專利名稱：通過mapkapk2基因檢測肺癌易感性和判斷肺癌預后的試劑盒及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒，尤其是一種通過MAPKAPK2基因檢 測肺癌易感性和判斷肺癌預后的試劑盒及其用途，通過檢測MAPK激活的蛋白激酶_2 (MAPK activated protein-kinase 2，MAPKAPK2)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點來預測肺癌的易 感性，并且能判斷肺癌患者的預后。屬于醫(yī)療研究領域。
背景技術：
原發(fā)性支氣管肺癌，簡稱肺癌，是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之 一。由于肺癌常伴早期轉移，70%的肺癌病人發(fā)現(xiàn)時已是晚期，其5年生存率目前的平均水 平只有16%，其病情發(fā)展速度與肺癌細胞的生物特性有關。肺癌是一種嚴重威脅人類健康 和生命的疾病。2009年美國報告新發(fā)肺癌219，440例，死亡159，390例(死亡率53. 80/10 萬)。廣州死亡登記的數(shù)據(jù)標明1970 1972年肺癌死亡率為11. 61/10萬，1980 1982 年升為32. 67/10萬，而2000 2002年更上升至48. 79/10萬。上海、天津等大城市死亡登 記的數(shù)據(jù)也都顯示肺癌的死亡率在數(shù)十年間急劇上升。肺癌病因和發(fā)病機制尚未完全明確。目前一致認為吸煙、空氣污染、放射線、肺結 核及鎳化合物等職業(yè)危害是肺癌的危險因素。這些危險因素對細胞而言都是刺激信息，可 激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號傳導通路。 MAPK信號通路進一步調控細胞凋亡、炎癥反應及細胞增殖等過程，導致腫瘤發(fā)生。近年來研 究顯示很多MAPK基因在各種類型肺癌中均有基因表達的改變，而在非小細胞肺癌中發(fā)現(xiàn) 了很多MAPK基因的突變。對MAPK基因的深入研究將為肺癌的基因預防和治療提供理論基 石出。SNP(Single nucleotide polymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性，是人類基因組作圖 的第三代遺傳標記，主要是指一類基于單堿基變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基轉 換、顛換，以及單堿基的插入/缺失等。它是基因組最廣泛存在的一類多態(tài)性標記，已成為 研究基因組多態(tài)性和識別、定位疾病相關的一種工具。1996年成功研制了 SNP檢測的實時 熒光定量PCR技術，實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，還實現(xiàn)了判斷結果的自動性?？衫?熒光定量PCR技術研發(fā)檢測疾病易感性及判斷疾病預后的試劑盒。MAPKAPK2基因位于第1號染色體lq32位置，總長約49kb，由10個外顯子組成，編 碼400個氨基酸的MAPKAPK2蛋白質。MAPKAPK2基因編碼蛋白是一個多功能的蛋白激酶，是 MAPK的重要效應底物。它可通過調節(jié)抑癌蛋白tuberin，而調控細胞周期和細胞間粘連等 功能；可影響肺上皮細胞的抗氧化功能；也可激活熱休克蛋白HSP27、HSP25，抑制細胞凋亡 和細胞運動；還可通過調節(jié)腫瘤壞死因子TNF等的分泌影響巨噬細胞和樹突狀細胞功能， 調節(jié)機體對外源感染的抵抗力。在照射損傷的情況下，MAPKAPK2可調節(jié)DNA修復基因ATM 和/或ATR啟動的細胞周期檢測點，影響機體細胞對DNA損傷的修復。此外，在動物肺癌模 型中，發(fā)現(xiàn)以MAPKAPK2過高表達為肺組織病理改變的重要特征。提示MAPKAPK2可通過多個途徑參與細胞癌變的過程。不僅如此，MAPKAPK2還是一種近年來發(fā)現(xiàn)的重要細胞周期檢 測點調控，影響順鉬、喜樹堿及阿霉素殺傷腫瘤細胞的效果；它還可通過激活LIM分子，參 與VEGF刺激導致的腫瘤血管生成過。提示MAPKAPK2可能與肺癌的預后相關。rs4844550是位于第1號染色體lq32的MAPKAPK2基因啟動子區(qū)域的一個A > G 多態(tài)。其在世界人群的頻率分布，A占0.91，G占0.09左右。中國人群的分布A占0.93，G 占0. 07左右。分子生物學研究表明，A > G的替代導致MAPKAPK2基因啟動子失去了轉錄 因子-芳烴受體抑制因子(AHR repressor, AHRR)結合的位點，增加了 MAPKAPK2基因的表 達。通過大規(guī)模人群的肺癌病例對照研究，MAPKAPK2基因啟動子區(qū)域的A > G多態(tài)與肺癌 發(fā)生相關，這種關聯(lián)在年輕< 60歲者及有腫瘤家族史者尤為明顯。此外還發(fā)現(xiàn)該位點的遺 傳變異與肺癌患者的預后相關，肺癌患者基因型攜帶有G時，預后差。這個SNP的多態(tài)可用 于檢測個體肺癌的易感性，及可用于判斷肺癌患者的預后。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的第一個目的，是為了提供一種通過MAPKAPK2基因檢測肺癌易感性 和判斷肺癌預后的試劑盒，是一種通過MAPKAPK2基因上的rs4844550位點檢測肺癌易感性 和判斷肺癌預后的試劑盒。本發(fā)明的第二個目的，是為了提供一種通過MAPKAPK2基因檢測肺癌易感性和判 斷肺癌預后的試劑盒的用途。本發(fā)明的第一個目的可以通過以下技術方案實現(xiàn)通過MAPKAPK2基因檢測肺癌易感性和判斷肺癌預后的試劑盒，其特征在于1)該試劑盒的物質包括檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異 性引物對及特異性熒光探針對、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgC12溶液、熒光定量PCR反 應緩沖液和去離子水；2)所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性引物對的序列包 括有義引物序列和反義引物序列；所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特 異性熒光探針對包括野生型探針序列和突變型探針序列；3)所述的特異性引物能特異性擴增出包含針對MAPKAPK2基因上的rs4844550號 SNP位點的DNA引物對和DNA探針對。實現(xiàn)本發(fā)明第一目的的一種實施方案是試劑盒中供一人份使用的各成分的含量 為1)10 μ M特異性引物對有義引物序列和反義引物序列各0.225 μ 1，5 μ M特異性熒 光探針對野生型探針序列和突變型探針序列各0. 1 μ 1 ；2) 5unit/ μ ITaq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；3) 20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；4)25mM MgC12 溶液 0· 5μ 1 ；5) 5Χ熒光定量PCR反應緩沖液2 μ 1 ；6)去離子水 4.1 μ 1。實現(xiàn)本發(fā)明第一目的的一種實施方案是所述檢測ΜΑΡΚΑΡΚ2基因上的rs4844550 號SNP位點的特異性引物對的序列如序列表SEQ ID N2 :1所示，有義引物序列的Tm值為59°C，反義引物序列的Tm值為58°C ；所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點 的特異性熒光探針對的序列如序列表SEQ ID N2 2所示，野生型探針序列的Tm值為68°C， 突變型探針序列的Tm值為68 °C。實現(xiàn)本發(fā)明第一目的的一種實施方案是試劑盒的保存溫度為-20°C。本發(fā)明的第一個目的可以通過以下技術方案實現(xiàn)通過MAPKAPK2基因檢測肺癌易感性和判斷肺癌預后的試劑盒，其物征在于用于 檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的基因型。本發(fā)明具有如下突出的有益效果1、本發(fā)明是針對MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點而設計，可通過調節(jié)抑 癌蛋白tuberin，而調控細胞周期和細胞間粘連等功能；可影響肺上皮細胞的抗氧化功能； 也可激活熱休克蛋白HSP27、HSP25，抑制細胞凋亡和細胞運動；還可通過調節(jié)腫瘤壞死因 子TNF等的分泌影響巨噬細胞和樹突狀細胞功能，調節(jié)機體對外源感染的抵抗力。2、本發(fā)明MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的遺傳變異與肺癌患者的預 后相關，這個SNP的多態(tài)可用于檢測個體肺癌的易感性，且可用于判斷肺癌患者的預后，可 廣泛應用于醫(yī)療研究。
具體實施例方式具體實施例1 本實施例包括1)該試劑盒的物質包括檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異 性引物對及特異性熒光探針對、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgC12溶液、熒光定量PCR反 應緩沖液和去離子水；2)所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性引物對的序列包 括有義引物序列和反義引物序列；所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特 異性熒光探針對包括野生型探針序列和突變型探針序列；3)所述的特異性引物能特異性擴增出包含針對MAPKAPK2基因上的rs4844550號 SNP位點的DNA引物對和DNA探針對。本實施例中，所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性引物對 的序列如序列表SEQ ID N2 :1所示，有義引物序列的Tm值為59°C，反義引物序列的Tm值 為58°C ；所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性熒光探針對的序列 如序列表SEQ ID No 2所示，野生型探針序列的Tm值為68°C，突變型探針序列的Tm值為 68 "C。試劑盒中供一人份使用的各成分的含量為1)10 μ M特異性引物對有義引物序列和反義引物序列各0.225 μ 1，5 μ M特異性 熒光探針對野生型探針序列和突變型探針序列各0. 1μ 1 ；2)5unit/y ITaq DNA聚合酶 0.02 μ 1 ； 3)20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；4)25mM MgCl2 溶液 0.5 μ 1 ； 5) 5Χ 熒光定量 PCR 反應 緩沖液2μ 1 ；6)去離子水4. 1 μ 1。試劑盒的保存溫度為_20°C。本發(fā)明的應用實施例1 檢測試劑盒的使用
5
步驟1:DNA模板的提取用硅膠吸附法提取血液標本的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應使用本發(fā)明的熒光定量PCR檢測試劑盒，其中包括下列引物對和熒光探針，均針 對MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點有義引物1 :5，-CTTCTATGCAGGGTCCAGCTAGA-3，(SEQ ID NO :l)Tm 值為 59°C反義引物1 :5，-GGAATGGCTTCTGATTTCCG-3，(SEQ ID NO :2)Tm 值為 58°C野生型探針5，-GGGTTAGCCCCGTGTATCTC-3，(SEQ ID NO 3) Tm 值為 68°C突變型探針5，-GGCTAGCCCCGTGTATCTCA-3，(SEQ ID NO :4)Tm 值為 68°C熒光定量PCR反應體系總體積為10 μ 1，包括DNA模板(20ng/ μ 1) 2 μ 1、10 μ M特 異性引物對(兩條)各0. 225 μ 1、5 μ M特異性引物對(兩條)各0. 1μ l、(5unit/l·! l)Taq DNA 聚合酶 0. 02 μ l、20mM dNTP 混合液 0. 1 μ l、25mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1、5X 熒光定量 PCR 反應緩沖液2 μ 1、去離子水4. 1 μ 1。在ABI 7900ΗΤ型熒光定量PCR儀是進行反應，反應條件為50°C 2 min,95°C lOmin，再進行40 55個PCR循環(huán)92°C 15s，60°C lmin。反應結束后在ABI 7900HT型熒
光定量PCR儀讀取熒光量。步驟3 基因型分析采用ABI 7900HT 型熒光定量PCR儀自帶軟件 SDS (Sequence Detection Systems) V2. 3判讀基因型，自動分析結果。被檢測DNA的MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點 攜帶有T時，為肺癌易感型。本發(fā)明的應用實施例2 指導人們主動預防肺癌步驟1:DNA的提取對被檢測者進行服務前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，填寫生活飲食習慣問 卷表。常規(guī)方法抽取被檢測者EDTA抗凝血5ml。用硅膠吸附法提取血液標本的基因組DNA。步驟2 基因分型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的MAPKAPK2基因上的rs4844550號 SNP位點進行熒光定量PCR檢測，確定該位點的基因型。步驟3 指導人們主動預防肺癌通過對被檢測者基因型的分析，出具基因分型檢測報告和對被檢測者個體化健康 指導報告?；蚍中蜋z測報告詳細說明了被檢測者肺癌易感程度的高低以及患病概率大 小。個體化健康指導報告以被檢測者的基因分型檢測結果為基礎，結合其生活飲食習慣問 卷調查結果，評估被檢測這肺癌遺傳易感的相對風險。同時制定出針對被檢測者的個性化 健康行動方案，包括在飲食習慣、生活方式生活的改進建議等，并為被檢測者普及預防肺癌 的健康知識。本發(fā)明的應用實施例3 指導臨床判斷肺癌預后步驟1 :DNA的提取對被檢測的肺癌患者進行服務前咨詢，由被檢測者簽署知情同意書，由臨床醫(yī)生 提供患者基本臨床信息。在化療前常規(guī)方法抽取被檢測者EDTA抗凝血5ml。用硅膠吸附法 提取血液標本的基因組DNA。
步驟2 基因分型檢測使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者DNA的MAPKAPK2基因上的rs4844550號 SNP位點進行熒光定量PCR檢測，確定該位點的基因型。步驟3 指導人們主動預防肺癌通過對被檢測者基因型的分析，出具基因分型檢測報告和對被檢測者個體化治療 指導報告?；蚍中蜋z測報告詳細說明了被檢測肺癌患者預后的好壞以及生存概率大小。 個體化治療指導報告以被檢測者的基因分型檢測結果為基礎，結合其病理分型、分期等臨 床信息，評估被檢測檢測肺癌患者的3年或5年生存概率。同時制定出針對被檢測者個體 化治療方案，包括是否手術、放化療方案及劑量等。
權利要求
通過MAPKAPK2基因檢測肺癌易感性和判斷肺癌預后的試劑盒，其特征在于1)該試劑盒的物質包括檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水2)所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性引物對的序列包括有義引物序列和反義引物序列；所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性熒光探針對包括野生型探針序列和突變型探針序列；3)所述的特異性引物能特異性擴增出包含針對MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的DNA引物對和DNA探針對。
2.根據(jù)權利要求1所述的通過MAPKAPK2基因檢測肺癌易感性和判斷肺癌預后的試劑 盒，其特征在于試劑盒中供一人份使用的各成分的含量為DlOuM特異性引物對有義引物序列和反義引物序列各0. 225 μ 1，5 μ M特異性熒光探 針對野生型探針序列和突變型探針序列各0. 1 μ 1 ；2)5unit/ μ ITaq DNA 聚合酶 0. 02 μ 1 ；3)20mM dNTP 混合液 0. 1 μ 1 ；4)25mM MgCl2 溶液 0. 5 μ 1 ；5)5Χ熒光定量PCR反應緩沖液2 μ 1 ；6)去離子水4.1μ 1。
3.根據(jù)權利要求1所述的通過ΜΑΡΚΑΡΚ2基因檢測肺癌易感性和判斷肺癌預后的試 劑盒，其特征在于所述檢測ΜΑΡΚΑΡΚ2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性引物對的 序列如序列表SEQ ID N2 :1所示，有義引物序列的Tm值為59°C，反義引物序列的Tm值為 58°C;所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性熒光探針對的序列如序 列表SEQ ID N2 2所示，野生型探針序列的Tm值為68°C，突變型探針序列的Tm值為68°C。
4.根據(jù)權利要求1所述的通過MAPKAPK2基因檢測肺癌易感性和判斷肺癌預后的試劑 盒，其特征在于試劑盒的保存溫度為-20°C。
5.通過MAPKAPK2基因檢測肺癌易感性和判斷肺癌預后的試劑盒的用途，其物征在于 用于檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的基因型。
全文摘要
本發(fā)明公開通過MAPKAPK2基因檢測肺癌易感性和判斷肺癌預后的試劑盒及其用途，其特征在于1)該試劑盒的物質包括檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應緩沖液和去離子水；2)檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性引物對的序列包括有義引物序列和反義引物序列；所述檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的特異性熒光探針對包括野生型探針序列和突變型探針序列；3)特異性引物能特異性擴增出包含針對MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點的DNA引物對和DNA探針對。本發(fā)明通過檢測MAPKAPK2基因上的rs4844550號SNP位點來檢測個體肺癌的易感性，且還能用來評估肺癌患者的預后，可廣泛應用于醫(yī)療研究。
文檔編號G01N21/64GK101974637SQ20101053887
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權日2010年11月9日
發(fā)明者劉斌, 呂嘉春 申請人:廣州醫(yī)學院