專利名稱：雷洛昔芬大豆異黃酮片中雷洛昔芬的含量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雷洛昔芬大豆異黃酮片雷洛昔芬的含量測定方法。
技術(shù)背景
鹽酸雷洛昔芬(Raloxifene Hydrochloride, RH)為非留體苯并噻吩衍生物，化學(xué) 名[6-羥基-2-(4-羥基苯基)-苯并[b]噻吩-3-基][4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基] 甲酮鹽酸鹽。大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類次級代謝產(chǎn)物，由于從植物中提取，并與 雌激素有相似結(jié)構(gòu)，因此大豆異黃酮又稱植物雌激素，主要成分大豆甙(Daidzin)，大豆 甙元(Daidzein)，染料木甙(Genistin)，染料木素(Genistein)，黃豆黃素(Glycitin)，黃 豆黃素甙元(Glycitein)等。將SIF和RH配伍制成雷洛昔芬大豆異黃酮片可提高RH的生 物利用度，減少RH的用量，降低副作用，從而提高其臨床療效。
雷洛昔芬(RH)的含量測定，目前主要有高效液相色譜法(HPLC)和紫外分光光度法。
陳燕忠根據(jù)RH的化學(xué)結(jié)構(gòu)，選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的反相色譜 柱，考察了 3種不同比例的流動相，乙腈0.05mol .Γ1醋酸銨08 52,45 55,43 57)， 隨著流動相中乙腈比例的降低，分離效果得到進(jìn)一步改善，其中乙腈0.05mol/L醋酸銨 (43 57)條件可以達(dá)到快速、完全的分離。此時(shí)主峰(RH)與相鄰的雜質(zhì)峰分離度1 > 2，其理論塔板數(shù)η彡2000，檢測波長為289nm，并且經(jīng)峰純度鑒定為單一組分峰。該方法 具有準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、精密度高的優(yōu)點(diǎn)，適用于RH原料及制劑的測定。(陳燕忠，呂竹 芬.RP-HPLC法測定鹽酸雷洛昔芬的含量[J].廣東藥學(xué)，2004，14 ) :22-24)
王倩使用常用的ODS柱，試用不同配比的甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲 醇-水(含三乙胺、磷酸或醋酸)和乙腈-水(含三乙胺、磷酸或醋酸)等試驗(yàn)結(jié)果顯示，使 用甲醇-水或乙腈-水系統(tǒng)時(shí)，色譜峰拖尾嚴(yán)重；但在乙腈-水(55 45)系統(tǒng)中加入十二 烷基硫酸鈉(0. Olmol -Γ1)，并用醋酸調(diào)節(jié)pH值至4. 0時(shí)，可獲得較高的理論板數(shù)，并使RH 與有關(guān)物質(zhì)獲的完全分離。故使用乙腈-0. Olmol · Γ1十二烷基硫酸鈉溶液(55 45，冰 醋酸調(diào)節(jié)PH值至4.0)為流動相。該方法靈敏、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于RH及其制劑的常規(guī) 分析(王倩，張紅梅，于治國.高效液相色譜法測定鹽酸雷洛昔芬含量[J].沈陽藥科大學(xué) 學(xué)報(bào)，2002，19(2) :105-108)。
秦宗會應(yīng)用依文思藍(lán)褪色分光光度法測定雷洛昔芬，操作簡便快捷，靈敏度較高， 體系穩(wěn)定，用于合成樣品中雷洛昔芬的測定，結(jié)果滿意。(秦宗會，范莉，劉紹璞等.依文思 藍(lán)褪色分光光度法測定雷洛昔芬[J].分析化學(xué)，2002，30 (1 =1486-1489)
然而，在雷洛昔芬大豆異黃酮片雷洛昔芬的含量測定時(shí)，因大豆異黃酮的干擾，紫 外分光光度不能正確測定雷洛昔芬的含量。高效液相色譜法也因大豆異黃酮的干擾而不能 正確測定雷洛昔芬的含量，并且測定費(fèi)用高，步驟繁瑣。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種雷洛昔芬大豆異黃酮片雷洛昔芬的含量測定方法。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它使用等吸收雙波長消去法測量雷洛昔芬大豆 異黃酮片中的雷洛昔芬含量，其測定波長為271nm，參比波長為250nm ；所述方法包括以下 步驟
(1)配制待測樣品的乙醇溶液；
(2)測量步驟(1)配制的溶液在波長為271nm和250nm下的吸光度；
(3)按照ΔΑ = 0.0195C+0.0088，r = 0.9999，計(jì)算雷洛昔芬的含量，其中，ΔΑ為 271nm和250nm下的吸光度差值，C為雷洛昔芬大豆異黃酮片中的雷洛昔芬含量。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還可采用以下技術(shù)方案它使用等吸收雙波長消 去法測量雷洛昔芬大豆異黃酮片中的雷洛昔芬含量，其測定波長為271nm，參比波長為 250nm，標(biāo)準(zhǔn)曲線ΔΑ = 0. 0195C+0. 0088的獲得和樣品含量的計(jì)算包括以下步驟
(1)精密稱取一定量105°C下干燥至恒重的雷洛昔芬于對照品置容量瓶中，按照 雷洛昔芬大豆異黃酮片處方中的比例，添加大豆異黃酮及輔料配制成乙醇溶液；
(2)利用上述乙醇溶液，稀釋，配制得不同雷洛昔芬濃度的乙醇溶液；
(3)分別測定步驟(2)配制得到的乙醇溶液在波長為271nm和250nm下的吸光度 A，并以ΔΑ為縱坐標(biāo)，雷洛昔芬的濃度C為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得該曲線的回歸方程 式；
(4)配制待測樣品的乙醇溶液；
(5)測量步驟(4)配制的溶液在波長為271nm和250nm下的吸光度；
(6)按照步驟(3)得到的回歸方程式，計(jì)算雷洛昔芬的含量。
上述步驟(3)得到的回歸方程式是對于波長為271nm和250nm下的吸光度下的恒 定方程式，不以雷洛昔芬大豆異黃酮片的處方之變而變。
根據(jù)步驟(3)得到的所述方程式為ΔΑ = 0. 0195C+0. 0088，r = 0. 9999，其中，ΔA 為271nm和250nm下的吸光度差值，C為雷洛昔芬大豆異黃酮片中的雷洛昔芬含量。
在進(jìn)行上述步驟時(shí)，雷洛昔芬大豆異黃酮片的處方可采用
雷洛昔芬大豆異黃酮的質(zhì)量比=1 2，4%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K3C1)，2%的 羥丙基甲基纖維素(HPMC)，5%的交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(cPVP)，0.2%的硬脂酸鎂，60. 6% 的乳糖，0. 2%的吐溫-80，雷洛昔芬和大豆異黃酮的總質(zhì)量占觀％。
雷洛昔芬大豆異黃酮片(RH-SIF)中RH最大吸收處兩組分吸收光譜有部分重疊， 故可利用等吸收雙波長消去法對其進(jìn)行含量測定。等吸收雙波長消去法的原理是利用兩束 不同波長的單色光入工和λ2，，若以X1為參比波長、λ 2為測定波長交替地照射到同一樣 品溶液，然后由紫外檢測器檢出這兩個波長之間吸光度值之差ΔΑ，ΔΑ與被測組分濃度呈 正比，進(jìn)而計(jì)算求的含量。等吸收雙波長消去法的關(guān)鍵步驟是測定波長λ 2和參比波長X1 的選定，其原則是干擾組分在X1和λ 2處的吸光度值相等，待測組分在入工和λ2處的吸 光度差值△ A足夠大。采用本發(fā)明的方法，能夠避免測定雷洛昔芬傳統(tǒng)時(shí)大豆異黃酮的干 擾，樣品不需預(yù)先分離即可直接測定，測量準(zhǔn)確，并且雙波長法還能消除樣品溶液背景吸收 和混濁的干擾，進(jìn)一步提高測定的準(zhǔn)確性。


圖1為RH、SIF和陰性對照液的紫外吸收曲線。圖中線條1為Solvent blank的曲線，線條2為Adjuvant blank的曲線，線條3為RH的曲線，線條4為SIF的曲線；其中， RH指雷洛昔芬，SIF指大豆異黃酮，Solvent blank指乙醇溶劑，Adjuvant blank指含有處 方輔料的乙醇溶劑，橫坐標(biāo)wavelength為波長，縱坐標(biāo)A為吸光度。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，具體步驟如下
1.紫外吸收光譜的繪制
按照雷洛昔芬大豆異黃酮片處方比例精密稱取105°C干燥至恒重的雷洛昔芬 (RH)和大豆異黃酮(SIF)適量，分別用乙醇制成IOyg. ml-1的RH溶液和20 μ g · ml-1的 SIF溶液，另按所述處方比例的輔料精密稱取輔料適量，用乙醇制成20μ g · πιΓ1的陰性對 照液，以乙醇溶劑為空白，按照分光光度法測定，200 400nm波長范圍內(nèi)掃描，繪制紫外吸 收圖譜，見圖1。
本實(shí)施例中，所述處方為RH SIFSl 2 (占總重量的)，4%的PVP-K3tl和 2 %的HPMC，5 %的cPVP，0. 2 %的硬脂酸鎂，60. 6 %的乳糖，0. 2 %的吐溫-80 ；輔料是指處方 中除RH和SIF之外的物質(zhì)。
2.測定波長與參比波長的選擇
由圖1所示的紫外吸收圖譜可知，雷洛昔芬(RH)在波長處有最大吸收，而 大豆異黃酮(SIF)在此波長處有干擾吸收，故RH可考慮用等吸收雙波長消去法測定。由 于SIF在處的吸收與X軸作平行線無交叉點(diǎn)，因此不能選用為測定波長，選用 271nm為測定波長，此波長處大豆異黃酮(SIF)在250nm和271nm處的吸光度值相等，并且 雷洛昔芬(RH)在27 Inm和250nm處的吸光度差值Δ A足夠大，故選用測定波長27 lnm，參比 波長250nm為測定RH的波長對，ΔΑ = A271nm-A25tlnm。
3.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密稱取105°C下干燥至恒重的RH對照品10mg，置IOOml容量瓶中，另按第1點(diǎn)中 的處方量精密稱取SIF及輔料添加至裝有對照品的容量瓶中，用乙醇溶解，并稀釋至刻度， 搖勻，精密量取0. 2,0. 6,1. 0,1. 4,2. 0,3. Oml置IOml容量瓶中，并加乙醇至刻度，搖勻，得 到濃度為 2μ g · πιΓ\6μ g · Hir1UOy g · πιΓ\ 4μ g · πιΓ\20μ g · πιΓ\30μ g · πιΓ1 的乙 醇溶液，測定各濃度乙醇溶液在271nm和250nm處的吸光度，以Δ A為縱坐標(biāo)，RH的濃度C 為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為ΔΑ = 0. 0195C+0. 0088，r = 0. 9999。結(jié)果表明，RH 在2 30μ g · πιΓ1范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。
4.樣品測定
隨機(jī)取雷洛昔芬大豆異黃酮20片，精密稱定，求出平均片重后研細(xì)，精密稱取細(xì) 粉適量，加乙醇溶解并稀釋制成約10yg/ml的RH樣品溶液，測量它在波長為271nm和 250nm下的吸光度，計(jì)算Δ A值，代入第3點(diǎn)得到的回歸方程式，計(jì)算樣品中的雷洛昔芬含量。
權(quán)利要求
1.一種雷洛昔芬大豆異黃酮片雷洛昔芬的含量測定方法，其特征在于它使用等吸收雙 波長消去法測量雷洛昔芬大豆異黃酮片中的雷洛昔芬含量，其測定波長為271nm，參比波長 為250nm，所述方法包括以下步驟(1)配制待測樣品的乙醇溶液；(2)測量步驟(1)配制的溶液在波長為271nm和250nm下的吸光度；(3)按照ΔΑ= 0.0195C+0. 0088，r = 0.9999，計(jì)算雷洛昔芬的含量，其中，ΔΑ為(1) 配制的溶液在波長為271nm和250nm下的吸光度差值，C為雷洛昔芬大豆異黃酮片中的雷洛昔芬含量。
2.如權(quán)利要求1所述的一種雷洛昔芬大豆異黃酮片雷洛昔芬的含量測定方法，其特征 在于它使用等吸收雙波長消去法測量雷洛昔芬大豆異黃酮片中的雷洛昔芬含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線 ΔΑ = 0. 0195C+0. 0088的獲得和樣品含量的計(jì)算包括以下步驟(1)精密稱取一定量105°C下干燥至恒重的雷洛昔芬于對照品置容量瓶中，按照雷洛 昔芬大豆異黃酮片處方中的比例，添加大豆異黃酮及輔料配制成乙醇溶液；(2)利用上述乙醇溶液，稀釋，配制得不同雷洛昔芬濃度的乙醇溶液；(3)分別測定步驟(2)配制得到的乙醇溶液在波長為271nm和250nm下的吸光度A，并 以ΔΑ為縱坐標(biāo)，雷洛昔芬的濃度C為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得該曲線的回歸方程式；(4)配制待測樣品的乙醇溶液；(5)測量步驟(4)配制的溶液在波長為271nm和250nm下的吸光度；(6)按照步驟C3)得到的回歸方程式，計(jì)算雷洛昔芬的含量。
3.如權(quán)利要求2所述的一種雷洛昔芬大豆異黃酮片雷洛昔芬的含量測定方法，其特征 在于所述雷洛昔芬大豆異黃酮片的處方中雷洛昔芬大豆異黃酮的質(zhì)量比=1 2，4%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K3CI)，2%的羥丙 基甲基纖維素(HPMC)，5%的交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(cPVP)，0.2%的硬脂酸鎂，60. 6%的乳 糖，0. 2%的吐溫-80，雷洛昔芬和大豆異黃酮的總質(zhì)量占。
4.如權(quán)利要求2或3所述的一種雷洛昔芬大豆異黃酮片雷洛昔芬的含量測定方法， 其特征在于所述回歸方程式為ΔΑ = 0. 0195C+0. 0088，r = 0. 9999，其中，ΔΑ為271nm和 250nm下的吸光度差值，C為雷洛昔芬大豆異黃酮片中的雷洛昔芬含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種等吸收雙波長消去法測定雷洛昔芬大豆異黃酮片中雷洛昔芬的含量，選用測定波長271nm，參比波長250nm為測定RH的波長對。樣品不需預(yù)先分離即可直接測定，而且雙波長法還能消除樣品溶液背景吸收和混濁的干擾，提高測定的準(zhǔn)確性，操作簡便、方法快速、準(zhǔn)確度和精密度良好。
文檔編號G01J3/427GK102033046SQ201010555218
公開日2011年4月27日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者李一梅 申請人:李一梅