專利名稱：一種免疫檢測方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫檢測技術(shù)，尤其是采用阻抗陣列芯片同時進(jìn)行多組分檢測， 并利用微磁球進(jìn)行信號放大，利用外磁場的作用清除吸附磁球以降低背景信號。
背景技術(shù)：
酶聯(lián)免疫分析(ELISA)是一種常見的免疫方法，其利用一抗來實現(xiàn)被測目標(biāo)的捕 捉，同時利用偶聯(lián)有酶標(biāo)的二抗來實現(xiàn)信號檢測。由于酶的催化放大作用，酶聯(lián)免疫可以實 現(xiàn)較為靈敏的檢測，但是，酶是一生物物質(zhì)，性能受很多因素影響，穩(wěn)定性不是很好。同時， 目前人們還主要通過一些光學(xué)的手段，如比色法、熒光法等對酶的催化底物或產(chǎn)物進(jìn)行檢 測。光學(xué)檢測雖然比較穩(wěn)定，但是往往需要較為復(fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，從而使得檢測一般只能在 實驗室中進(jìn)行，限制了應(yīng)用范圍。電化學(xué)檢測通過電極在溶液中進(jìn)行，其放大電路和信號調(diào)理也十分簡單，因此在 簡化酶聯(lián)免疫檢測系統(tǒng)的研究中，是一種很有前途的技術(shù)。目前已經(jīng)有很多利用電化學(xué)手 段來進(jìn)行免疫檢測的報道。例如，在最常見的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記體系中，就有報道 利用底物TMB在酶催化反應(yīng)后的電化學(xué)活性的變化通過電化學(xué)方波法來進(jìn)行檢測。也有些 報道是利用鐵氰化鉀等電子傳遞劑來進(jìn)行電化學(xué)酶聯(lián)免疫檢測。電化學(xué)檢測有很多種模 式，在這之中，特別是溶液阻抗測量，不受電極表面各種情況的影響，十分穩(wěn)定。在免疫反應(yīng)中，利用溶液阻抗進(jìn)行測量，其主要缺點是檢測靈敏度較差。免疫反應(yīng) 只是在電極表面發(fā)生，也只能引起這附近溶液阻抗的變化，而實際所測試的是兩電極間所 有溶液的阻抗。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供了一種可測量多種成分、測量靈敏度高 的免疫檢測方法和裝置。一種免疫檢測方法，包括以下步驟提供陣列，該陣列包括至少兩對微電極；在所述陣列表面具有與被測成分對應(yīng)的一抗抗體；將被測物和微磁球加至所述陣列的表面并進(jìn)行反應(yīng)，所述微磁球上具有與一抗抗 體對應(yīng)的二抗抗體；對所述陣列表面進(jìn)行洗板處理；向所述陣列表面加緩沖液，測量所述微電極之間的參數(shù)，通過分析所述參數(shù)，從而 得到被測物中被測成分的含量。作為優(yōu)選，相鄰微電極的間距為1-1000微米。作為優(yōu)選，所述微磁球的直徑為微米或納米量級。進(jìn)一步，在所述微磁球加至陣列表面后，利用微磁球與其它元件間的力而使微磁 球富集在陣列表面。
進(jìn)一步，在洗板后，利用微磁球與其它元件間的力而吸走未反應(yīng)的磁球。作為優(yōu)選，所述元件為磁鐵。進(jìn)一步，所述陣列固定相同或不同的一抗抗體。進(jìn)一步，所述被測物和磁球是同時加至陣列的表面。進(jìn)一步，先將被測物加至陣列的表面，再將磁球加至陣列的表面。作為優(yōu)選，采用磷酸緩沖液。作為優(yōu)選，所述參數(shù)為阻抗。為了實現(xiàn)上述方法，本發(fā)明還提出了這樣一種免疫檢測裝置，所述檢測裝置包 括陣列，該陣列包括至少兩對微電極；與被測成分對應(yīng)的一抗抗體；微磁球，所述微磁球上具有與一抗抗體對應(yīng)的二抗抗體；用于對所述陣列表面進(jìn)行洗板處理的模塊；緩沖液；用于測量所述微電極之間的參數(shù)的測量模塊；分析模塊，用于分析所述參數(shù)而得到被測物中被測成分的含量。作為優(yōu)選，相鄰微電極的間距為1-1000微米。作為優(yōu)選，所述微磁球的大小為微米或納米量級。進(jìn)一步，所述免疫檢測裝置還包括磁鐵。更進(jìn)一步，所述微電極設(shè)置在陣列的正面，磁鐵設(shè)置在陣列的背面。所述抗體是一種或多種。作為優(yōu)選，所述緩沖液采用磷酸。作為優(yōu)選，所述參數(shù)為阻抗。本發(fā)明所采用的陣列由多個呈方形或矩形排列的電極組成，其相鄰電極的間距在 1微米至1000微米。通過外接的信號檢測電路，每個電極可以和相鄰的電極配合組成一個 電化學(xué)電池，也可以和其他電極配合組成一個電化學(xué)電池，從而可以根據(jù)實際需要進(jìn)行靈 活配置，達(dá)到最大的檢測靈敏度。本發(fā)明總的技術(shù)構(gòu)思為在進(jìn)行免疫測量前，首先需要根據(jù)實際測量的要求，在各 個陣列表面固定上一抗抗體。針對被測溶液中的具體情況，電極陣列的不同區(qū)域可以固定 上相同的抗體，也可以固定上不同的抗體。同時，將和所使用一抗抗體相對應(yīng)的二抗抗體固 定在微磁球上，所用微磁球的直徑根據(jù)實際需要，可以在納米直至微米量級。在進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測時，可以采用一步法或兩步法，也就是可以同時將被測物和 帶二抗微磁球加至陣列表面；也可以先將被測物加至陣列表面，使其反應(yīng)一定時間，然后再 加入帶二抗微磁球至陣列表面。在一步法和二步法中，當(dāng)磁球加入后，在陣列的背面都放置 一磁鐵或電磁鐵，從而富集磁球到陣列表面，加快反應(yīng)速度。在免疫反應(yīng)結(jié)束后，首先按常規(guī)酶聯(lián)免疫反應(yīng)進(jìn)行洗板，然后在陣列表面非?？?近處放置一磁鐵或電磁鐵，在磁場作用下吸走未反應(yīng)磁球，從而降低背景信號。最后，向陣列表面滴加低離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液(< 0. 1M)，并進(jìn)行測量，得到結(jié)果。
采用本發(fā)明的方法，具有以下技術(shù)優(yōu)勢1)利用磁球的體積效應(yīng)，增大了免疫阻抗檢測中由于免疫反應(yīng)所帶來的阻抗變 化，從而提高了檢測靈敏度。2)在免疫反應(yīng)過程中，通過外加磁場的作用將帶行二抗的磁球富集到陣列表面， 從而加快可免疫反應(yīng)速度。在免疫反應(yīng)完成之后，通過外加磁場的作用清除吸附的磁球，降 低了背景信號。3)能夠在電極陣列上固定與不同被測成分對應(yīng)的一抗抗體，以及在磁球上固定與 一抗抗體對應(yīng)的二抗抗體，從而實現(xiàn)多種被測成分的檢測。


圖1是本發(fā)明的免疫反應(yīng)及阻抗檢測示意圖，1 電極，2 被測物質(zhì)，3 帶磁球二 抗，4:固定在基板上的一抗。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例1 一種免疫檢測裝置，用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7，所述裝置包 括提供50x50的微電極陣列，相鄰兩電極的間距為5微米；與沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7對應(yīng)的一抗抗體；施加到微電極陣列的正1微米的微磁球，所述微磁球上具有與上述一抗抗體對應(yīng)的二抗抗體；磁鐵，當(dāng)磁鐵處于微電極陣列的背面時，有助于微磁球吸附在微電極陣列表面；當(dāng) 磁鐵處于微電極陣列的正面時，有助于吸走沒有反應(yīng)的微磁球。用于對所述陣列表面進(jìn)行洗板處理的模塊；緩沖液；本實施例采用低離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液。用于測量所述微電極之間的參數(shù)的測量模塊。本實施例中，測量的參數(shù)為阻抗。分析模塊，用于分析所述參數(shù)而得到被測物中沙門氏菌和大腸桿菌Ecoli0157的含量。一種免疫檢測方法，用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7，所述檢測方法 包括以下步驟提供微電極陣列在普通硅片上首先通過熱氧化生成一氧化硅絕緣層，然后，通過 真空蒸涂及光刻工藝形成50x50的微電極陳列，相鄰兩電極的間距為5微米；利用SU-8等 類似材料再形成一絕緣層，并通過光刻將電極表面裸露；將50x50電極陣列分成兩個區(qū)域，在一個區(qū)域使用時，將另一個區(qū)域用光刻膠等 手段保護(hù)，再分別利用生物素/親和素法以及戊二醛等常見抗體固定方法，在芯片的兩個 區(qū)域分別固定沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7的一抗抗體；在1微米的磁球上同定與上述一抗抗體對應(yīng)的二抗抗體；將被測物和所述磁球同 時施加到微電極陣列表面，在微電極陣列的背面放置磁鐵，從而使微磁球富集在電極陣列表面，提高反應(yīng)速度；如圖1所示，當(dāng)被測物中含有和抗體相對應(yīng)的抗原物質(zhì)時，磁球也被 捕捉在芯片表面；在免疫反應(yīng)結(jié)束后，首先按常規(guī)酶聯(lián)免疫反應(yīng)進(jìn)行洗板，然后在芯片表面非?？?近處放置磁鐵或電磁鐵，在磁場作用下吸走未反應(yīng)的磁球，從而有效地降低了背景信號；向微電極陣列表面滴加低離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液(< 0. 1M)，使用測量模塊分 別統(tǒng)計每個區(qū)域中各個相鄰電極間的阻抗，并根據(jù)所滴加的磷酸緩沖液電阻值設(shè)定閾 值，將高阻抗設(shè)為1，低阻抗歸為0，每個區(qū)域中高阻抗的數(shù)目和沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7的濃度相關(guān)，利用這種關(guān)系得到沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7的濃度。在上述測量中，雖然磁球中的氧化鐵，特別是四氧化三鐵是導(dǎo)體，但由于在二抗固 定等階段磁球表面已經(jīng)包裹一層絕緣物質(zhì)，所以，當(dāng)磁球取代磷酸緩沖液出現(xiàn)在芯片表面， 將增大所測得的溶液阻抗，從而實現(xiàn)測量。實施例2 一種免疫檢測裝置，用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7，與實施例1不 同的是1、每對電極的間距在1微米。一種免疫檢測方法，用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7，與實施例1不 同的是1、每對電極的間距在1微米。實施例3 一種免疫檢測裝置，用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7，與實施例1不 同的是1、每對電極的間距在1微米。2、使用1納米的磁球。一種免疫檢測方法，用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7，與實施例1不 同的是1、每對電極的間距在1微米。2、使用1納米的磁球。實施例4 一種免疫檢測裝置，用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7，與實施例1不 同的是1、在氧化鋁基片上采用厚膜電極制作三對電極，每對電極的間距在800微米。2、使用2微米的磁球。一種免疫檢測方法，用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7，與實施例1不 同的是1、在氧化鋁基片上采用厚膜電極制作三對電極，每對電極的間距在800微米。2、其中兩對電極上分別固定沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7的一抗抗體，另 外第三對電極作為參照。3、在2微米的磁球上固定對應(yīng)二抗抗體。4、根據(jù)所得阻抗值大于參照值的情況，及預(yù)先標(biāo)定情況，確定沙門氏菌和大腸桿菌 E coli0157 :H7 的濃度。實施例5 一種免疫檢測裝置，用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7，與實施例4不 同的是1、每對電極的間距在400微米。2、使用20微米的磁球。一種免疫檢測方法，用于檢測沙門氏菌和大腸桿菌E coli0157 :H7，與實施例4不 同的是1、每對電極的間距在400微米。2、在20微米的磁球上固定對應(yīng)二抗抗體。實施例6 一種免疫檢測裝置，用于檢測轉(zhuǎn)基因殺蟲晶體蛋白BT-CryIAb/IAc，與實施例1不 同的是1、在氧化鋁基片上采用厚膜電極制作兩對電極，每對電極的間距在800微米。2、使用BT-CrylAb/lAc的一抗抗體，該一抗抗體用于施加到其中一對電極上。3、在磁球上固定與所述一抗抗體對應(yīng)的二抗抗體。一種免疫檢測方法，用于檢測轉(zhuǎn)基因殺蟲晶體蛋白BT-CrylAb/lAc，與實施例1不 同的是1、在氧化鋁基片上采用厚膜電極制作兩對電極，每對電極的間距在800微米。2、使用BT-CrylAb/lAc的一抗抗體，該一抗抗體用于施加到其中一對電極上。3、在磁球上固定與所述一抗抗體對應(yīng)的二抗抗體。4、根據(jù)所得阻抗值大于參照值的情況，及預(yù)先標(biāo)定情況，確定BT-CrylAb/lAc的 濃度。上述實施方式不應(yīng)理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。本發(fā)明的關(guān)鍵是，在免疫反 應(yīng)的原理上，利用阻抗測量對被測物進(jìn)行檢測，通過偶聯(lián)在二抗上的微磁球?qū)ψ杩剐盘栠M(jìn) 行放大，通過外加磁場的作用來減少磁球吸附，降低背景信號。在不脫離本發(fā)明精神的情況 下，對本發(fā)明做出的任何形式的改變均應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種免疫檢測方法，其特征在于 提供陣列，該陣列包括至少兩對微電極；在所述陣列表面具有與被測成分對應(yīng)的一抗抗體；將被測物和微磁球加至所述陣列的表面，所述微磁球上具有與一抗抗體對應(yīng)的二抗抗體；對所述陣列表面進(jìn)行洗板處理；向所述陣列表面加緩沖液，測量所述微電極之間的參數(shù)，通過分析所述參數(shù)，從而得到 被測物中被測成分的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫檢測方法，其特征在于相鄰微電極的間距為1-1000微米。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫檢測方法，其特征在于在所述微磁球加至陣列表面后， 利用微磁球與其它元件間的力而使微磁球富集在陣列表面。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫檢測方法，其特征在于在洗板后，利用微磁球與其它元 件間的力而吸走未反應(yīng)的磁球。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫檢測方法，其特征在于所述陣列固定相同或不同的一 抗抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫檢測方法，其特征在于所述被測物和磁球是同時加至 陣列的表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫檢測方法，其特征在于所述參數(shù)為阻抗。
8.一種免疫檢測裝置，其特征在于所述檢測裝置包括 陣列，該陣列包括至少兩個微電極；與被測成分對應(yīng)的一抗抗體；微磁球，所述微磁球上具有與一抗抗體對應(yīng)的二抗抗體； 用于對所述陣列表面進(jìn)行洗板處理的模塊； 緩沖液；用于測量所述微電極之間的參數(shù)的測量模塊； 分析模塊，用于分析所述參數(shù)而得到被測物中被測成分的含量。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫檢測裝置，其特征在于所述微電極設(shè)置在陣列的正面， 磁鐵設(shè)置在陣列的背面。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫檢測裝置，其特征在于所述參數(shù)為阻抗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種免疫檢測方法，包括以下步驟提供陣列，該陣列包括至少兩對微電極；在所述陣列表面具有與被測成分對應(yīng)的一抗抗體；將被測物和微磁球加至所述陣列的表面，所述微磁球上具有與一抗抗體對應(yīng)的二抗抗體；對所述陣列表面進(jìn)行洗板處理；向所述陣列表面加緩沖液，測量所述微電極之間的參數(shù)，通過分析所述參數(shù)，從而得到被測物中被測成分的含量。本發(fā)明還公開了一種實現(xiàn)上述方法的裝置。本發(fā)明具有同時測量多成分、測量靈敏度高、測量裝置簡單等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/68GK102095848SQ20101054989
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者吳堅 申請人:杭州安遠(yuǎn)科技有限公司