖-CdTe量子點制備過程如下，CdCl2溶液和巰基乙酸溶液混合 均勻后用NaOH溶液調(diào)整其pH值為堿性，再向該溶液中加入新制備的KTeH4溶液，將此混 合液轉入聚四氟乙烯微波消解罐，放入可控溫的微波加熱系統(tǒng)進行加熱，反應完成后待溶 液冷卻至室溫，得到CdTe量子點溶液，將其與羧甲基殼聚糖溶液混合反應生成羧甲基殼聚 糖-CdTe量子點。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殼聚糖-量子點熒光探針標記狗腎細胞的方法，其步驟是A、配制羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液根據(jù)羧甲基殼聚糖-CdTe量子點的濃度，用移液管移取羧甲基殼聚糖-CdTe量子點溶液于滅菌的容量瓶中，加入高純水定容；B、將T25細胞培養(yǎng)瓶中已長滿的狗腎細胞用EDTA-胰蛋白酶消化為單細胞懸浮液，細胞計數(shù)后取狗腎細胞接種到到細胞培養(yǎng)皿中，加入營養(yǎng)液，培養(yǎng)；C、待狗腎細胞貼壁生長后，向培養(yǎng)皿中加入殼聚糖-量子點熒光探針，與狗腎細胞共同孵育，得到已標記上熒光的狗腎細胞。本發(fā)明操作簡便，熒光效率高、生物相容性好、穩(wěn)定時間長，熒光探針無細胞毒性，可用于細胞的長時間的觀測。
文檔編號G01N21/64GK101980005SQ201010512868
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權日2010年10月20日
發(fā)明者何振宇, 周培疆, 朱洪浩 申請人:武漢市疾病預防控制中心;武漢大學