專利名稱：熒光定量pcr技術(shù)檢測gjb2基因突變的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及以一種以引物特異的實時定量PCR技術(shù)檢測耳聾相關(guān)基因GJB2 235delC突變的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
耳聾發(fā)病率高，目前證實約60%的耳聾由遺傳因素引起，由遺傳因素引起的耳聾，30%的患者屬于綜合征型耳聾(SHI)，70%的患者屬于非綜合征型耳聾(NSHI)。NSHI 中常染色體隱性遺傳占75% —80%，即患兒雙親聽力正常，但均是致病基因突變的肯定攜帶者，多散發(fā)存在，目前認(rèn)為約50%的常染色體隱性遺傳性NSHI由GJB2基因突變引起，且不同種族、地區(qū)的人群存在不同的熱點致病位點，對于我國，日本，韓國等亞洲人群， 235delC突變位點是GJB2基因的主要致病突變位點，我國的研究資料證實，20-30%的耳聾由GJB2235delC突變引起，正常聽力人群中GJB2235delC突變的攜帶者頻率為2_3%。因此，臨床上檢測GJB2235delC突變可以明確耳聾病因，進而指導(dǎo)臨床；尤其是和新生兒期聽力篩查的同步檢測，可以提高新生期耳聾的檢出率，提高出生缺陷的三級預(yù)防；對孕期/孕前夫婦進行GJB2235delC突變檢測可以篩查出攜帶者，進而指導(dǎo)產(chǎn)前診斷，降低耳聾發(fā)生率，提高出生缺陷的二級預(yù)防。目前進行基因突變檢測的方法有數(shù)十種。金標(biāo)準(zhǔn)法為PCR產(chǎn)物直接測序法。PCR 產(chǎn)物直接測序法是目前應(yīng)用最廣泛、較準(zhǔn)確的一種方法，但是該方法需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的人員進行操作，費時費力，在臨床上很難進行推廣?；蛐酒ň哂锌焖俑咄康膬?yōu)點，但是操作上復(fù)雜，步驟多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP) 檢測基因突變的方法具有成本低廉的優(yōu)點，但是過程煩瑣，時間長也不適合普及。公開的專利(專利號200810222745. 7)采用了等位基因特異PCR技術(shù)，在一個PCR反應(yīng)體系中使用了 4條引物，對于多位點檢測有優(yōu)勢，但是該方法在PCR反應(yīng)結(jié)束后需要后續(xù)的凝膠電泳分析結(jié)果，具有開放式操作，凝膠電泳污染環(huán)境等缺點，不適合臨床推廣。采用引物特異熒光定量PCR擴增法，針對GJB2基因235突變位點設(shè)計野生型引物和突變型引物，對一個待測樣本分別用含野生型引物的熒光PCR體系和突變型引物的熒光 PCR體系進行檢測，通過比較兩次反應(yīng)的Ct值和兩者的差值(ACt)大小，判斷樣品是否存在GJB2235delC突變。具有時間短、高通量、閉管自動化操作、結(jié)果分析簡單的優(yōu)點，適合臨床實驗室使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種GJB2基因235delC突變的實時熒光定量PCR檢測方法和試劑盒，可用于臨床樣品的檢測。本發(fā)明的一個具體技術(shù)路線為1)在GJB2基因第233463nt區(qū)域設(shè)計反向突變型引物(SEQ ID NO 2)和反向野生型引物(SEQ ID NO :3)。反向引物的3’端倒數(shù)第二個或第三個堿基可以與GJB2基因序列不配對，反向引物的長度為15-30堿基之間，優(yōu)選地位于第233-254nt區(qū)域。2)在GJB2基因第l-200nt區(qū)域設(shè)計正向野生型引物(SEQ ID NO :1)，正向引物的長度為15-40堿基，優(yōu)選觀-30堿基之間，引物序列并不局限于本說明書中的具體核苷酸序列，可以是GJB2基因第l-200nt區(qū)域的任意一段符合引物要求的核苷酸序列。3)設(shè)計寡核苷酸探針，探針位于正向野生型引物(SEQ ID NO 1)和反向突變型引物(SEQ ID NO 2)之間(SEQ ID N0:7)，長度為15_35bp堿基，探針5，端標(biāo)記熒光發(fā)生基團FAM或HEX，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團TAMRA。探針序列并不局限于本說明書中的具體核苷酸序列，可以是正向野生型引物(SEQ ID NO 1)和反向突變型引物(SEQ ID NO 2)之間的任意一段符合探針要求的核苷酸序列。探針5’端標(biāo)記的熒光發(fā)生基團及其相應(yīng)的3’端熒光淬滅基團可以是本領(lǐng)域中任何可用的熒光基團，如FAM，HEX可以由其他熒光基團或染料代替，如VIC，JOE等。4)配制適宜于PCR擴增的反應(yīng)體系。核酸擴增反應(yīng)體系包括野生型檢測體系(A)、 突變型檢測體系(B)，每個檢測體系都包括耐熱DNA聚合酶、dNTP、UNG酶、含有Mg離子的緩沖液，寡核苷酸探針(SEQ ID NO :7)，正向野生型引物(SEQ ID NO=D ；不同的是檢測體系A(chǔ) 中含反向野生型引物(SEQ ID NO :3)，檢測體系B中含反向突變型引物(SEQID NO :2)。5)從待測樣本中提取DNA，加入前述的兩個反應(yīng)體系，進行熒光定量PCR反應(yīng)。6)確定樣本在野生型檢測體系、突變型檢測體系的Ct值，分別標(biāo)記為CtA，CtB，Ct 值是指使用FQ-PCR反應(yīng)方法檢測DNA序列突變時，獲得超過熒光信號閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)目。△ Ct代表兩者差值的絕對值；純合子閾值和雜合子閾值是為判定檢測結(jié)果而設(shè)定的兩個不同的ACt，其中純合子閾值大于雜合子閾值。ACt <3，判斷為雜合型，ACt >5， 判斷為純合型。當(dāng)Δ Ct彡5，如果CtA < CtB,則該樣品為野生型純合子，如果CtA > CtB, 則該樣品為突變型純合子。本發(fā)明的另一個具體技術(shù)路線為1)在GJB2基因第210-235nt區(qū)域設(shè)計正向突變型引物(SEQ ID NO 5)和正向野生型引物(SEQ ID NO :6)。正向引物的3’端倒數(shù)第二個堿基或倒數(shù)第三個堿基可以與GJB2 基因序列不配對，引物長度為15-40堿基，優(yōu)選18-30堿基之間。GJB2基因第266_375nt區(qū)域設(shè)計反向野生型引物(SEQ ID NO :4)。引物序列并不局限于本說明書中的具體核苷酸序列，可以是GJB2基因第266-375nt區(qū)域的任意一段符合引物要求的核苷酸序列。2)設(shè)計寡核苷酸探針(SEQ ID NO :8)，探針位于正向突變型引物(SEQ ID NO 5) 和反向野生型引物(SEQ ID NO 4)之間，探針序列并不局限于本說明書中的具體核苷酸序列，可以是正向突變型引物(SEQ ID NO 5)和反向野生型引物(SEQ ID NO 4)之間的任意一段符合探針要求的核苷酸序列。探針5’端標(biāo)記的熒光發(fā)生基團及其相應(yīng)的3’端熒光淬滅基團可以是本領(lǐng)域中任何可用的熒光基團，如FAM HEX可以由其他熒光基團或染料代替， 如 VIC，JOE 等。3)配制適宜于PCR擴增的反應(yīng)體系。核酸擴增反應(yīng)體系包括野生型檢測體系(A)、 突變型檢測體系(B)，每個檢測體系都包括耐熱DNA聚合酶、dNTP、UNG酶、含有Mg離子的緩沖液，寡核苷酸探針(SEQ ID NO :8)，反向野生型引物(SEQ ID NO 4)；不同的是野生型檢測體系中含正向野生型引物(SEQ ID NO :6)，突變型檢測體系中含正向突變型引物(SEQ ID NO 5)。
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4)從待測樣本中提取DNA，加入前述的兩個反應(yīng)體系，進行熒光定量PCR反應(yīng)。5)結(jié)果分析同前一個技術(shù)路線。本發(fā)明提供的GJB2基因235delC突變檢測試劑盒主要包括以下組分野生型PCR 反應(yīng)液，突變型PCR反應(yīng)液，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，DNA裂解液，紅細(xì)胞裂解液和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，試劑盒中的野生型PCR反應(yīng)液含有IXPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、正向野生型引物(SEQ ID NO :1)、反向野生型引物 (SEQID NO :3)，熒光探針(SEQ ID NO 7)；突變型 PCR 反應(yīng)液含有IXPCR Buffer、dNTP、 Mg2+、Taq酶、去離子水、正向野生型引物(SEQ ID NO :1)、反向突變型引物(SEQ ID NO :2)、 熒光探針(SEQ ID NO :7)。正向野生型引物(SEQID NO 1) :5，-agatgagcaggccgacttt-3，反向野生型引物(SEQ ID NO 3) :5，-gacacgaagatcagctgcagtg-3，反向突變型引物(SEQ ID NO 2) :5，-gacacgaagatcagctgcagtc-3，熒光探針(SEQ ID NO 7) :5，F(xiàn)AM_ctacttccccatctcccaca_TAMRA3，根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，試劑盒中的野生型PCR反應(yīng)液含有IXPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶、去離子水、正向野生型引物(SEQ ID NO 6)、反向野生型引物(SEQ ID NO :4)、熒光探針(SEQ ID NO 8)；突變型PCR反應(yīng)液含有=IXPCR Buffer、 dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶、去離子水、正向突變型引物(SEQ ID NO :5)、反向野生型引物 (SEQ ID NO :4)、熒光探針(SEQ ID NO :8)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒中的熒光探針(SEQ ID NO :7)，熒光探針 (SEQID NO 8)也可以使用熒光染料STOR GREENI替代。正向野生型引物(SEQ ID NO 6) :5，-atctcccacatccggctatgggcac-3，正向突變型引物(SEQ ID NO 5) :5，-atctcccacatccggctatgggcat-3，反向野生型引物(SEQ ID NO 4) :5，-tcttctcatgtctccggtagg-3，熒光探針(SEQ ID NO 8) :5，F(xiàn)AM_cagctgatcttcgtgtccac_TAMRA3，根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒中的陰性質(zhì)控品為蒸餾水、純水或生理鹽水；陽性質(zhì)控品為經(jīng)過測序檢驗結(jié)果為GJB2235位點野生純合型的組織、血液、或細(xì)胞系提取的DNA或相應(yīng)的質(zhì)粒載體。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒中待檢測靶核酸樣品來自從各種途徑獲取的被檢測者的血液、唾液、羊水細(xì)胞或其它人體組織等等。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒中的DNA提取液主要包含Chelex-IOO。 也可以使用其它試劑盒或方法提取的DNA作為進行熒光定量PCR時的模板。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒中用于判定檢測方法有效性的標(biāo)準(zhǔn)是 每次檢測都使用野生型PCR反應(yīng)液、突變型PCR反應(yīng)液分別檢測陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，對于陽性質(zhì)控品，依據(jù)兩次熒光PCR所得出的△ Ct值作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，陽性質(zhì)控品的 Δ Ct值應(yīng)大于等于閾值。陰性質(zhì)控品兩次熒光PCR檢測結(jié)果應(yīng)為陰性。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，試劑盒檢測結(jié)果的閾值可以根據(jù)不同標(biāo)本類型或者不同的靈敏度及特異性要求設(shè)為3-9之間的任意值。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，可以根據(jù)所擴增序列的特殊情況，在試劑盒的PCR緩沖液中加入甲酰胺或二甲基亞砜等PCR反應(yīng)添加劑減少高GC含量或二級結(jié)構(gòu)對PCR 反應(yīng)的影響。


圖1顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)(Ct值)，縱軸表示熒光強度，靠近左邊的‘S’型曲線是野生型PCR反應(yīng)液生成的曲線，靠近右邊的‘S’型曲線是突變型PCR反應(yīng)液生成的曲線?？梢娨吧蚉CR反應(yīng)液Ct值明顯低于突變型PCR反應(yīng)液生成的曲線。圖2顯示陰性質(zhì)控品的擴增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)(Ct值)，縱軸表示熒光強度， 可見野生型PCR反應(yīng)液、突變型PCR反應(yīng)液均無擴增曲線。圖3顯示試劑盒檢測GJB2235delC野生型人外周血組織標(biāo)本的擴增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)(Ct值)，縱軸表示熒光強度，靠近左邊的‘S’型曲線是野生型PCR反應(yīng)液生成的曲線，靠近右邊的‘S’型曲線是突變型PCR反應(yīng)液生成的曲線?？梢娨吧蚉CR反應(yīng)液Ct 值明顯低于突變型PCR反應(yīng)液生成的曲線。圖4顯示試劑盒檢測GJB2235delC突變型人外周血組織標(biāo)本的擴增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)(Ct值)，縱軸表示熒光強度，靠近左邊的‘S’型曲線是突變型PCR反應(yīng)液生成的曲線，靠近右邊的‘S’型曲線是野生型PCR反應(yīng)液生成的曲線。可見突變型PCR反應(yīng)液Ct 值明顯低于野生型PCR反應(yīng)液生成的曲線。圖5顯示試劑盒檢測GJB2235delC雜合型人外周血組織標(biāo)本的擴增曲線。橫軸表示循環(huán)數(shù)(Ct值)，縱軸表示熒光強度，兩條‘S’型曲線分別表示突變型PCR反應(yīng)液生成的曲線和野生型PCR反應(yīng)液生成的曲線?？梢娡蛔冃蚉CR反應(yīng)液Ct值和野生型PCR反應(yīng)液 Ct值接近。圖6顯示DNA提取失敗的人外周血組織的擴增曲線，圖6A中野生型PCR反應(yīng)液、 突變型PCR反應(yīng)液均無擴增曲線，說明DNA提取失敗。圖6B管無特異性增長曲線且CtA > 33,說明DNA濃度太低，不能用于PCR檢測。
具體實施例方式下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實施例1 :GJB2基因235delC突變檢測試劑盒及其使用試劑盒的組成野生型PCR反應(yīng)液1管(500ul)、突變型PCR反應(yīng)液1管(500ul)、陽性質(zhì)控品1 管QOul)，陰性質(zhì)控品1管QOul)，DNA提取液1管(:3ml)，紅細(xì)胞裂解液1瓶(15ml)。野生型PCR 反應(yīng)液包括IXPCR Buffer,0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 1(SEQ ID NO :1)、0. 2uM 引物 3(SEQ ID NO :3)、0. 2uM 熒光探針 7 (SEQ ID NO :7)。突變型PCR 反應(yīng)液包括IXPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 1(SEQ ID NO :1)、0. 2uM 引物 2(SEQ ID NO :2)、0. 2uM 熒光探針 7 (SEQ ID NO :7)。操作步驟1)基因提取取IOOul EDTA抗凝外周血，加入600ul紅細(xì)胞裂解液，室溫放置 5-10分鐘，期間混勻數(shù)次，5000rpm離心5分鐘，棄上清，然后加入DNA裂解液IOOul，混勻，99度10分鐘，離心，取上清作為DNA摸板進行后續(xù)工作。也可以使用商業(yè)化的DNA提取試劑盒進行基因提取，提取過程按照相應(yīng)的試劑盒說明進行。2) PCR檢測取野生型PCR反應(yīng)液23ul，突變型PCR反應(yīng)液23ul分別置入PCR管中，分別加入2ul樣品DNA，混勻后置于熒光定量PCR儀中。陽性質(zhì)控分別取陽性質(zhì)控品2ul分別加入野生型PCR反應(yīng)液和突變型PCR反應(yīng)液中，余同樣品操作。陰性質(zhì)控分別取陰性質(zhì)控品2ul分別加入PCR反應(yīng)液中，余同樣品操作。PCR擴增參數(shù)50 "C 2min，95 "C 2min, 然后進行40個循環(huán) 950C 30sec — 61°C 20sec，反應(yīng)結(jié)束后將結(jié)果保存待進一步分析。3)結(jié)果分析確定樣本在野生型檢測體系、突變型檢測體系的Ct值，△ Ct代表兩者差值的絕對值；Δ Ct ^ 3，判斷為雜合型，ACt ^ 5，判斷為純合型。當(dāng)ACt彡5，野生型 Ct值<突變型Ct值，則該樣品為野生型純合子，如果野生型Ct值>突變型Ct值，，則該樣品為突變型純合子。實施例2 :GJB2基因235delC突變檢測試劑盒及其使用試劑盒的組成野生型PCR反應(yīng)液1管(500ul)、突變型PCR反應(yīng)液1管(500ul)、陽性質(zhì)控品1 管QOul)，陰性質(zhì)控品1管QOul)，DNA提取液1管(:3ml)，紅細(xì)胞裂解液1瓶(15ml)。野生型PCR 反應(yīng)液包括IXPCR Buffer,0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 1(SEQ ID NO :1)、0· 2uM 引物 3(SEQ ID NO :3)、0· 5X SYBR GREEN I。突變型PCR 反應(yīng)液包括IXPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 1(SEQ ID NO :1)、0. 2uM 引物 3(SEQ ID NO :2)、0· 5X SYBR GREENI。操作步驟及結(jié)果分析同實施例1。實施例3 :GJB2基因235delC突變檢測試劑盒及其使用試劑盒的組成野生型PCR反應(yīng)液1管(500ul)、突變型PCR反應(yīng)液1管(500ul)、陽性質(zhì)控品1 管QOul)，陰性質(zhì)控品1管QOul)，DNA提取液1管(:3ml)，紅細(xì)胞裂解液1瓶(15ml)。野生型PCR 反應(yīng)液包括IXPCR Buffer,0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 4(SEQ ID NO :4)、0. 2uM 引物 6(SEQ ID NO :6)、0. 2uM 熒光探針 7 (SEQ ID NO :7)。突變型PCR 反應(yīng)液包括IXPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 5 (SEQ ID NO :5)、0. 2uM 引物 6(SEQ ID NO :6)、0. 2uM 熒光探針 7 (SEQ ID NO :7)。操作步驟及結(jié)果分析同實施例1。實施例4 :GJB2基因235delC突變檢測試劑盒及其使用試劑盒的組成野生型PCR反應(yīng)液1管(500ul)、突變型PCR反應(yīng)液1管(500ul)、陽性質(zhì)控品1 管QOul)，陰性質(zhì)控品1管QOul)，DNA提取液1管(:3ml)，紅細(xì)胞裂解液1瓶(15ml)。野生型PCR 反應(yīng)液包括IXPCR Buffer,0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 4(SEQ ID NO :4)、0. 2uM 引物 6(SEQ ID NO :6)、0· 5X SYBR GREEN I。突變型PCR 反應(yīng)液包括IXPCR Buffer、0. 2mM dNTPs、Taq 酶 25U/ml、0. 2uM 引物 4(SEQ ID NO :5)、0. 2uM 引物 6(SEQ ID NO :6)、0· 5X SYBRGREEN I。
操作步驟及結(jié)果分析同實施例1。
權(quán)利要求
1.一種采用引物特異性實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(FQ-PCR)檢測GJB2基因235delC 突變方法，其特征在于以GJB2基因第235位點堿基缺失處設(shè)計特異性引物，對于每一個樣品，確定突變與否需同時進行兩次FQ-PCR，使用附加質(zhì)控品和被檢測樣品自身質(zhì)控判定檢測的有效性以及根據(jù)每個樣品兩次FQ-PCR檢測得到的△ Ct值判斷檢測結(jié)果。
2.一種用熒光定量PCR方法檢測GJB2基因235delC突變的試劑盒，其特征在于試劑盒主要包括野生型PCR反應(yīng)液，突變型PCR反應(yīng)液，陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法及其試劑盒，其特征在于，GJB2基因第l-200nt區(qū)域設(shè)計正向野生型引物(SEQ ID NO :1)，其長度為1848bp之間的核苷酸序列，第233463nt 區(qū)域設(shè)計反向突變型引物(SEQ ID NO 2)和反向野生型引物(SEQ ID NO :3)，反向突變型引物(SEQ ID NO 2)其特征在于3，端堿基能夠與GJB2基因235delC突變區(qū)結(jié)合，反向野生型引物(SEQID NO 3)其特征在于3，端能夠與GJB2基因235delC未突變區(qū)結(jié)合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法及其試劑盒，其特征在于，GJB2基因第^6-375nt 區(qū)域設(shè)計反向野生型引物(SEQ ID N0:4)，其長度為1848bp之間的核苷酸序列，第 210-235nt區(qū)域設(shè)計正向突變型引物(SEQ ID NO 5)和正向野生型引物(SEQ ID NO 6), 正向突變型引物(SEQ ID NO 5)其特征在于3，端堿基能夠與GJB2基因235delC突變區(qū)結(jié)合，正向野生型引物(SEQ ID NO 6)其特征在于3，端能夠與GJB2基因235delC未突變區(qū)纟口口。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法及其試劑盒，其特征在于，PCR反應(yīng)液中包含熒光檢測物質(zhì)。熒光檢測物質(zhì)為熒光探針或熒光染料STOR GREEOT。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、5所述的方法及其試劑盒，其特征還在于熒光探針的序列位于正向野生型引物(SEQ ID NO 1)和反向突變型引物(SEQ ID NO 2)之間(SEQID NO :7)，其中探針5’端標(biāo)記熒光發(fā)生基團，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4、5所述的方法及其試劑盒，其特征還在于熒光探針的序列位于正向突變型引物(SEQID NO 5)和反向野生型引物(SEQID NO 4)之間(SEQ ID N0:8)，其中探針5 ‘端標(biāo)記熒光發(fā)生基團，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、5、6所述的方法和試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括下列內(nèi)容野生型PCR反應(yīng)液含有IXPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、正向野生型引物 (SEQID NO :1)、反向野生型引物(SEQID NO :3)、熒光探針(SEQ ID NO :7)。突變型PCR反應(yīng)液含有1XPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、去離子水、正向野生型引物(SEQID N0:1)、反向突變型引物(SEQ ID NO :2)、熒光探針(SEQ ID NO 7)或熒光染料STOR GREEN I。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4、5、7述的方法和試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括下列內(nèi)容 野生型PCR反應(yīng)液含有IXPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶、去離子水、正向野生型引物 (SEQID NO :6)、反向野生型引物(SEQID NO :4)、熒光探針(SEQID NO :8)。突變型PCR反應(yīng)液含有1XPCR Buffer、dNTP、Mg2+、Taq酶、UNG酶、去離子水、正向突變型引物(SEQ ID NO: 5)、反向野生型引物(SEQID NO :4)、熒光探針(SEQ ID NO 8)或熒光染料STOR GREEN I。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的方法及其試劑盒，其特征在于待檢測靶核酸樣品來自被檢測者的血液、唾液、羊水細(xì)胞或其它人體組織；陰性質(zhì)控品為蒸餾水、純水或生理鹽水； 陽性質(zhì)控品為為經(jīng)過測序檢驗結(jié)果為GJB2235位點純合野生型的組織、血液、或細(xì)胞系提取的DNA或相應(yīng)的質(zhì)粒載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用熒光定量PCR技術(shù)檢測耳聾相關(guān)基因GJB2235delC突變的方法及其試劑盒。本試劑盒針對GJB2基因235delC突變位點，設(shè)計特異性的寡核苷酸引物，利用熒光物質(zhì)，對一個待測樣本分別用野生型熒光PCR體系和突變型熒光PCR體系進行檢測，通過比較兩次反應(yīng)的Ct值和兩者的差值(ΔCt)大小，判斷樣品是否存在GJB2235delC突變。本發(fā)明的使用不僅能為耳聾患者的病因診斷提供有價值的臨床參考信息，而且可以篩查孕期夫婦是否為攜帶者，為耳聾的產(chǎn)前診斷提供幫助。試劑盒使用特殊的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，特異性檢測GJB2235delC突變位點，具有高通量，閉管自動化操作的優(yōu)點，適合臨床實驗室使用。
文檔編號G01N21/64GK102465174SQ20101053637
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者王寶恒 申請人:王寶恒