專利名稱：革蘭陰性菌脂多糖(內(nèi)毒素)比色檢測試劑盒的制備及其使用方法
革蘭陰性菌脂多糖(內(nèi)毒素)比色檢測試劑盒的制備及其
使用方法所屬領(lǐng)域生物醫(yī)藥范疇，更確切說是應(yīng)用人工合成顯色基質(zhì)，利用革蘭陰性菌內(nèi)毒素激活東方鱟血細胞裂解物中C因子，從而水解合成顯色基質(zhì)B0C-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N， N- 二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N- 二乙氨基苯胺)進而發(fā)生縮合反應(yīng)而定量檢測細菌內(nèi)毒素方法及相關(guān)應(yīng)用于臨床早期診斷革蘭陰性細菌感染的產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
經(jīng)初步檢索，未查到以人工合成顯色基質(zhì)Boc-Val-Ieu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)制備成比色檢測革蘭陰性菌內(nèi)毒素試劑專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是以人工合成顯色基質(zhì)Boc-Val-leu-Gly-Arg_DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N，N- 二乙氨基苯胺)利用微量細菌內(nèi)毒素特異性地激活東方鱟血細胞裂解物中含有的C因子、凝固酶原及凝固蛋白原，從而誘發(fā)東方鱟血細胞裂解物凝固化反應(yīng)。被激活的凝固酶水解合成顯色基質(zhì)釋放出顯色基團DIAN(N，N- 二乙氨基苯胺)，DIAN與1-萘酚-4-磺酸鈉、(1_萘酚_2_磺酸鈉或1_萘酚-5-磺酸鈉)在高碘酸鈉存在下生成藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與形成的縮合物的吸收度在一定范圍內(nèi)呈線形關(guān)系，從而定量檢測出樣品中細菌內(nèi)毒素濃度。 該試劑盒可以用來早期診斷臨床革蘭陰性菌內(nèi)毒素感染。參照說明書附圖
將本發(fā)明內(nèi)敘述如下一、合成顯色基質(zhì)采用生物技術(shù)人工合成Boc-Val-leu-Gly-Arg_DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、 Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)類顯色基質(zhì)。具體合成工藝(見工藝路線圖)。二、東方鱟血細胞裂解物提取、分離2. 1血細胞裂解液配制其中裂解液中成分應(yīng)含有Na+，Mg2+，Ca2+等金屬離子，調(diào)節(jié)PH后并進行121°C 90分鐘滅菌處理后方可使用。2. 2血細胞裂解無菌操作，取約20g血細胞，按照1-5比例加入血細胞裂解液，并用高速均漿機進行200000rpm/min，5-10分鐘破損細胞，將破損后的組織細胞液放入_30°C 冰箱內(nèi)快速冷凍保存10小時，之后將冷凍細胞液取出，在室溫下緩慢溶解，待全部溶解后， 再用高速組織均漿機進行200000rpm/min，5-10分鐘破損細胞，然后將破損后的組織細胞液再次放入-30°C冰箱內(nèi)快速冷凍保存10小時，重復(fù)上次過程2遍即可。2. 3血細胞分離、提取將上述血細胞裂解液取出后進行3000rpm/min，5-8分鐘離心，取上清液，按照1-2比例加入氯仿，劇烈震蕩10分鐘，然后轉(zhuǎn)移至無熱原離心沉淀管中在4°C下進行10000rpm/min，5-10分鐘分離，仔細取出上清液備用。三、顯色合成基質(zhì)及縮合溶液的配制及處理1、顯色合成基質(zhì)溶液配制將顯色合成基質(zhì)用滅菌注射用水溶解，配制成6mM濃度，使用0. 22um濾膜過濾， 4°C保存?zhèn)溆谩?、顯色液A為6mM的1_萘酚_4_磺酸鈉溶液(使用pH 8. 5濃度為0. 05mol的硼酸緩沖液配制)。3、顯色液B為2%高碘酸鈉溶液(使用注射用水配制)。4、顯色液A及顯色液B處理將上述顯色液A及顯色液B配制后，分裝至西林瓶或安瓿瓶中然后進行冷凍干燥。5、顯色合成基質(zhì)溶液處理將顯色合成基質(zhì)溶液，分裝至西林瓶或安瓿瓶中然后進行冷凍干燥。四、反應(yīng)主劑的制備與標定1、取提取、分離好的東方鱟血細胞的上清液，加到含有1. OM氯化鎂0. 5M氯化鈣溶液中，分裝至西林瓶或安瓿瓶中進行冷凍干燥即為反應(yīng)主劑。2、取上述冷凍干燥好的反應(yīng)主劑，按照標示值加入溶解液使其完全溶解，然后用滅菌注射用水1-10倍稀釋，用紫外分光光度計檢測，應(yīng)在270士3nm處有吸收峰。3、將細菌內(nèi)毒素標準品用溶解液溶解并稀釋成最終濃度為50pg/ml溶液，與反應(yīng)主劑反應(yīng)，應(yīng)出現(xiàn)反S型檢測峰。五、革蘭陰性菌脂多糖(內(nèi)毒素)比色檢測試劑盒的性能1、靈敏度將細菌內(nèi)毒素標準品用溶解液依次稀釋成100pg/ml，50pg/ml，25pg/ ml, 12. 5pg/ml，6. 25pg/ml，3. 125pg/ml的標準系列，參照試劑盒使用說明書進行檢測，測定各自的吸光度值；以各標準溶液濃度為X軸，以吸光度值為Y軸作圖分析，其直線相關(guān)系數(shù) r應(yīng)大于0. 980。2、特異性在已知細菌內(nèi)毒素濃度的空白血漿中添加一定量的細菌內(nèi)毒素標準溶液，其檢測回收率應(yīng)在80-120%之間。3、重復(fù)性對同一樣品進行4回檢測，其吸光度值的CV值應(yīng)在10%以內(nèi)。4、測定范圍3. 125-100pg/ml 之間。六、革蘭陰性菌脂多糖(內(nèi)毒素)比色檢測試劑盒的組成1、組成如下表所示
權(quán)利要求
1.革蘭陰性菌脂多糖(內(nèi)毒素)比色檢測試劑盒的制備及其使用方法，以人工合成顯色基質(zhì) Boc-Val-Ieu-Gly-Arg-DIAN(N，N- 二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 或 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN(N, N- 二乙氨基苯胺)，利用微量細菌內(nèi)毒素特異性地激活東方鱟血細胞裂解物中含有的C因子、凝固酶原及凝固蛋白原，從而誘發(fā)東方鱟血細胞裂解物凝固化反應(yīng).被激活的凝固酶水解合成顯色基質(zhì)釋放出顯色基團DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)， DIAN與顯色劑A (1-萘酚-4-磺酸鈉、1-萘酚-2-磺酸鈉或1_萘酚_5_磺酸鈉)在高碘酸鈉顯色劑B的存在下生成藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與形成的縮合物的吸收度在一定范圍內(nèi)呈線形關(guān)系，從而定量檢測出樣品中細菌內(nèi)毒素濃度；試驗過程應(yīng)嚴格按照使用說明書上具體操作方法進行操作，同時要注意一些操作過程中的注意事項；該試劑盒可以用來早期診斷臨床革蘭陰性菌敗血癥感染，作為臨床診斷的參考之一。
2.如權(quán)利要求1所述的人工合成顯色基質(zhì)包括Boc-Val-Ieu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-Ieu-Gly-Arg-DIAN 及 Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN (N，N- 二乙氨基苯胺)三種。
3.如權(quán)利要求1所述的顯色劑A包括1-萘酚-4-磺酸鈉、1-萘酚-2-磺酸鈉及1-萘酚-5-磺酸鈉以及顯色劑B (高碘酸鈉)等。
4.如權(quán)利要求1所述的所生成的藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與形成的縮合物的吸光度在一定范圍內(nèi)呈線形關(guān)系。
5.如權(quán)利要求2所述的人工合成顯色基質(zhì)的濃度為I-IOMol之間，配制后分裝冷凍干燥或溶液在2-8°C避光保存，BoC-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)核磁圖見說明書附圖3。
6.如權(quán)利要求3所述的顯色劑1-萘酚-4-磺酸鈉、1-萘酚-2-磺酸鈉及1-萘酚-5-磺酸鈉的濃度為0. 2-lOMol之間，并使用0. 05-5Mol硼酸緩沖液配制(ρΗ 8. 5-8. 9)，其顯色劑高碘酸鈉的濃度為0. 2-20%之間，使用滅菌注射用水配制，分裝在棕色瓶中冷凍干燥或溶液在2-8 °C避光保存。
7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒具體操作方法為將反應(yīng)主劑掰開，加入反應(yīng)主劑用溶解液0. 1ml，輕輕混勻溶解，分別加入標準品稀釋系列、陰性對照及待測樣品各0. Iml, 37 0C 保溫60-120分鐘；之后分別加入0. Iml合成顯色基質(zhì)，37°C保溫15分鐘；(或使用顯色基質(zhì)用溶解液0. 6ml溶解顯色基質(zhì)混勻，然后再溶解反應(yīng)主劑；取出0. 1ml，分別加入標準品稀釋系列、陰性對照及待測樣品各0. 1ml，37°C保溫60-120分鐘)取出振搖均勻，然后加入顯色劑A 50ul混勻，之后加入0. Iml顯色劑B混勻，室溫放置5_20分鐘，最后在波長 630-680nm檢測吸光度值，計算含量。
8.如權(quán)利要求1所述的試劑盒使用過程中注意外環(huán)境的影響以及所使用器具中含有的細菌內(nèi)毒素的污染，會對測定值產(chǎn)生影響；尤其是顯色試劑添加前操作一定要避免微生物以及細菌內(nèi)毒素的污染。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種革蘭陰性菌脂多糖(內(nèi)毒素)比色檢測試劑盒的制備及其使用方法。本發(fā)明是利用微量革蘭陰性菌內(nèi)毒素激活鱟血細胞裂解物中C因子，從而水解顯色基質(zhì)(Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN，進而發(fā)生縮合反應(yīng)從而定量檢測細菌內(nèi)毒素方法。

發(fā)明內(nèi)容
以人工合成顯色基質(zhì)Boc-Val-leu-Gly-Arg-DIAN(N，N-二乙氨基苯胺)、Boc-leu-Gly-Arg-DIAN或Boc-Thr-Gly-Arg-DIAN，利用微量內(nèi)毒素特異性地激活鱟血細胞裂解物中的C因子、凝固酶原及凝固蛋白原，被激活的凝固酶水解顯色基質(zhì)釋放出基團DIAN，DIAN與1-萘酚-4-磺酸鈉、(1-萘酚-2-磺酸鈉或1-萘酚-5-磺酸鈉)在高碘酸鈉存在下生成藍色縮合物，在630-680nm波長處，酶原激活量與縮合物的吸光度在一定范圍內(nèi)呈線形關(guān)系，從而定量檢測樣品中內(nèi)毒素濃度。該試劑盒可以用來早期診斷革蘭陰性菌敗血癥感染。
文檔編號G01N21/78GK102305788SQ201010552719
公開日2012年1月4日 申請日期2010年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月22日
發(fā)明者何永勝, 苑慶華 申請人:天津市一瑞生物工程有限公司