專利名稱：一種通過顯色基質(zhì)法測定注射級大豆磷脂中細菌內(nèi)毒素含量的方法
一種通過顯色基質(zhì)法測定注射級大豆磷脂中細菌內(nèi)毒素含量的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于藥用輔料的細菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域，涉及一種藥物輔料大豆磷脂中細菌 內(nèi)毒素的檢測方法。
背景技術(shù)：
大豆磷脂是一種植物來源的磷脂，具有脂肪和膽固醇含量低、乳化穩(wěn)定性好、成本 低等優(yōu)點，醫(yī)藥行業(yè)中常用精制的天然磷脂作為制備各種藥物制劑的乳化劑和輔料。其中， 磷脂作為靜脈注射脂肪乳注射液的乳化劑是其最常用的醫(yī)藥用途之一。磷脂作為其乳化 劑，能經(jīng)受熱壓滅菌不被破壞，對生物體毒性很小，能量高，乳化效果好，形成油粒高度分散 而均勻，性能優(yōu)于其它乳化劑。磷脂作為形成脂質(zhì)體雙分子膜的基本材料是其又一常用的 醫(yī)藥用途。磷脂具有安全無毒、乳化性能好的特性，其典型的雙親分子特性，使脂質(zhì)體具有 親油親水性，包裹范圍更廣。
出于安全性考慮，大豆磷脂作為注射劑的乳化劑或輔料時，為保證終產(chǎn)品的質(zhì)量， 有必要對其進行細菌內(nèi)毒素含量的檢查，控制其中細菌內(nèi)毒素的限度。目前沒有文獻報道 關(guān)于磷脂中的細菌內(nèi)毒素的含量的測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏、可靠的方法，可快速檢查出注射級大豆磷脂中的 細菌內(nèi)毒素含量。
技術(shù)方案本發(fā)明注射級大豆磷脂的細菌內(nèi)毒素的檢查方法是精密稱定注射級大 豆磷脂，用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解成lOmg/mL的大豆磷脂溶液，稀釋至不超過最大有效 稀釋倍數(shù)(MVD)的各稀釋級的稀釋液備用。先建立細菌內(nèi)毒素標準曲線，然后參照中國藥 典2010版附錄“細菌內(nèi)毒素檢查法”，檢查各稀釋級磷脂溶液的細菌內(nèi)毒素，對各稀釋級進 行干擾試驗，選擇回收率最接近100%的稀釋倍數(shù)進行內(nèi)毒素檢測，可用該稀釋級計算磷脂 中的細菌內(nèi)毒素值。
一、供試品的制備及最大可稀釋倍數(shù)(MVD)的確定
樣品在無菌條件下精密稱定，用細菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水)溶解成初始溶液。ΓΤ供試品的最大可稀釋倍數(shù)按下面公式計算MVD = TΛ
式中c為樣品濃度；L為樣品的細菌內(nèi)毒素限制；λ為細菌內(nèi)毒素標準曲線最低 濃度。
二、細菌內(nèi)毒素標準曲線的建立和可靠性測試
內(nèi)毒素標準品溶液的制備用BET水將細菌內(nèi)毒素標準品稀釋為10EU/mL的內(nèi)毒 素溶液，再稀釋為0. lEU/mL的內(nèi)毒素溶液，以0. lEU/mL的內(nèi)毒素溶液為母液稀釋為不同的 濃度梯度。配置好的內(nèi)毒素標準品溶液在4小時內(nèi)用完。3
標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)Irl > 0.980時，實驗有效，|r| < 0. 980時，實驗無效。
三、細菌內(nèi)毒素檢查的操作步驟
取無熱原試管，加入IOOyL細菌內(nèi)毒素檢查用水、內(nèi)毒素標準品溶液或供試品； 再加入100 μ L鱟試劑溶液，混勻，37°C溫育40分鐘；溫育結(jié)束，加入100 μ L顯色基質(zhì)溶液， 混勻，37°C溫育6分鐘；溫育結(jié)束，加入500 μ L偶氮化試劑1溶液，混勻；加入500 μ L偶氮 化試劑2溶液，混勻；加入500 μ L偶氮化試劑3溶液，混勻，靜置5分鐘，于M5nm波長處讀 吸光度值。每管做2-4個平行。
四、干擾試驗
鱟試驗法受環(huán)境因素影響較大，培養(yǎng)條件、操作環(huán)境可能引起結(jié)果差異，且大豆磷 脂為藥典中未建立內(nèi)毒素檢查的品種，因此需先進行干擾實驗，步驟如下
1.選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內(nèi)毒素濃度(設(shè)為λω)，作為磷脂干擾試 驗中添加的內(nèi)毒素濃度，配置含λω內(nèi)毒素的磷脂溶液為陽性對照，測量出該溶液的內(nèi)毒素 濃度，為Cs。
2.測量出未添加外源內(nèi)毒素的磷脂溶液內(nèi)毒素濃度，為Ct。
3.按公式計算該實驗條件下的回收率Κ =
權(quán)利要求
1.一種顯色基質(zhì)法檢測注射級大豆磷脂的細菌內(nèi)毒素含量的方法，其特征在于精密定 量稱取注射級大豆磷脂原料，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成lOmg/mL作為原液，超聲溶解， 再稀釋至不超過最大有效稀釋倍數(shù)的各級稀釋液，對各稀釋級溶液進行干擾試驗，選擇回 收率最接近100 %的稀釋倍數(shù)進行內(nèi)毒素檢測，可用該稀釋級計算大豆磷脂中的細菌內(nèi)毒素值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于準確稱取注射級大豆磷脂原料0.0090 0. OllOg，用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成lOmg/mL的原液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于大豆磷脂溶液采用超聲溶解，超聲時間為 20 40min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用細菌內(nèi)毒素檢查用水對大豆磷脂的原液 進行稀釋，稀釋倍數(shù)為2 6倍。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于對各稀釋級大豆磷脂溶液進行干擾試驗， 選擇回收率最接近100%的稀釋倍數(shù)進行內(nèi)毒素檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于將兩倍于終濃度的內(nèi)毒素溶液與兩倍于終 濃度的注射級大豆磷脂樣品溶液等體積混合，內(nèi)毒素和樣品溶液間相互稀釋，得到兩者所 需終濃度的混合液，作為干擾試驗中樣品的陽性對照。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測注射級大豆磷脂中細菌內(nèi)毒素含量的靈敏、準確的方法。屬于藥用輔料的細菌內(nèi)毒素檢測領(lǐng)域。方法是用鱟試劑顯色基質(zhì)法測定注射級大豆磷脂中的細菌內(nèi)毒素含量。精密稱定大豆磷脂，用細菌內(nèi)毒素檢查用水配制成10mg/ml的大豆磷脂溶液，再稀釋至不超過最大有效稀釋倍數(shù)的各稀釋級，干擾試驗結(jié)果表明10mg/ml的大豆磷脂溶液經(jīng)三倍以上稀釋，對顯色基質(zhì)鱟試劑定量內(nèi)毒素含量的測定不存在干擾作用，可用該稀釋級計算大豆磷脂中的細菌內(nèi)毒素值。本方法為注射級大豆磷脂的生產(chǎn)和科研提供了控制和測定細菌內(nèi)毒素的方法。
文檔編號G01N21/31GK102033044SQ20101052257
公開日2011年4月27日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者呂名蕊, 王興國, 黃健花 申請人:江南大學