專利名稱：一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條及制備方法， 屬于生物學(xué)免疫方法的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
格列苯脲是磺脲類口服降血糖藥，適用于單用飲食控制療效不滿意的輕、中度非 胰島素依賴型糖尿病，病人胰島B細(xì)胞有一定的分泌胰島素功能，并且無(wú)嚴(yán)重的并發(fā)癥，用 于非胰島素依賴型(成年型、肥胖型)的糖尿病患者。近幾年來(lái)，一些不法生產(chǎn)企業(yè)為牟取 暴利，在未經(jīng)獲得批準(zhǔn)的情況下，在治療糖尿病的中藥或是保健品中非法加入價(jià)格相對(duì)低 廉、起效快的格列苯脲等降糖西藥是十分普遍的現(xiàn)象，據(jù)五個(gè)省市對(duì)市面上銷(xiāo)售的32種宣 稱具有降糖作用中藥及中藥保健品進(jìn)行的抽樣化驗(yàn)檢查發(fā)現(xiàn)，70%的藥物中都非法添加有 降糖西藥成分。格列苯脲的降糖作用為甲苯磺丁脲的100-200倍，治療量范圍大，降糖作 用，半減期12-14小時(shí)，維持時(shí)間長(zhǎng)，易引起低血糖昏迷，特別是老年人。因?yàn)槔夏耆藬z食 少，抗胰島素激素如胰高血糖素，腎上腺素分泌反應(yīng)障礙均可誘發(fā)低血糖，再者老年人糖尿 病性植物神經(jīng)病變，急性低血糖癥狀可以被掩蓋，低血糖昏迷如持續(xù)6小時(shí)以上引起大腦 功能損害可能是不可逆的，主要是神經(jīng)元廣泛變性、壞死，大小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)。神經(jīng)系 統(tǒng)中大腦皮質(zhì)、海馬回，小腦、尾狀核，蒼白球處低血糖最為明顯。所以格列苯脲必須由醫(yī)生 處方才可使用。在治療糖尿病的中藥或保健產(chǎn)品非法加入格列苯脲而不標(biāo)明藥物成分和劑 量，使得醫(yī)生和患者都無(wú)法預(yù)知和掌握可能有的毒副作用，極易導(dǎo)致出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)；而 一些患者往往會(huì)在服用醫(yī)生治療用處方藥的同時(shí)服用保健食品，造成攝入過(guò)量藥物中毒， 加劇病情，嚴(yán)重的甚至危及患者生命。所以，為了保證人民群眾的飲食用藥安全，我們必須 加大力度打擊這種現(xiàn)象。然而近年來(lái)，不法分子非法生產(chǎn)的手段日趨隱蔽，而且由于中藥成 分比較復(fù)雜，檢測(cè)難度較大，需要精密的分析儀器和專業(yè)技術(shù)人員，因而造成監(jiān)管部門(mén)監(jiān)督 抽驗(yàn)成本很大，收效卻不甚理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服以上的不足，提供一種能快速、靈敏、簡(jiǎn)便地檢測(cè)格列苯 脲衍生物的格列苯脲膠體金層析檢測(cè)試紙條及制備方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金 層析試紙條，由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成，金 標(biāo)結(jié)合墊為吸附格列苯脲衍生物的金標(biāo)抗體的聚酯纖維氈，在包被膜上有用格列苯脲衍生 物偶聯(lián)的載體蛋白溶液包被直線式檢測(cè)線τ線，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對(duì)照線C 線，兩條線豎向平行排列。襯板為不吸水的PCV韌性材料。包被膜為硝酸纖維素膜，或混合 纖維素膜。吸水墊為植物纖維棉紙。格列苯脲衍生物的金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗格列苯 脲衍生物的單克隆抗體復(fù)合物，偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。
一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條的制備方法，制備偶聯(lián)格 列苯脲衍生物的載體牛血清白蛋白BSA，用于制備相應(yīng)的檢測(cè)線T線；制備偶聯(lián)格列苯脲衍 生物的載體雞卵清白蛋白，用于制備單克隆抗體，制備格列苯脲衍生物金標(biāo)抗體，用于制備 吸附格列苯脲衍生物金標(biāo)抗體的聚酯纖維氈；制備羊抗鼠IgG抗體，用于制備對(duì)照線C線， 包括如下步驟
(A)將格列苯脲衍生物與載體牛血清白蛋白BSA/雞卵清白蛋白OVA進(jìn)行偶聯(lián)制備人工 合成抗原；
a、生成水溶性碳化二亞胺(EDC):往反應(yīng)瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非類 原料或拉非類原料，并通N2保護(hù)，在室溫下進(jìn)行攪拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速稱取濃度為60%的氫化鈉(NaH)，并將其加入所述反應(yīng)瓶中，攪拌50-70分鐘，直至溶液 無(wú)氣泡產(chǎn)生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反應(yīng)瓶中，注入完畢后，在室溫下 攪拌11-13小時(shí)，之后將反應(yīng)液傾入水中分散，以氯仿進(jìn)行提取，合并提取液，以無(wú)水Na2SO4 進(jìn)行干燥，之后過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)減壓濃縮后得到固體，加入無(wú)水乙醚打漿洗滌所述固體，之后 進(jìn)行過(guò)濾，最后真空干燥得到新的固體，此固體為烷基化物；將無(wú)水乙醇和上述步驟所得的 烷基化物加入新的反應(yīng)瓶中，進(jìn)行攪拌分散，再加入NaOH溶液，加熱回流反應(yīng)2小時(shí)，停止 加熱稍冷卻后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入單口瓶中，減壓濃縮得糊狀物，再加入水，以鹽酸調(diào)節(jié)至PH值 為7-9的液體，以氯仿進(jìn)行提取，合并提取液，再用飽和食鹽水洗一次，以無(wú)水Na2SO4干燥， 過(guò)濾，減壓濃縮得白色固體，用甲醇重結(jié)晶，得白色粉狀固體，此固體為水溶性碳化二亞胺 (EDC)；
b、生成人工合成抗原將上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室溫；取上述步驟中所得的水溶性 碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物，三者的摩爾比為半抗原化合物水溶性 碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 8-12 :13-16，將其置入圓底燒瓶，然后加入上述步驟 中所得的二甲基甲酰胺溶解，為保證反應(yīng)完全，在室溫避光的條件下進(jìn)行攪拌，最后生成的 溶液記為二號(hào)反應(yīng)液；當(dāng)所述水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物在二 甲基甲酰胺中反應(yīng)完全后，現(xiàn)配載體蛋白溶液(BSA / 0VA)，將載體蛋白與硼酸緩沖液按 1:0. 15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸緩沖液，然后轉(zhuǎn)入另一圓底燒瓶中，此溶液記為 三號(hào)反應(yīng)液；將二號(hào)反應(yīng)液按每10秒1滴的速度滴入三號(hào)反應(yīng)液中，直至將二號(hào)的反應(yīng)液 加完后，先在室溫避光的條件下進(jìn)行攪拌，之后在3-5 °C條件下避光攪拌，待反應(yīng)完全后，生 成溶液，并將生成的溶液記為四號(hào)反應(yīng)液，四號(hào)反應(yīng)液中載體蛋白與半抗原化合物比例為 1:15-25 ；等所有反應(yīng)結(jié)束后，將四號(hào)反應(yīng)液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中還裝有0. 01-0. 02M磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 5，將透析袋在3_5°C的條件下進(jìn)行透 析，每隔3-5小時(shí)換一次磷酸鹽緩沖液；經(jīng)上述透析步驟最終所得的產(chǎn)品，經(jīng)冷凍干燥為白 色絮狀產(chǎn)品，即為人工合成抗原。(B)將人工合成抗原OVA按常規(guī)方法免疫制備格列苯脲衍生物的單克隆抗體細(xì)胞 株，用Babc小鼠免疫制備抗體腹水，將腹水純化得到高純度的單克隆抗體蛋白，測(cè)定蛋白 濃度，備膠體金標(biāo)記用；
(C)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；
(D)用0.lmol/LK2C03調(diào)節(jié)膠體金溶液至最適PH值(8. 5-9. 0)，將適量純化的單克隆
5抗體純水透析(4hr)后，加入膠體盆中，室溫電磁攪拌(15-30min)，逐滴加入1%絡(luò)蛋白溶液，使絡(luò)濃度為0. 1%，持續(xù)攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin，棄去上清去沉淀物，將沉 淀物用重懸液重新恢復(fù)至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積 1/20，4°C保存?zhèn)溆?，即獲得抗格列苯脲衍生物單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物，重懸液為含5% 海藻的0. 02Tris-HCL緩沖液；
(E)將1 :20-1:10稀釋的格列苯脲衍生物膠體進(jìn)標(biāo)記抗體噴涂吸附于聚酯纖維氈中， 27°C保溫干燥，制備格列苯脲衍生物金標(biāo)結(jié)合墊；
(F)在包被膜上用格列苯脲衍生物偶聯(lián)的載體牛血清白蛋白BSA溶液包被直線式檢測(cè) 線T線，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對(duì)照線C線，兩條線豎向平行排列；
(G)試紙條的組裝將樣品墊、金標(biāo)組合墊、包被膜和吸水墊依次粘附在襯板上，樣品墊 置于襯板的一端，吸水墊置于襯板的另一端，包被膜置于襯板的中間，金標(biāo)結(jié)合墊置于樣品 墊和包被膜之間，即得到用于免疫檢測(cè)的格列苯脲衍生物膠體金層析檢測(cè)試驗(yàn)紙大板，將 大板按顧客要求分切成2. 5mm-7. Omm寬度規(guī)格的試紙條，密封干燥保存。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、特異性強(qiáng)，敏感性高。該膠體金層析檢測(cè)試紙條以膠體金標(biāo)記高特異性高親和力靜 電吸附的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成。2、簡(jiǎn)便、快速、時(shí)效性強(qiáng)，使用膠體金層析檢測(cè)試紙條和試紙卡，無(wú)需任何其它試 劑和儀器，可現(xiàn)場(chǎng)操作，將樣品用提取液混合后，取上清液進(jìn)行檢測(cè)，在5min即可判定檢測(cè)結(jié)果。3、結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。檢測(cè)試紙條均以顯示紅色線T線和C線作為檢測(cè) 結(jié)果陽(yáng)性和陰性標(biāo)記，即在包被膜上顯示一條紅色線C線時(shí)，表示在被檢樣品中含有被檢 物，顯示兩條紅色線T線和C線時(shí)，表示在被減樣品中不含被檢物。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn) 確、簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性等人為誤判。4、制備方法采用噴涂工藝，簡(jiǎn)單快速，噴涂均勻，干燥快。


圖1為本發(fā)明的剖面結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本發(fā)明的俯視結(jié)構(gòu)示意圖中標(biāo)號(hào)1-襯板、2-樣品墊、3-金標(biāo)結(jié)合墊、4-包被膜、5-吸水墊、6-T線、7-C線。
具體實(shí)施例方式
為了加深對(duì)本發(fā)明的理解，下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，該實(shí)施 例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。如圖1、圖2所示一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，由襯板 1和在襯板1上依次銜接的樣品墊2、金標(biāo)結(jié)合墊3、包被膜4和吸水墊5組成，金標(biāo)結(jié)合墊3 為吸附格列苯脲衍生物的金標(biāo)抗體的聚酯纖維氈，在包被膜4上有用格列苯脲衍生物偶聯(lián) 的載體蛋白溶液包被直線式檢測(cè)線T線6，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對(duì)照線C線7， 兩條線豎向平行排列。襯板1為不吸水的PCV韌性材料。包被膜4為硝酸纖維素膜，或混 合纖維素膜。吸水墊5為植物纖維棉紙。格列苯脲衍生物的金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗格 列苯脲衍生物的單克隆抗體復(fù)合物，偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。制備偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體牛血清白蛋白BSA，用于制備相應(yīng)的檢測(cè)線T線6 ；制備偶 聯(lián)格列苯脲衍生物的載體雞卵清白蛋白，用于制備單克隆抗體，制備格列苯脲衍生物金標(biāo) 抗體，用于制備吸附格列苯脲衍生物金標(biāo)抗體的聚酯纖維氈；制備羊抗鼠IgG抗體，用于制 備對(duì)照線C線7，包括如下步驟
(A)將格列苯脲衍生物與載體牛血清白蛋白BSA/雞卵清 白蛋白OVA進(jìn)行偶聯(lián)制備人工 合成抗原；
a、生成水溶性碳化二亞胺(EDC):往反應(yīng)瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非類 原料或拉非類原料，并通N2保護(hù)，在室溫下進(jìn)行攪拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速稱取濃度為60%的氫化鈉(NaH)，并將其加入所述反應(yīng)瓶中，攪拌50-70分鐘，直至溶液 無(wú)氣泡產(chǎn)生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反應(yīng)瓶中，注入完畢后，在室溫下 攪拌11-13小時(shí)，之后將反應(yīng)液傾入水中分散，以氯仿進(jìn)行提取，合并提取液，以無(wú)水Na2SO4 進(jìn)行干燥，之后過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)減壓濃縮后得到固體，加入無(wú)水乙醚打漿洗滌所述固體，之后 進(jìn)行過(guò)濾，最后真空干燥得到新的固體，此固體為烷基化物；將無(wú)水乙醇和上述步驟所得的 烷基化物加入新的反應(yīng)瓶中，進(jìn)行攪拌分散，再加入NaOH溶液，加熱回流反應(yīng)2小時(shí)，停止 加熱稍冷卻后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入單口瓶中，減壓濃縮得糊狀物，再加入水，以鹽酸調(diào)節(jié)至PH值 為7-9的液體，以氯仿進(jìn)行提取，合并提取液，再用飽和食鹽水洗一次，以無(wú)水Na2SO4干燥， 過(guò)濾，減壓濃縮得白色固體，用甲醇重結(jié)晶，得白色粉狀固體，此固體為水溶性碳化二亞胺 (EDC)；
b、生成人工合成抗原將上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室溫；取上述步驟中所得的水溶性 碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物，三者的摩爾比為半抗原化合物水溶性 碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 8-12 :13-16，將其置入圓底燒瓶，然后加入上述步驟 中所得的二甲基甲酰胺溶解，為保證反應(yīng)完全，在室溫避光的條件下進(jìn)行攪拌，最后生成的 溶液記為二號(hào)反應(yīng)液；當(dāng)所述水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物在二 甲基甲酰胺中反應(yīng)完全后，現(xiàn)配載體蛋白溶液(BSA / 0VA)，將載體蛋白與硼酸緩沖液按 1:0. 15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸緩沖液，然后轉(zhuǎn)入另一圓底燒瓶中，此溶液記為 三號(hào)反應(yīng)液；將二號(hào)反應(yīng)液按每10秒1滴的速度滴入三號(hào)反應(yīng)液中，直至將二號(hào)的反應(yīng)液 加完后，先在室溫避光的條件下進(jìn)行攪拌，之后在3-5 °C條件下避光攪拌，待反應(yīng)完全后，生 成溶液，并將生成的溶液記為四號(hào)反應(yīng)液，四號(hào)反應(yīng)液中載體蛋白與半抗原化合物比例為 1:15-25 ；等所有反應(yīng)結(jié)束后，將四號(hào)反應(yīng)液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中還裝有0. 01-0. 02M磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 5，將透析袋在3_5°C的條件下進(jìn)行透 析，每隔3-5小時(shí)換一次磷酸鹽緩沖液；經(jīng)上述透析步驟最終所得的產(chǎn)品，經(jīng)冷凍干燥為白 色絮狀產(chǎn)品，即為人工合成抗原。 (B)將人工合成抗原OVA按常規(guī)方法免疫制備格列苯脲衍生物的單克隆抗體細(xì)胞 株，用Babc小鼠免疫制備抗體腹水，將腹水純化得到高純度的單克隆抗體蛋白，測(cè)定蛋白 濃度，備膠體金標(biāo)記用；
(C)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；
(D)用0.lmol/LK2C03調(diào)節(jié)膠體金溶液至最適PH值(8. 5-9. 0)，將適量純化的單克隆 抗體純水透析(4hr)后，加入膠體盆中，室溫電磁攪拌(15-30min),逐滴加入1%絡(luò)蛋白溶液，使絡(luò)濃度為0. 1%，持續(xù)攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin，棄去上清去沉淀物，將沉 淀物用重懸液重新恢復(fù)至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積 1/20，4°C保存?zhèn)溆?，即獲得抗格列苯脲衍生物單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物，重懸液為含5% 海藻的0. 02Tris-HCL緩沖液；
(E)將1 :20-1:10稀釋的格列苯脲衍生物膠體進(jìn)標(biāo)記抗體噴涂吸附于聚酯纖維氈中， 27°C保溫干燥，制備格列苯脲衍生物金標(biāo)結(jié)合墊3 ；
(F)在包被膜4上用格列苯脲衍生物偶聯(lián)的載體牛血清白蛋白BSA溶液包被直線式檢 測(cè)線T線6，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對(duì)照線C線7，兩條線豎向平行排列；
(G)試紙條的組裝將樣品墊2、金標(biāo)組合墊3、包被膜4和吸水墊5依次粘附在襯板1 上，樣品墊2置于襯板1的一端，吸水墊5置于襯板1的另一端，包被膜4置于襯板1的中 間，金標(biāo)結(jié)合墊3置于樣品墊2和包被膜4之間，即得到用于免疫檢測(cè)的格列苯脲衍生物膠 體金層析檢測(cè)試驗(yàn)紙大板，將大板按顧客要求分切成2. 5mm-7. Omm寬度規(guī)格的試紙條，密 封干燥保存。格列苯脲膠體金層析試紙條的檢測(cè)反應(yīng)原理格列苯脲屬于小分子物質(zhì)。本發(fā) 明采用競(jìng)爭(zhēng)法，即樣品中的格列苯脲和固定在包被膜4上的包被抗原M2-BSA競(jìng)爭(zhēng)膠體進(jìn)標(biāo) 記的抗格列苯脲單克隆抗體。當(dāng)試紙條以樣品墊2末端浸入樣本后，樣品溶液沿著試紙條 通過(guò)毛細(xì)作用從下往上泳動(dòng)，溶解金標(biāo)墊上干燥的金標(biāo)抗體，若待測(cè)樣品中不存在待測(cè)藥 物，則金標(biāo)抗體會(huì)直接泳動(dòng)到檢測(cè)線和硝酸纖維膜上的M2-BSA發(fā)生免疫反應(yīng)，從而膠體金 顆粒發(fā)生聚集，形成紅色線條，然后其他未結(jié)合的金標(biāo)抗體繼續(xù)通過(guò)毛細(xì)管作用向前泳動(dòng)， 與對(duì)照線上的羊抗鼠二抗發(fā)生第二次免疫反應(yīng)，同樣形成紅色線條，這樣包被膜4上就會(huì) 有兩條紅色線條，表示樣品為陰性。若待測(cè)樣品中存在待測(cè)藥品，則金標(biāo)抗體首先會(huì)和樣品 中的檢測(cè)物發(fā)生免疫反應(yīng)，當(dāng)未發(fā)生反應(yīng)的金標(biāo)抗體有剩余時(shí)，才會(huì)在檢測(cè)線上與M2-BSA 發(fā)生免疫反應(yīng)，形成紅色線條，其顏色強(qiáng)度弱于陰性時(shí)的線條強(qiáng)度；而當(dāng)金標(biāo)抗體全部和樣 品中的格列苯脲發(fā)生免疫結(jié)合時(shí)，就不會(huì)再有抗體與對(duì)照線包被原結(jié)合，從而檢測(cè)線就不 會(huì)有紅色線條出現(xiàn)。對(duì)照線是為檢驗(yàn)金標(biāo)免疫層析方法本身是否存在待測(cè)藥物，對(duì)照線都 應(yīng)該顯現(xiàn)。如果對(duì)照線不顯色，則說(shuō)明試紙否有效而設(shè)定的，所以無(wú)論樣品中是條失效。本發(fā)明特異性強(qiáng)，敏感度高，檢出最低限量可達(dá)到5ppb ；簡(jiǎn)便、快速、時(shí)效性強(qiáng)， 無(wú)需任何其它試劑和儀器，可現(xiàn)場(chǎng)操作，試紙條加入被檢樣品液后，在15分鐘內(nèi)即可判定 檢測(cè)結(jié)果；結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確；節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣，便于推廣。
權(quán)利要求
一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特征在于由襯板(1)和在襯板(1)上依次銜接的樣品墊(2)、金標(biāo)結(jié)合墊(3)、包被膜(4)和吸水墊(5)組成，金標(biāo)結(jié)合墊(3)為吸附格列苯脲衍生物的金標(biāo)抗體的聚酯纖維氈，在包被膜(4)上有用格列苯脲衍生物偶聯(lián)的載體蛋白溶液包被直線式檢測(cè)線T線(6)，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對(duì)照線C線(7)，兩條線豎向平行排列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特 征在于所述襯板(1)為不吸水的PCV韌性材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條， 其特征在于所述包被膜(4)為硝酸纖維素膜，或混合纖維素膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，其特 征在于所述吸水墊(5)為植物纖維棉紙。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，特 征在于格列苯脲衍生物的金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗格列苯脲衍生物的單克隆抗體復(fù)合 物，所述偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。
6.一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條的制備方法，其特征在于 制備偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體牛血清白蛋白BSA，用于制備相應(yīng)的檢測(cè)線T線(6)；制備 偶聯(lián)格列苯脲衍生物的載體雞卵清白蛋白，用于制備單克隆抗體，制備格列苯脲衍生物金 標(biāo)抗體，用于制備吸附格列苯脲衍生物金標(biāo)抗體的聚酯纖維氈；制備羊抗鼠IgG抗體，用于 制備對(duì)照線C線(7)，包括如下步驟(A)將格列苯脲衍生物與載體牛血清白蛋白BSA/雞卵清白蛋白OVA進(jìn)行偶聯(lián)制備人工 合成抗原；a、生成水溶性碳化二亞胺(EDC):往反應(yīng)瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非類 原料或拉非類原料，并通N2保護(hù)，在室溫下進(jìn)行攪拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速稱取濃度為60%的氫化鈉(NaH)，并將其加入所述反應(yīng)瓶中，攪拌50-70分鐘，直至溶液 無(wú)氣泡產(chǎn)生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反應(yīng)瓶中，注入完畢后，在室溫下 攪拌11-13小時(shí)，之后將反應(yīng)液傾入水中分散，以氯仿進(jìn)行提取，合并提取液，以無(wú)水Na2SO4 進(jìn)行干燥，之后過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)減壓濃縮后得到固體，加入無(wú)水乙醚打漿洗滌所述固體，之后 進(jìn)行過(guò)濾，最后真空干燥得到新的固體，此固體為烷基化物；將無(wú)水乙醇和上述步驟所得的 烷基化物加入新的反應(yīng)瓶中，進(jìn)行攪拌分散，再加入NaOH溶液，加熱回流反應(yīng)2小時(shí)，停止 加熱稍冷卻后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入單口瓶中，減壓濃縮得糊狀物，再加入水，以鹽酸調(diào)節(jié)至PH值 為7-9的液體，以氯仿進(jìn)行提取，合并提取液，再用飽和食鹽水洗一次，以無(wú)水Na2SO4干燥， 過(guò)濾，減壓濃縮得白色固體，用甲醇重結(jié)晶，得白色粉狀固體，此固體為水溶性碳化二亞胺 (EDC)；b、生成人工合成抗原將上述步驟中所得的水溶性碳化二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室溫；取上述步驟中所得的水溶性 碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物，三者的摩爾比為半抗原化合物水溶性 碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 8-12 :13-16，將其置入圓底燒瓶，然后加入上述步驟 中所得的二甲基甲酰胺溶解，為保證反應(yīng)完全，在室溫避光的條件下進(jìn)行攪拌，最后生成的 溶液記為二號(hào)反應(yīng)液；當(dāng)所述水溶性碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺和半抗原化合物在二甲基甲酰胺中反應(yīng)完全后，現(xiàn)配載體蛋白溶液(BSA / 0VA)，將載體蛋白與硼酸緩沖液按 1:0. 15-0. 2的量溶解于另一容器中的硼酸緩沖液，然后轉(zhuǎn)入另一圓底燒瓶中，此溶液記為 三號(hào)反應(yīng)液；將二號(hào)反應(yīng)液按每10秒1滴的速度滴入三號(hào)反應(yīng)液中，直至將二號(hào)的反應(yīng)液 加完后，先在室溫避光的條件下進(jìn)行攪拌，之后在3-5°C條件下避光攪拌，待反應(yīng)完全后，生 成溶液，并將生成的溶液記為四號(hào)反應(yīng)液，四號(hào)反應(yīng)液中載體蛋白與半抗原化合物比例為 1:15-25;等所有反應(yīng)結(jié)束后，將四號(hào)反應(yīng)液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中還裝有0. 01-0. 02M磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 0-7. 5，將透析袋在3_5°C的條件下進(jìn)行透 析，每隔3-5小時(shí)換一次磷酸鹽緩沖液；經(jīng)上述透析步驟最終所得的產(chǎn)品，經(jīng)冷凍干燥為白 色絮狀產(chǎn)品，即為人工合成抗原；(B)將人工合成抗原OVA按常規(guī)方法免疫制備格列苯脲衍生物的單克隆抗體細(xì)胞株， 用Babc小鼠免疫制備抗體腹水，將腹水純化得到高純度的單克隆抗體蛋白，測(cè)定蛋白濃 度，備膠體金標(biāo)記用；(C)用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm的膠體金溶液；(D)用0.lmol/LK2C03調(diào)節(jié)膠體金溶液至最適PH值(8. 5-9. 0)，將適量純化的單克隆 抗體純水透析(4hr)后，加入膠體盆中，室溫電磁攪拌(15-30min),逐滴加入1%絡(luò)蛋白溶 液，使絡(luò)濃度為0. 1%，持續(xù)攪拌5min，4°C下15000rpm離心lOmin，棄去上清去沉淀物，將沉 淀物用重懸液重新恢復(fù)至原體積混勻，再次離心一次，用重懸溶液將沉淀物混懸至原體積 1/20，4°C保存?zhèn)溆?，即獲得抗格列苯脲衍生物單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物，所述重懸液為 含5%海藻的0. 02Tris-HCL緩沖液；(E)將1:20-1:10稀釋的格列苯脲衍生物膠體進(jìn)標(biāo)記抗體噴涂吸附于聚酯纖維氈中， 27°C保溫干燥，制備格列苯脲衍生物金標(biāo)結(jié)合墊(3)；(F)在包被膜(4)上用格列苯脲衍生物偶聯(lián)的載體牛血清白蛋白BSA溶液包被直線式 檢測(cè)線T線(6)，用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對(duì)照線C線(7)，兩條線豎向平行排列；(G)試紙條的組裝將樣品墊(2)、金標(biāo)組合墊(3)、包被膜(4)和吸水墊(5)依次粘附在 襯板(1)上，樣品墊(2)置于襯板(1)的一端，吸水墊(5)置于襯板(1)的另一端，包被膜(4) 置于襯板(1)的中間，金標(biāo)結(jié)合墊(3)置于樣品墊(2)和包被膜(4)之間，即得到用于免疫檢 測(cè)的格列苯脲衍生物膠體金層析檢測(cè)試驗(yàn)紙大板，將大板按顧客要求分切成2. 5mm-7. Omm 寬度規(guī)格的試紙條，密封干燥保存。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種快速檢測(cè)格列苯脲及其衍生物的膠體金層析試紙條，由襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成，金標(biāo)結(jié)合墊為吸附格列苯脲衍生物的金標(biāo)抗體的聚酯纖維氈，在包被膜上有用格列苯脲衍生物偶聯(lián)的載體蛋白溶液包被直線式檢測(cè)線T線，和用羊抗鼠IgG溶液包被直線式對(duì)照線C線，兩條線豎向平行排列。其具體步驟制備人工結(jié)合抗原；制備格列苯脲衍生物的單克隆抗體；制成膠體金溶液；獲得抗格列苯脲衍生物單克隆抗體的膠體金標(biāo)記物和金標(biāo)結(jié)合墊。本發(fā)明具有特異性強(qiáng)，敏感度高，簡(jiǎn)便、快速、時(shí)效性強(qiáng)，結(jié)果顯示形象、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101986156SQ201010516359
公開(kāi)日2011年3月16日 申請(qǐng)日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者吳迪宏, 歐衛(wèi)軍 申請(qǐng)人:南通市伊士生物技術(shù)有限責(zé)任公司