專利名稱：替代模板法制備拉米夫定分子印跡固相萃取柱及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物分析領(lǐng)域，具體地說是涉及一種拉米夫定分子印跡固相萃取 (MISPE)柱及制備方法，并主要用于生物樣品中拉米夫定的高選擇性分離、富集和純 化。
背景技術(shù)：
拉米夫定(3TC)，化學(xué)名為(2R-順式)_4氨基-l-(2-羥甲基1，3_氧硫雜交環(huán) 戊-5基)IH-嘧啶-2酮。1995年被FDA批準(zhǔn)用于治療HIV感染，拉米夫定抗病毒作 用強，且能提高機體免疫能力[葉金朝.抗免疫缺陷病毒藥-拉米夫定.國外醫(yī)藥合成 藥、生化藥、制劑分冊，1998，19(2) 83 84]。由于生物樣品中許多內(nèi)源性物質(zhì)的存在，使得樣品凈化成為必要步驟。目前， 生物樣品中的拉米夫定前處理手段較多，如溶劑萃取和固相萃取法，結(jié)合高效液相色譜 法。溶劑萃取法需要大量的有機溶劑，耗時且存在嚴(yán)重的基體干擾，其它方法的儀器昂 貴。固相萃取法(SPE)出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，至今已成為許多領(lǐng)域樣品預(yù)處理的常用 方法。傳統(tǒng)的SPE吸附劑選擇性不佳，在富集分析物過程中存在大量基體和干擾物質(zhì)。 因此，發(fā)展快速、高效、高選擇性、環(huán)境友好的樣品前處理技術(shù)非常重要[中國科學(xué)B 輯化學(xué)，2009，39(8) 733]。分子印跡聚合物(MIP)是為模板分子量身定做的高分 子聚合物，具有預(yù)定性、實用性和識別性等特點[Chemistry of Materials，2008，20(3) 859 ； AnaLChem., 2009，81(4) 1615]。由于模板選擇的多樣性，使得MIP能廣泛應(yīng)用 于物質(zhì)的分離與分析過程，它對于目標(biāo)物質(zhì)的高度選擇性也是普通SPE填料所不能比擬 的[分析化學(xué)，2007，35(9) 1319 ； Analytical Letters, 2009，42(3) 600]。目前關(guān)于 拉米夫定MISPE柱的制備未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種拉米夫定MISPE柱及制備方 法和應(yīng)用，以高效地選擇性分離富集血清、血漿等生物樣品提取液中的拉米夫定，結(jié)合 光度法或高效液相色譜即可實現(xiàn)生物樣品中拉米夫定的快速分析。為實現(xiàn)上述目的，本 發(fā)明以拉米夫定為模板，衣康酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，以N， N-二甲基甲酰胺為致孔劑，偶氮二乙丁腈為引發(fā)劑，進(jìn)行聚合制備出MIP后，填充在固 相萃取柱內(nèi)得拉米夫定MISPE柱。儀器與試劑UV-2450紫外可見分光光度計、LOlOA高效液相色譜儀(日本島津公司)； Inertsil ODS-SP (5 μ m，4.6 X 250mm) C18 色譜柱；Humanpowerlll 超純水處理器(韓 國)；HC-2518微量高速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器)；5S1020固相萃取儀(北京振 翔工貿(mào)有限公司)。乙腈、無水乙醇、乙醚、二氯甲烷、四氯化碳、正庚烷、甲醇、磷酸二氫鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、三水合醋酸鈉均為市售分析純。三甲氧基丙烷三 甲基丙烯酸酯(TRIM，東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn))，偶氮二乙丁腈(AIBN，化學(xué)純， 上海試劑廠)。齊多夫定(AZT)、拉米夫定、奈韋拉平(NEV)為原料藥(杭州大陽化工 有限公司生產(chǎn))。
四

附圖1為拉米夫定溶液在MIP與非印跡聚合物(NIP)上的吸附量隨濃度變化曲線。附圖2為0.5mg/L拉米夫定溶液HPLC圖2a為拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)品溶液；2b為拉 米夫定血清提取液_未經(jīng)過MISPE柱；2c為拉米夫定血清提取液-經(jīng)過MISPE柱。
五具體實施例方式A)拉米夫定酯化物(3TC-ES)的合成將吡啶2.4mL和拉米夫定l.Og置于反 應(yīng)瓶中，充分溶解后加入醋酸酐2mL，于室溫下攪拌2小時后蒸出溶劑及未反應(yīng)完的醋 酸酐，將得到白色粗產(chǎn)物用氯仿溶解，用水萃取，收集氯仿層，水層繼續(xù)用氯仿提取3 次，合并氯仿溶液，蒸除氯仿，得到白色固體，將白色固體用乙醇重結(jié)晶，得到白色的 絮狀拉米夫定酯化產(chǎn)物；B)將模板、功能單體、交聯(lián)劑、按Immol 4mmol 20mmol的配比和引發(fā)劑 40mg、致孔劑氯仿16mL —起置于50mL圓底燒瓶中，充分溶解混勻，超聲脫氣5min， 通氮氣15min，于45°C恒溫油浴鍋中加熱24h。C)將步驟B)制備的聚合物磨碎成粉末，粉末過篩，收集粒徑在38 75 μ m的 聚合物，用索氏提取器以含冰乙酸-甲醇(1 9，V/V)溶液洗至無拉米夫定檢出，繼續(xù) 用甲醇洗去乙酸，最后真空干燥至恒重，得拉米夫定MIP顆粒。D)稱取IOOmg上述拉米夫定MIP顆粒，均勻填充至空的固相萃取柱中，在聚合 物上放置聚乙烯塞板，制得本發(fā)明的拉米夫定MISPE柱。選取與3TC-ES具有不同結(jié)構(gòu)類似程度的3TC、AZT以及NEV，考察它們在 3TC-ES分子印跡及非印跡聚合物材料所裝填的固相萃取柱上的保留和被分離情況。萃 取柱對NEV基本沒有保留能力，直接發(fā)生穿漏；AZT雖然在萃取柱上有一定吸附，但被 吸附的部分在經(jīng)過除雜和洗脫后就全部脫落。這說明兩種物質(zhì)都與固相萃取柱結(jié)合比較 弱。實驗表明，與模板分子結(jié)構(gòu)類似程度最高的3TC全部被萃取柱保留。表各化合物MISPE上的回收率(％ )
權(quán)利要求
1.一種拉米夫定分子印跡固相萃取(MISPE)柱，其特征是固相萃取柱中填充有拉米 夫定分子印跡聚合物(MIP)顆粒。
2.如權(quán)利要求1所述的拉米夫定MISPE柱，其特征在于上述拉米夫定MIP顆粒大小 為 38 75 μ m。
3.拉米夫定MISPE柱的制備方法，其特征在于包括以下步驟A)拉米夫定酯化物(3TC-ES)的合成將吡啶2.4mL和拉米夫定l.Og置于反應(yīng) 瓶中，充分溶解后加入醋酸酐2mL，于室溫下攪拌2小時后蒸出溶劑及未反應(yīng)完的醋 酸酐，將得到白色粗產(chǎn)物用氯仿溶解，用水萃取，收集氯仿層，水層繼續(xù)用氯仿提取3 次，合并氯仿溶液，蒸除氯仿，得到白色固體，將白色固體用乙醇重結(jié)晶，得到白色的 絮狀拉米夫定酯化產(chǎn)物；B)將拉米夫定酯化物(0.3133g，lmmol)、甲基丙烯酸(0.3444g，4mmol)、40mg偶 氮二異丁腈(AIBN)、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯(6.5mL，20mmol)，16mL氯仿置于 50mL圓底燒瓶中，充分溶解混勻，超聲脫氣5min，通氮氣15min，密封。將圓底燒瓶放 入45°C恒溫水浴鍋中加熱24h得到白色塊狀聚合物。將塊狀聚合物用研缽磨碎，過篩收 集得到粒徑在38 75 μ m，含有拉米夫定的MIP顆粒；C)將上述含有拉米夫定的MIP顆粒，用索氏提取器以含冰乙酸-甲醇(1 9，V/ V)溶液洗至無拉米夫定檢出，繼續(xù)用甲醇洗去乙酸，再經(jīng)甲醇反復(fù)沉降，濾去甲醇，將 獲得的顆粒物真空干燥至恒重，即為拉米夫定MIP顆粒；D)稱取IOOmg上述拉米夫定MIP顆粒，均勻填充至空的固相萃取柱中，在聚合物上 放置塞板，制得拉米夫定MISPE柱。
4.如權(quán)利要求1所述的拉米夫定MISPE柱，其特征在于將上述拉米夫定MIP顆粒填 充在聚丙烯固相萃取柱內(nèi)得拉米夫定MISPE柱。
5.如權(quán)利要求1所述的拉米夫定MISPE柱用途，其特征在于利用該拉米夫定MISPE 柱分離富集生物樣品中的拉米夫定。
6.如權(quán)利要求5所述的拉米夫定MISPE柱的用途，其特征在于用該拉米夫定MISPE 柱分離富集血清(或血漿)樣品拉米夫定提取液，以正庚烷四氯化碳=11為上樣溶 齊U、4%乙醇-四氯化碳為淋洗劑、甲醇為洗脫溶劑。
7.如權(quán)利要求6所述的拉米夫定MISPE柱應(yīng)用于血清(或血漿)樣品拉米夫定提取 液，其特征在于上述血清樣品拉米夫定提取液制備方法是取空白牛血清0.3mL樣品，置 具塞離心管中，精密加入1.0g/L拉米夫定的水溶液0.3mL，渦旋混勻lmin，加入乙腈 2.4mL混勻后，于4000r/min離心30min除去蛋白質(zhì)，精密量取上清液l.OmL作為生物樣 品提取液。
全文摘要
本發(fā)明涉及吸附材料的制備及其在藥物分離、富集中的應(yīng)用，是一種拉米夫定分子印跡聚合物和拉米夫定分子印跡固相萃取柱的制備及其應(yīng)用。通過酯化合成得到拉米夫定酯化物。該分子印跡聚合物以拉米夫定酯化物為模板，以甲基丙烯酸為單體、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，氯仿為致孔劑，采用本體聚合法合成分子印跡聚合物，將分子印跡聚合物顆粒均勻填充于固相萃取柱內(nèi)，得到拉米夫定分子印跡固相萃取柱。本發(fā)明實現(xiàn)了生物樣品中拉米夫定的高效分離、富集與純化，與以往普通溶劑萃取法、C18固相萃取法等相關(guān)技術(shù)相比，選擇性高，并且拉米夫定分子印跡固相萃取柱可以重復(fù)使用，成本低，可望成為生物樣品中拉米夫定前處理的必備手段。
文檔編號G01N30/08GK102008946SQ20101051388
公開日2011年4月13日 申請日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者努爾買買提·庫達(dá)巴爾地, 吐爾洪·買買提, 曾何華 申請人:新疆大學(xué)