專利名稱：一種戊型肝炎病毒的四重?zé)晒舛縫cr鑒別檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人血清、動物血清及其產(chǎn)品、食品以及環(huán) 境中通過多重?zé)晒舛縋CR鑒別戊型肝炎病毒各個基因型的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
戊型肝炎(Hepatitis Ε)由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)引起，是一 種經(jīng)糞-口傳播、以黃疸為主的急性傳染病，患病孕婦的病死率更可高達(dá)21%。自1955年 印度發(fā)生第一次大暴發(fā)以來，戊型肝炎已在亞洲、非洲與拉丁美洲的很多國家廣泛流行。近 年來該病亦在日本等發(fā)達(dá)國家散發(fā)流行。我國是戊型肝炎高發(fā)的國家，新疆、遼寧、山東等 省均有大量流行，極大的危害人類健康。有證據(jù)顯示，戊型肝炎是一種動物源性疾病，被感 染的家養(yǎng)或野生動物可直接傳播或通過污染水源傳播本病。有研究表明，豬源戊型肝炎病 毒可以感染恒河猴和黑猩猩等靈長類動物，而人戊型肝炎病毒在實驗條件下也能成功感染 豬等動物；血清學(xué)調(diào)查則發(fā)現(xiàn)與豬頻繁接觸的人群(如飼養(yǎng)員、獸醫(yī)、屠工)中戊型肝炎病 毒的抗體水平明顯高于正常人群。日本亦有人因食用了未煮熟的豬肝和鹿肉而引起急性戊 肝的報道，提示了豬戊型肝炎病毒在公共衛(wèi)生和食品安全方面存在的重大意義。HEV是無包膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組長約7. 5kb，有3個開放閱讀框。根 據(jù)HEV各分離株的基因組序列分析，可將其分為4個主要的基因型。I型主要發(fā)生于亞非多 數(shù)國家；II型分離于墨西哥；III型發(fā)生于美國和一些歐洲國家；IV型發(fā)生于亞洲。其中I 型和II型只能感染人，III型和IV型則為人畜共患，可感染人、豬和其它動物。在我國流 行的HEV主要為由I型和IV型。但有研究表明，上海地區(qū)豬場中已有III型HEV毒株的流 行。迄今為止，對豬源戊型肝炎尚無有效的疫苗用于預(yù)防，采取的控制措施主要是及 早發(fā)現(xiàn)，并隨時監(jiān)測疫區(qū)的流行情況以阻斷該病的傳播。這就需要建立一種通用的、高度敏 感、特異和快速的檢測方法用于HEV的診斷。同時，HEV主要經(jīng)污染的水源和環(huán)境傳播，高 度敏感的病原檢測技術(shù)也將有助于分子流行病學(xué)調(diào)查和病毒溯源。而目前可同時快速鑒定 戊型肝炎病毒各個基因型的方法尚無報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種戊型肝炎病毒各個基因型的快速檢測方法，利用TaqMan 探針技術(shù)建立I、II、III和IV型HEV的多重?zé)晒饪焖俜中蜋z測體系，以期填補技術(shù)空白。為此，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案一種不同基因型戊型肝炎病毒的四重?zé)晒舛?量PCR鑒別檢測方法，其特征在于針對HEV 0RF3序列設(shè)計一對保守擴(kuò)增引物和4條型特異 性TaqMan探針?biāo)龅臄U(kuò)增引物序列為HEV-F TATTCATCCAACCAACCCCTT,HEV-R GTCDCGCCAAGYGGAGC,
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該引物為針對不同基因型HEV 0RF3中的高度保守序列設(shè)計，對4種基因型HEV基 因組均能擴(kuò)增，引物序列中D代表堿基A、G或T，Y代表堿基T或C。
所述的TaqMan探針序列為I-P CY5-TGTCACCGCTGCGGCCG-BHQ3,II-P R0X-AGACGTTGCCGCTGCGTCC-BHQ2,III-P HEX-TTTCACAAYCCGGGGCTGGA-BHQ1,IV-P FAM-CGCATCTGACATffCCARCCGC-BHQ1,四條探針分別針對各自的0RF3變異區(qū)序列設(shè)計，為型特異性，能實現(xiàn)不同基因型 的鑒別檢測；其中，I型HEV探針為CY5標(biāo)記，II型HEV探針為ROX標(biāo)記，III型HEV探針 為HEX標(biāo)記，IV型HEV探針為FAM標(biāo)記；探針序列種Y代表堿基T或C，W代表堿基A或T， R代表堿基A或G。PCR鑒別檢測方法的步驟如下1)將待測樣品、陰性對照以及不同型HEV陽性對照采用TRIZO試劑提取RNA，最后 加入30 μ L DEPC水溶解。2)在PCR反應(yīng)管中按下表所述配置反應(yīng)體系
權(quán)利要求
一種戊型肝炎病毒的四重?zé)晒舛縋CR鑒別檢測方法，其特征在于針對HEV ORF3序列設(shè)計一對保守擴(kuò)增引物和4條型特異性TaqMan探針?biāo)龅臄U(kuò)增引物序列為HEV FTATTCATCCAACCAACCCCTT，HEV RGTCDCGCCAAGYGGAGC，該引物為針對不同基因型HEV ORF3中的高度保守序列設(shè)計，對4種基因型HEV基因組均能擴(kuò)增，引物序列中D代表堿基A、G或T，Y代表堿基T或C；所述的TaqMan探針序列為I P CY5 TGTCACCGCTGCGGCCG BHQ3，II PROX AGACGTTGCCGCTGCGTCC BHQ2，III P HEX TTTCACAAYCCGGGGCTGGA BHQ 1，IV PFAM CGCATCTGACATWCCARCCGC BHQ 1，四條探針分別針對各自的ORF3變異區(qū)序列設(shè)計，為型特異性，能實現(xiàn)不同基因型的鑒別檢測；其中，I型HEV探針為CY5標(biāo)記，II型HEV探針為ROX標(biāo)記，III型HEV探針為HEX標(biāo)記，IV型HEV探針為FAM標(biāo)記；探針序列中Y代表堿基T或C，W代表堿基A或T，R代表堿基A或G；PCR鑒別檢測方法的步驟如下1)將待測樣品、陰性對照以及不同型HEV陽性對照采用TRIZO試劑提取RNA，最后加入30μLDEPC水溶解；2)在PCR反應(yīng)管中配置反應(yīng)體系，體系的總體積為25μl，其組成如下10μl熒光定量PCR Mix，1.2μl濃度為10μM的HEV F，1.2μl濃度為10μM的HEV R，0.5μl濃度為10μM的I P，0.5μl濃度為10μM的II P，0.5μl濃度為10μM的III P，0.5μl濃度為10μM的IV P，8μl HEV陽性RNA模板，雙蒸水補至25μl；3)將PCR反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀中，反應(yīng)條件如下第一階段42℃，30min；第二階段95℃，3min；第三階段95℃，10s，60℃，45s，45個循環(huán)，并于第三階段60℃時同時采集不通通道的熒光信號；4)陰性對照CT值應(yīng)顯示為0或≥40.0，陽性對照的CT值應(yīng)≤30.0，否則視實驗失敗，需重做；檢測樣品CT值≤35.0，結(jié)果有效，直接報告樣品陽性；檢測樣品35.0＜CT值＜40.0，需進(jìn)行一次重復(fù)實驗，若CT值仍介于35.0和40.0之間，且曲線有明顯的指數(shù)增長特性，同時陰性對照CT值為零，報告樣品陽性，否則報告樣品陰性；檢測樣品CT值為零，報告樣品陰性。
全文摘要
目前對豬源戊型肝炎尚無有效的疫苗用于預(yù)防，采取的控制措施主要是及早發(fā)現(xiàn)，并隨時監(jiān)測疫區(qū)的流行情況以阻斷該病的傳播。本發(fā)明公開了一種通過多重?zé)晒舛縋CR鑒別戊型肝炎病毒各個基因型的快速檢測方法，其特征在于針對HEVORF3序列設(shè)計一對保守擴(kuò)增引物和4條型特異性TaqMan探針；四條探針分別針對各自的ORF3變異區(qū)序列設(shè)計，為型特異性，能實現(xiàn)不同基因型的鑒別檢測。本發(fā)明保留了PCR方法的高靈敏度、高準(zhǔn)確度的特點，四重?zé)晒舛縋CR提高了檢測效率，降低了檢測成本，同時實現(xiàn)鑒別診斷的目的，為傳染源調(diào)查、傳播環(huán)境、病毒溯源等工作奠定基礎(chǔ)。
文檔編號G01N21/64GK101962689SQ20101052363
公開日2011年2月2日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者何永強(qiáng), 吳姍, 帥江冰, 張曉峰, 陳笑梅 申請人:浙江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心