專利名稱：雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，該雜交瘤細(xì)胞株能夠產(chǎn)生抗伏馬毒素 FBl的單克隆抗體，并用于檢測伏馬毒素FBl污染情況。
背景技術(shù)：
伏馬毒素(Fumonisin，F(xiàn)B)主要是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素。其中FB1是 污染物的主要成分、也是導(dǎo)致毒性作用的主要原因。FB1廣泛存在于世界范圍的玉米及其 制品中，對人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成潛在威脅。研究證明FB1可引起馬的腦白質(zhì)軟化病 (equineleukoencephalomalacia, ELEM)禾口豬的月市水月中綜合癥(porcinepulmonary edema， PPE)。流行病學(xué)資料顯示，人類膳食中FB1污染與食管癌高發(fā)有一定的關(guān)聯(lián)。因此建立一 種快速、靈敏、簡便的檢測方法成為當(dāng)務(wù)之急。目前，用于分析食品及飼料中的FB1的檢測方法較多，有高效液相色譜法(HPLC)、 液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MQ、氣相色譜(GC)、毛細(xì)管電泳法(CZE)等。盡管這些方法具有 較高的靈敏度，但樣品的前處理步驟較多，相對費時且費用較高，特別是不適用于大量樣品 的篩選。酶聯(lián)免疫檢測方法(ELISA)提供了一種伏馬毒素FB1的快速、靈敏、簡便的檢測 方法。科學(xué)家們先后建立了幾種測定FB1 WELISA檢測方法。1994年，Satoshi Fukuda, Ayumu Nagahara, Mamoru Kikuchi 等在 Biosci. Biotech. Biochem.發(fā)表《Preparation and Characterization ofAnti-Fomonisin Monoclonal Antibodies》(Vol. 58(4),765-767)。 2000 年，Ildiko Barna-Vetro, Erzsebet Szabo, bela Fazekas 等在 J. Agric. FoodChem. 發(fā)表〈〈Development of a Sensitive ELISA for the Determination ofFumonisin B1 in Cereals)) (Vol. 48, 2821-2825)中以單克隆抗體測定谷物中的 FBI。2003 年，Μ. Ε. SAVARD， R.C. SINHA, R. LAU, C. SEGUIN 等人在 Food and Agricultural Immunology 發(fā)表的 ((MonoclonalAntibodies for Fumonisin BljB2Bnd B3)) (Vol. 15,127-134)中以單克隆抗體 對玉米樣品中FB1的檢測建立了直接ELISA法。目前我國報道關(guān)于FB1的ELISA檢測方法 還很少。本發(fā)明為檢測FB1，提供一種新的雜交瘤細(xì)胞株，能很好地檢測出玉米及其飼料制 品中伏馬毒素的污染量，為保障食品的安全和畜牧業(yè)的快速健康發(fā)展提供了有力的檢測工 具和手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對目前檢測伏馬毒素FBl存在的問題，提供一種能產(chǎn)生與 FBl發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的IgM亞型抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于在中國典型培養(yǎng) 物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCC NO :C201008，保藏時間為2010年4月15日，保藏地 址為中國武漢武漢大學(xué)。
在本發(fā)明中一種雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于a)將免疫抗原FB1-KLH與弗氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，腹腔注射每只 BALB/C小鼠，每次注射體積為0. 2mL,毒素量為40 μ g，對BALB/C小鼠實施基礎(chǔ)免疫；b)將免疫抗原與弗氏不完全佐劑等體積混合并充分乳化，每隔兩周腹腔注射進(jìn)行 一次，重復(fù)3 4次，每次注射體積為0. 2mL，毒素量為40 μ g ；將免疫抗原與濃度為0. 9 % 的生理鹽水混合，在進(jìn)行細(xì)胞融合前3天，經(jīng)腹腔注射，毒素量為80 μ g，對BALB/C小鼠實施 加強(qiáng)免疫；c)按常規(guī)方法收集免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按10 1的比例以50%的 PEG4000進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)，融合后10 15d，取上清采用間接ELISA法篩 選分泌抗FB1的雜交瘤細(xì)胞株，對所得陽性克隆株采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆；d)重復(fù)c步驟，經(jīng)過4次亞克隆和間接ELISA篩選，得到一株能穩(wěn)定分泌單克隆抗 體的雜交瘤細(xì)胞株。一種上述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體，其特征在于它與FBl發(fā)生抗原抗體 反應(yīng)，屬IgMK型，是由雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)液中獲得，或用雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞種植到實驗 動物腹腔產(chǎn)生腹水而獲得。其中，所述的由雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)液中獲得是指將雜交瘤細(xì) 胞細(xì)胞按IX IO6接種量接種到5mL含20%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37°C含 5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，然后將細(xì)胞培養(yǎng)液在SOOrpm下離心lOmin，收集上清，獲 得單克隆抗體；所述的用雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞種植到實驗動物腹腔產(chǎn)生腹水而獲得是指選 擇健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0. 5mL降植烷，7_10天后每只小鼠腹腔注射雜交 瘤細(xì)胞1 X 106-2X IO6個，待小鼠腹部明顯膨大到一定程度后，用9號針頭抽取腹水，收取的 腹水與4°C、13000rpm離心30min，收集上清，獲得單克隆抗體。一種上述雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于，將雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體 用于檢測伏馬毒素FBI。在雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用中，將所述的單克隆抗體配置在檢測伏馬毒素FBl免疫試 劑盒中。在雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用中，將所述的單克隆抗體制成用于檢測伏馬毒素FBl的膠 體金免疫試紙條。在雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用中，將所述的單克隆抗體制成用于檢測伏馬毒素FBl的免 疫親和柱。在雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用中，通過把雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體用胰蛋白酶或其類似物 經(jīng)酶處理，或經(jīng)還原可獲得本發(fā)明的抗體片段。通過從雜交瘤細(xì)胞中提取mRNAjEWmRNA 制備的cDNA插入到原核或真核表達(dá)載體中，再將載體導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中，然后在其中 表達(dá)所需的產(chǎn)物也可獲得抗體片段。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明所獲得的細(xì)胞株能夠特異性的分泌針對伏馬毒素FBl 的單克隆抗體，具有較好的靈敏度和較高的特異性。本發(fā)明的優(yōu)點還在于利用本發(fā)明獲得的細(xì)胞株所產(chǎn)生的抗體能夠應(yīng)用于多種途 徑，對實際生產(chǎn)有較好的應(yīng)用價值。


圖1抗體SDS-PAGE電泳2用間接競爭ELISA法測定抗體反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3免疫膠體金試紙條功能區(qū)，其中1 玻璃纖維素膜2:聚氯乙烯板3:纖維素 膜4 檢測線5 對照線6 吸收墊圖4為伏馬毒素FBl結(jié)構(gòu)式(Fumonisin Bi)
具體實施例方式雜交瘤細(xì)胞株的建立一、實驗材料1.培養(yǎng)基RPMI1640、新生小牛血清、雙抗、HAT和HT選擇培養(yǎng)基均購自Gibco公 司；弗氏完全/不完全佐劑、降植烷購于Sigma公司。2.實驗動物Balb/c小鼠，6_8周齡，雌性，按一級動物喂養(yǎng)。3.其他材料PEG4000、HRP-羊抗小鼠IgG購自購于Sigma公司；其他試劑均為國 產(chǎn)分析純。二、免疫抗原和篩選抗原的合成A、采用戊二醛二步法合成FB1-KLH免疫抗原(伏馬毒素FB1與乙?；卓拙}血藍(lán) 蛋白偶聯(lián)物)，具體步驟如下(1)將 25% 的戊二醛(GA)用 PH7. 4 的 PBS 稀釋至 2% ；(2)將60mg KLH用上述戊二醛溶液6ml溶解，4°C連續(xù)攪拌反應(yīng)24h后，在PBS緩 沖液中透析36h，除去未反應(yīng)的戊二醛；(3)將Img FB1溶于ImL甲醇中，逐滴加入到上述KLH溶液中，室溫攪拌反應(yīng)1 濁，然后于4°C連續(xù)攪拌15 20h過夜，形成混合液；(4)向上述混合液中加入IOOOppm的硼氫化鈉(NaBH4) 600 μ 1，攪拌2h，中止反應(yīng)， 形成反應(yīng)液1 ；(5)將上述反應(yīng)液1裝入透析袋，在PBS緩沖液中透析72h，分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩、采用戊二醛一步法合成FB1-OVA篩選抗原(伏馬毒素FB1與卵清白蛋白OVA偶 聯(lián)物)，具體步驟如下(1)稱取7mg OVA溶解于ImL 25%乙醇中；(2)將ImgFB1溶于ImL甲醇中在磁力攪拌下于逐滴加入到上述蛋白溶液中，于4°C 緩慢加入25 % GA溶液90 μ L，密封后置于4°C連續(xù)攪拌過18 Mh，形成反應(yīng)液2 ；C3)將上述反應(yīng)液2裝入透析袋，在PBS緩沖液中透析72h，分裝，-20°C保存?zhèn)溆?。三、雜交瘤細(xì)胞株的建立1.動物免疫(1)基礎(chǔ)免疫將免疫抗原TO1-KLH與弗氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，腹腔 注射每只BALB/C小鼠，每次注射體積為0. 2mL,毒素量為40 μ g。(2)加強(qiáng)免疫加強(qiáng)免疫采用免疫抗原與弗氏不完全佐劑的乳化液，每隔兩周進(jìn) 行一次。在進(jìn)行細(xì)胞融合前3天，經(jīng)腹腔注射含80 μ g免疫抗原的生理鹽水溶液。2.雜交瘤細(xì)胞的制備
按常規(guī)方法收集免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按10 1的比例以50%的 PEG4000進(jìn)行融合。用HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)，融合后10_15d，取上清采用間接ELISA法篩選 分泌抗FB1的雜交瘤細(xì)胞株，對所得陽性克隆株采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。間接ELISA法的操作步驟如下用2 μ g/mL FB1-OVA包被酶標(biāo)板，用免疫小鼠血 清1 100作為陽性對照，無克隆生長的培養(yǎng)上清和正常小鼠血清作為陰性對照，每孔加 1 10000羊抗鼠IgG-HRPlOO μ L，最后測定450nm值，凡OD45tl值大于陰性對照2倍以上 者，即可初步判定為陽性克隆。3.雜交瘤細(xì)胞株的建立重復(fù)步驟2，進(jìn)行4次細(xì)胞融合，經(jīng)過4次亞克隆和間接ELISA篩選，得到一株能穩(wěn) 定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為4E10，并于2010年4月15日在中國典型培養(yǎng)物 保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO :C201008，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。4.應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞株4E10所得單抗的效價測定將4E10細(xì)胞在含20%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，每3天傳代 一次，傳代到16代后進(jìn)行單抗效價測定。(1)細(xì)胞培養(yǎng)液上清效價測定將第16代細(xì)胞按IX IO6接種量接種到5mL含20% 新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37°C含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，然后將 細(xì)胞培養(yǎng)液在SOOrpm下離心lOmin，收集上清，用間接ELISA法測定上清中單抗效價，結(jié)果 表明上清效價為1 2000-1 4000。(2)小鼠腹水效價測定選擇健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0. 5mL降植 烷，7-10天后每只小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1 X 106-2 X IO6個，待小鼠腹部明顯膨大到一定 程度后，用9號針頭抽取腹水。收取的腹水與4°C、13000rpm離心30min，收集上清。用間接 ELISA法測定上清中單抗效價，效價為1 IX IO4 1 1X105。5. 4E10細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)將4E10細(xì)胞株在含20%新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)、傳代， 培養(yǎng)到60代后，雜交瘤細(xì)胞株4E10仍然能生長良好、穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)液上清效價仍然可以 達(dá)到1 2000以上。以上結(jié)果表明，所得4E10細(xì)胞株能夠穩(wěn)定傳代，可以持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗伏馬毒素 FBl的單克隆抗體。實施例2、應(yīng)用4E10細(xì)胞株制備抗FB1的單克隆抗體一、抗體制備選擇健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0. 5mL降植烷，7_10天后每只小鼠腹 腔注射雜交瘤細(xì)胞1 χ 106-2X IO6個，待小鼠腹部明顯膨大到一定程度后，用9號針頭抽取 腹水。收取的腹水于4°C，13000rpm離心30min，收集上清。收集的腹水采用飽和(NH4)2SCUX淀法進(jìn)行純化，具體步驟為取上述步驟中的 上清，加入等體積PBS緩沖液，再加入等體積醋酸緩沖液和33 μ L辛酸，磁力攪拌30min。 于4°C，3000rpm離心30min，取上清；加入等體積的飽和(NH4)2SO4溶液，4°C靜置4h，再于 4°C、3000rpm離心30min，棄上清；沉淀中加入與第一次相同體積的PBS緩沖液，透析，每隔 證換液一次，透析后的蛋白溶液過0. 45 μ m孔徑的微孔膜，得到抗FBl的單克隆抗體(mAb 4E10)。
二、抗體mAb 4E10鑒定及結(jié)果如下1、抗體純度鑒定將mAb 4E10用12% SDS-PAGE電泳鑒定純度，電泳圖如圖1所示，圖中A為蛋白標(biāo) 記物，B為細(xì)胞株4E10所生成的小鼠腹水，C為純化后的小鼠腹水，D為純化上清。2、抗體mAb 4E10亞類鑒定采用小鼠抗體分型試劑盒(sigma)鑒定抗體的亞型。測定結(jié)果表明mAb 4E10的 亞型為IgM。3、檢測抗體mAb 4E10的輕鏈和重鏈的氨基酸序列。經(jīng)氨基酸序列測序表明，抗體mAb 4E10的重鏈的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO. 1的氨基酸殘基序列，輕鏈的氨基酸序列為序列表中SEQ ID NO. 2的氨基酸殘基序列。4、交叉反應(yīng)率(Cross Reactive, CR% )利用FB1標(biāo)準(zhǔn)品和類似結(jié)構(gòu)的相關(guān)化合物進(jìn)行交叉反應(yīng)實驗。交叉反應(yīng)率(CR)= IC5tl (FB1)/IC5tl (其它類似物)X 100% (IC5tl是抑制率為50%的吸光度時所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃 度)。從下表數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明的抗體除了與結(jié)構(gòu)形似的FB2有一定的交叉反應(yīng)，與其他類 型的真菌毒素交叉反應(yīng)率很低，說明本抗體具有較好的特異性。表ImAb 4E10與鐮刀菌屬產(chǎn)生的其它毒素的交叉反應(yīng)
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于其保藏編號為CCTCC N0:C201008。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株的制備方法，其特征在于按如下步驟獲得a)將免疫抗原FB1-KLH與弗氏完全佐劑混合并充分乳化，腹腔注射對BALB/C小鼠實施 基礎(chǔ)免疫；b)收集免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)，融合后 10 15d，取上清采用間接ELISA法篩選分泌抗FB1的雜交瘤細(xì)胞株，對所得陽性克隆株采 用有限稀釋法進(jìn)行亞克?。籧)獲得一株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
3.一種由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆 抗體與FBl發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，屬IgM亞型的抗體，是由雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)液中獲得，或 用雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞種植到實驗動物腹腔產(chǎn)生腹水而獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體重鏈的氨基酸序 列為序列表中SEQ ID NO. 1的氨基酸殘基序列，所述的單克隆抗體輕鏈的氨基酸序列為序 列表中SEQ ID NO. 2的氨基酸殘基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其特征在于由雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)液中獲得 是指將雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞按ι χ IO6接種量接種到5mL含20%新生小牛血清的RPMI1640培 養(yǎng)基中，在37°C含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，然后將細(xì)胞培養(yǎng)液在SOOrpm下離心 IOmin,收集上清，獲得單克隆抗體；用雜交瘤細(xì)胞株細(xì)胞種植到實驗動物腹腔產(chǎn)生腹水而 獲得是指選擇健康的BALB/C小鼠，先向小鼠腹腔注射0. 5mL降植烷，7_10天后每只小鼠 腹腔注射雜交瘤細(xì)胞IXlO6 2X IO6個，待小鼠腹部明顯膨大到一定程度后，用9號針頭 抽取腹水，收取的腹水于4°C、13000rpm離心30min，收集上清，獲得單克隆抗體。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于，將雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生 的單克隆抗體用于檢測伏馬毒素FBI。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于將所述的單克隆抗體配置在 檢測伏馬毒素FBl免疫試劑盒中。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于將所述的單克隆抗體制成用 于純化伏馬毒素FBl的膠體金免疫試紙條。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于將所述的單克隆抗體制成用 于純化伏馬毒素FBl的免疫親和柱。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株的應(yīng)用，其特征在于通過把雜交瘤細(xì)胞產(chǎn) 生的抗體用胰蛋白酶或其類似物經(jīng)酶處理，或經(jīng)還原可獲得的抗體片段；通過從雜交瘤細(xì) 胞中提取mRNA，把從mRNA制備的CDNA插入到原核或真核表達(dá)載體中，再將載體導(dǎo)入原核或 真核細(xì)胞中，然后在其中表達(dá)所需的產(chǎn)物也獲得抗體片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，該雜交瘤細(xì)胞株能夠產(chǎn)生抗伏馬毒素FB1的單克隆抗體，并用于檢測伏馬毒素FB1污染情況。一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于其保藏編號為CCTCC NOC201008。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明所獲得的細(xì)胞株能夠特異性的分泌針對伏馬毒素FB1的單克隆抗體，具有較好的靈敏度和較高的特異性。本發(fā)明的優(yōu)點還在于利用本發(fā)明獲得的細(xì)胞株所產(chǎn)生的抗體能夠應(yīng)用于多種途徑，對實際生產(chǎn)有較好的應(yīng)用價值。
文檔編號G01N33/577GK102127523SQ20101055662
公開日2011年7月20日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者史建榮, 徐劍宏, 林凡云, 祭芳, 薛秋燕 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院