專利名稱：用于分選細胞的方法和設備的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種采用多角度區(qū)別檢測和成像系統(tǒng)的、用于分選細胞的流分選儀。 本發(fā)明的另一方面涉及一種用于光學檢測以及用于物體成像的方法和設備。
背景技術(shù)：
公知的成像系統(tǒng)趨向于是方位角對稱(azimuthally symmetric)的，在由成像系 統(tǒng)的數(shù)值孔徑(NA)建立的特定角度范圍內(nèi)接受光。在沒有過小的孔徑或光學器件所產(chǎn)生 的漸暈或像差的情況下，NA內(nèi)的來自物平面的所有光被均勻地理想傳輸?shù)匠上衿矫?。這種 設計的理由是具有合理高的光收集效率(即高NA)是所期望的，并且強度的角度變化常常 不承載重要信息。一個示例性的成像系統(tǒng)是單個圓透鏡或一對圓透鏡。對于期望高收集效率的情 形，如在暗的成像系統(tǒng)中，使用這樣的光學元件來設計高NA系統(tǒng)，該光學元件與物體尺寸 相比是大的并且與物體尺寸相比是近的。這樣，透鏡捕捉了大部分的光。高NA對于最大化 分辨率和獲得窄的焦深也是重要的。流細胞儀是使用光學散射和熒光來區(qū)別細胞或其它小物體如熒光珠并基于經(jīng)區(qū) 別的光學測量結(jié)果對它們進行分選的裝置。當物體流過窄噴口時，輸入激光散射，碰撞在物 體上，并激發(fā)熒光。以變化的角度檢測散射光和熒光信號，以特征化和區(qū)別具有不同特性的 物體。性別分選精子的一個困難是精子、尤其是牛精子的非常扁平的形狀。與DNA相對 于水環(huán)境的較高折射率相結(jié)合，扁平形狀造成包括源于精子頭中的熒光的光的透鏡化和內(nèi) 反射。此透鏡化使得光優(yōu)先地通過精子的邊緣發(fā)出，而通過精子頭的兩個扁平面的發(fā)射則 低得多。因此，精子的X或Y染色體內(nèi)容的確定和光強度的檢測依賴于精子的可靠對齊和 從多角度查看精子熒光的能力。公知的對齊系統(tǒng)采用這樣一種裝置，其中精子細胞借助于諸如Rens等人的美國 專利No. 5，985，216中說明的噴嘴來被定向并噴射到檢測帶中。在這種裝置中，分選噴嘴具 有用于對扁平的細胞進行定向的橢圓截面。Rens的一個缺點是如果流速率高于約5000精 子細胞/秒，則所述細胞不能被可靠地成像和特征化。5000精子細胞/秒的精子流速率是 低效且耗時的。用于精子分選的更為實用的速率約為100，000精子細胞/秒或更高?！N用于操縱小顆粒的成像系統(tǒng)在下列專利申請中進行了描述2004年10月觀 日提交的標題為“SYSTEM AND METHOD FOR MANIPULATING ANDPROCES SING NANOMATERIALS USING HOLOGRAPHIC OPTICALTRAPPING” 的美國專利申請 No. 10/974, 976 以及 2004 年 9 月 3 日提交的標題為 “MULTIPLE LAMINAR FLOW-BASED PARTICLE AND CELLULARSEPARATION WITH LASER STEERING”的美國專利申請No. 10/934，597，這兩個專利申請的教導通過引用 結(jié)合于此。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種采用多角度區(qū)別檢測和成像系統(tǒng)、用于分選細胞的流分選儀。本 發(fā)明的一個方面涉及一種用于光學檢測和用于物體成像的方法和設備。特別而言，本發(fā)明 涉及一種用于通過性別來特征化和分選牛精子的方法和設備。然而，應理解也可以使用本 發(fā)明來分選其它類型的哺乳動物精子細胞等等。本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)一種用于對細胞進行分選和定向的流分選儀采用具有入 口、出口、中間檢測帶以及任選的分選區(qū)的流通道。入口接納輸入鞘液(sheath fluid)的 交替間隔的流中的每一個以及在鞘流之間的包含待被分選的細胞的樣品流。鞘流和樣品流 在流室中具有相應的流速率或壓力，使得樣品流被縮窄，從而在檢測區(qū)中形成相對窄的樣 品流，由此細胞被定向在所選擇的相對于輸入光的方向上。采用多角度或K矢量成像設置 的檢測器被聚焦于檢測帶中，以便于區(qū)別期望細胞和非期望細胞。


圖1是用于分選已染有熒光染料的細胞的步驟的流程圖；圖2是根據(jù)本發(fā)明的流裝置或筒(cartridge)的透視示意性圖示；圖3是用于分選的單通道流裝置的示意性圖示；圖4是用于分選的多通道流裝置的側(cè)視圖；圖4A是面向圖4中所示的多通道系統(tǒng)的輸入的俯視圖(邊視圖)；圖5是用于感測散射光的單通道傳感器(即用于K矢量成像的光學系統(tǒng))的示意 性表示；圖5A-5D圖示了圖5的布置中采用的可替選光學元件；圖6是使用K矢量成像來檢測熒光和散射光的單通道傳感器的示意性表示；圖7是利用散射光和熒光的激發(fā)和檢測來進行K矢量成像的多通道通道裝置。圖8是調(diào)整用于分選細胞的通道或裝置中的流速的外部激勵器的示意性表示；圖9是用于檢測和分選細胞的多通道裝置或筒的頂視圖的示意性表示；圖10A-10D示出了在M、W、F上使用三個激勵器(圖10A)，在S1、S2上使用兩個激 勵器(圖10B)，在Sl上使用一個激勵器(圖10C)以及在M、F上使用兩個激勵器(圖10D) 來操縱細胞的各種可替選方式；圖1IA-IIB示出了通過激光殺滅或激活(圖11A)以及電殺滅或激活(圖11B)來 殺滅細胞的各種可替選方式。
具體實施例方式圖1圖示了闡述用于特征化、分選并處理物體、特別是牛精子細胞以便低溫保存 的步驟的流程圖。從收集100、延伸101到慢冷卻102的第一階段是各個工序的主題，這些工序中的 一些是新穎的，而另一些是公知的。在提交于2005 年 2 月 1 日的、標題為“Novel Method For In Vivo Staining ofCells for Identification and Sorting”的未決美國專利申請序列號(待分配)中闡 述了一種為了分選而對細胞進行準備的新穎系統(tǒng)，該申請的教導通過引用結(jié)合于此。
所述步驟包括將樣品裝載到一次性片中200;過濾樣品以去除大的粒料 (aggregate material)如卵黃粒(yolk aggregate) 201 ；采用如下文中闡述的基于流的對 齊202 ；采用并行化的性別檢測203、區(qū)別(即性別區(qū)別204)以及激勵(即性別激勵205) 步驟；被動濃度平衡206，并遞送到輸出儲器207。該方法還可以任選地省略某些步驟，而包 括用于去除非期望的活精子的區(qū)別和殺滅步驟。包括上述內(nèi)容的性別分選步驟103之后是慢冷卻到4°C并穩(wěn)定104 ；最終延伸 105 ；包裝在莖管中106 ；穩(wěn)定107和冷凍108步驟。圖2-3以各種形式圖示了根據(jù)本發(fā)明的流細胞儀300。該裝置可以是單通道系統(tǒng)。 然而，本發(fā)明也很適合于特別是必須在合理的時間量內(nèi)分選大量精子細胞的精子細胞分選 應用中的多通道應用。在圖2-3中，裝置300包括由一對相面對壁314和端壁316(圖1中只示出其中的 一個)、開放頂部或輸入318以及開放底部或輸出320構(gòu)成的體或流室312。輸入318分成三部分，包括外側(cè)輸入322以及中央或樣品輸入324。外側(cè)輸入322 用于在其中接納鞘液326，而中央輸入3M用于接納樣品流體328，樣品流體3 包含液體 介質(zhì)和分散于其中的細胞330。輸出320具有外側(cè)輸出部分332以及中央樣品收集通道，即左輸出樣品通道334L、 中央輸出樣品通道334C和右輸出樣品通道334R。通道334L用于第一被分選樣品，334C用 于第二被分選樣品，而334L用于又另一被分選樣品。鞘液326以所選流速率在外側(cè)輸入322處輸入。樣本液326以所選擇的相對于鞘 流速率或壓力的流速率或壓力在中央輸入324中引入，使得鞘液將樣品流壓縮和縮窄為如 所示的相對窄的樣品流路徑336。在示例性實施例中，樣品流路徑336的寬度是中央輸入 324處的樣品流體的寬度的約10%或更小，例如約50微米。細胞330是圓形的，但是扁平的。因此，樣品流體的縮窄導致細胞330對自身定向， 使得其扁平面大致平行于相面對壁314。細胞所輻射的光的強度在不同取向是不同的。所 以，為了比較兩個或更多細胞的強度，它們必須具有相同的取向。這樣，對齊的細胞降低了 由具有隨機取向的各向異性光發(fā)射器導致的噪聲或系統(tǒng)誤差。輸入樣品或物體溶液3 和鞘液326(見圖幻的交替輸入進入系統(tǒng)，產(chǎn)生少量的 縮窄(相對于正交方向上的縮窄)401，這導致切變，且切變流與細胞400對齊。此交替流模 式在兩個長輸入鞘液流之間被更為嚴重地擠壓，這實現(xiàn)了必要的對齊。在下文中，此布置可 以與檢測相結(jié)合來提供可探詢多個流的并行系統(tǒng)。特定地，縮窄流將物體移入焦平面402，并加速運動穿過檢測區(qū)403。系統(tǒng)中的曲 線404示出液邊界404，并且檢測區(qū)405允許特征化。光錐406允許探詢，并且可以在多個 出口之間操縱缺省的流位置407。通過改變穿過三個輸出通道409-411的流速率，溶液中的細胞或其它物體可以被 分選到多個輸出流中的一個中。激勵可以以上面所列舉的各種方式來完成。高速流切換 可以由壓電裝置來執(zhí)行，所述壓電裝置可以是機器所固有的或者是一次性流通道筒所固有 的。流切換區(qū)408控制精密的流速率(其隨時間變化)以在輸出通道409-411之間切換 (其中V2 < Vl且V4 V2)。檢測器340(圖2)包括在處于輸入和輸出中間的檢測帶338中產(chǎn)生指向樣品流路徑336的輸出束344的激光器342或其它適合的源。束344撞擊檢測帶338中的細胞330 并散射形成輸出束346。該細胞包含熒光體并因此產(chǎn)生熒光，其同樣被包含在輸出束346 中。輸出束346的散射分量和熒光分量346S、346F被分別輸入到包含光學系統(tǒng)348和電子 檢測器系統(tǒng)350的光檢測器。該光學系統(tǒng)和電子檢測器系統(tǒng)在下文中討論。輸出束346將信息運載到檢測器340，檢測器340區(qū)別細胞330并產(chǎn)生至分選儀 356的輸出354。分選儀356控制與輸出通道334成可工作關系的驅(qū)動器358，以便改變相 對流速率，使得每個細胞330被分選入適當?shù)耐ǖ?。可替選地，可以按照想要或不想要來分 選細胞，且可以收集想要的細胞，而可以破壞不想要的細胞。圖3示出了僅具有兩個鞘流3 和一個樣品流328的單通道系統(tǒng)。圖4示出了具 有4個樣品流3 和共享的鞘流326的多通道系統(tǒng)。圖4A示出了流室和流路徑的俯視圖。圖4-4A示出了將設計并行化為具有輸入溶液的許多并行流500的一種可能方式。 流可以在該平面和該平面的法向上縮窄。然而，對于細胞的對齊為必需的情況，如對于牛精 子，沿入射光方向的切變必須大得多，以保證垂直于入射光的對齊。光學探查區(qū)502是激光 散射和熒光發(fā)生的地方。在該實例中，每個鞘具有專用的透鏡系統(tǒng)，多個PMT元件中的每一個被專用于對 應的流。應理解，系統(tǒng)同樣可以針對所有通道使用一個透鏡檢測器系統(tǒng)以及針對所有通道 使用一個激光光學器件系統(tǒng)。針對每個流存在多個可能的輸出通道503。圖5示出了檢測器640的光學系統(tǒng)的簡化平面圖。樣品660處于物平面662上。 在此圖示中，輸出束或光線646以小束646C、646L、646R從樣品660發(fā)出。小束646C代表 中心光軸C附近的群集在中心的束；而小束646L和646R群集在中心軸C的左方和右方。 小束提供樣品660的不同視圖。收集透鏡664(其可以是顯微鏡的物鏡)被定位于距物平 面662的一距離處，該距離等于透鏡的有效焦距(EFL)。如果期望，透鏡664可以是復合透 鏡，但為了簡單起見，將其描述為具有EFL的單透鏡。通過這樣定位透鏡664，來自物體的光 646離開收集透鏡664，被準直為小束666，小束666類似地分為如所示的666R、666C、666L。 這產(chǎn)生了成像系統(tǒng)中的無限空間。盡管本發(fā)明不需要此無限空間，但它是方便的布置。每 個準直光線的橫向定位主要由其從物平面出射的角度來確定。小束666L、666R和666C分 別跟隨 642L、642R 和 642C。中心光小束666C沿中心軸C離開透鏡664到聚焦透鏡676C，聚焦透鏡676C將光 聚焦在前像平面680C上。反射鏡672L、672R使離開收集透鏡664的離軸小束666L和666R 分開。注意這還可以通過在此區(qū)中放置與此空間中的束尺寸相比較小的光纖674B(圖5B) 或檢測器674A(圖5A)來完成。還注意，附加光學元件如附加透鏡674C(圖5C)或針孔 674D(圖5D)可以被插入此空間中，以限制從收集透鏡664出射的光的角度范圍，或者控制 (限制或擴展)如在共焦顯微術(shù)測量中收集光的焦距。在某些情況下，可以使用一對具有針 孔的附加透鏡。在其它情況下，可以使用具有可控尺寸、形狀或位置的遮光板來控制到達給 定檢測器的光。來自小束666L的光被反射鏡672L偏轉(zhuǎn)到左聚焦透鏡676L ；而來自小束666R的 光被反射鏡672R引導到透鏡676R和右像平面678R。光檢測器680L、680R和680C可以定 位于相應的像焦平面670L、670R和670C上，以檢測相應的像。這些光檢測器可以是(XD、光 電二極管、光電倍增管、多陽極光電倍增管或其它傳感器。
在許多情況下，理想的是，收集散射光和熒光二者，其中，所作出的像或檢測中的至 少一個需要從樣品發(fā)出的光線角度的范圍被減小。圖6圖示了這可以怎樣使用如上所述的K 矢量成像設置、但必要時利用濾光器和附加的分束器來完成。類似的元件具有相同的標號。在圖6中，照明和激發(fā)光800穿過收集透鏡801，并分別被反射鏡802、803反射， 穿過發(fā)射濾光器688EL、688ER到聚焦透鏡804、805并到形成左和右熒光像平面的光檢測器 690L、690R。分束器686C將中心場666C中的光重引導穿過發(fā)射濾光器688E到聚焦透鏡 676FC。發(fā)射濾光器688E的輸出689E對應于來自細胞的熒光發(fā)射。中心光軸上的激光線 濾器688L使到透鏡676C和光檢測器690C的散射激光濾過，在光檢測器690C處形成前散
射像平面。為了改進裝置的吞吐量和總體能力，需要進行并行化。圖7示出了這是如何完成 的。激光器642產(chǎn)生輸入激光束644 (其激發(fā)熒光)，被分束器690 (例如衍射光柵或全息 圖)分解成N個(多個)束。束692A和692N散開，并且每個被引導到對應樣品鞘(見圖 4)的檢測帶。小束692A-692N被準直透鏡694準直成平行束。準直透鏡694的輸出696被 引導穿過柱透鏡698，柱透鏡698將各個束700A-700N聚焦到物平面701上的樣品流上。如 所示的那樣(圖4)，輸入流被分解成許多流。來自樣品流和所示實例中的一個或所有小束 700A-700N的光進入收集透鏡701，并如上面在圖6中所描繪的那樣處理。然而，這里使用
檢測器陣列裝置(如多陽極PMT)裝置720(720C、720R、720L、720CF.....)(針對每組檢測
束使用一個)。檢測不是通過在每個成像位置放置單檢測器、而是通過使用陣列檢測器如 32元件線性PMT陣列720來最好地完成的。對許多物體進行測量或成像的系統(tǒng)的吞吐量將部分地依賴于檢測器數(shù)目和它們 的速度。對于許多應用來說，在每個像平面上使用單檢測器如光電倍增管(PMT)。這適合于 物體以一列(single-file line)穿過物平面的情況。下文中對分選儀856進行詳細描述。單通道分選儀在圖8中示出。分選儀856包 括結(jié)構(gòu)構(gòu)件812 ；由限定流通道820的槽818形成的通道限定層816 ；在通道限定層816頂 上的撓性膜層822 ；以及完成該布置的結(jié)構(gòu)構(gòu)件824。壓電的或另一類型的激勵器擬6被耦 合到控制器828。由激勵器擬6驅(qū)動的活塞860與對著流通道820的撓性膜822接合，以根 據(jù)到壓電裝置的電壓供給來改變通道內(nèi)的流模式。多個這樣的結(jié)構(gòu)可以被小型化，以便定 位于激勵器窗口中，由此可以分選多個樣品流。一個或多個激勵器擬6可以包括壓電變送器(piezo-electric transducer)，用 于將電信號轉(zhuǎn)換成流速率的機械激勵；熱加熱器，用于加熱一個區(qū)以使流體、材料或泡快速 膨脹；熱泡生成，用于產(chǎn)生泡以減小溶液的流量；用于膜的電容性運動裝置；光學裝置，用 于加熱或移動材料、壁、膜、泡或其它材料或物體，以影響進入一個或多個輸出通道934的 流速。該激勵可以是該裝置所固有的或者可以外部施加。例如，激勵器擬6和活塞860可 以是與一次性流裝置856 (即具有非一次性/外部激勵器的一次性片)分開的外部設備。圖9圖示了多通道的并行布置，其中輸入通道900將鞘流饋送到流通道，并且輸出 通道901接納各種被分選的精子細胞。窗口 930被提供用于將探詢光耦合到每個并行檢測 器樣品通道。分選儀窗口 932接納多個激勵器和一次性分選儀元件。裝置100的片配準銷 以940標出。
圖10A-10R圖示了在用于分選精子的流裝置中采用各種激勵器934來操縱細胞的 可替選實施例。在每種情況下，使用一個或多個激勵器，其中每個激勵器可以基于壓電裝置 (筒所固有的或外在的)、電容性激勵器、熱膨脹或現(xiàn)有公開中描述的其它技術(shù)。在大多數(shù) 情況下，需要至少兩個激勵器934，且可能多于兩個激勵器，以控制特定細胞或物體進入哪 個出口通道936。所述激勵器允許控制和改變非常高速率的流。為使得流暫時地從一個出 口移動到另一出口，只需要對流進行小的擾動。圖11A-11B示出了不進行分選以便實現(xiàn)期望結(jié)果的殺滅或激活設置的實例。在圖 IlA中，激光940碰撞物體/精子流942。此激光被控制為根據(jù)探詢結(jié)果只將致命能量碰撞 在特定精子或物體上。例如，此激光可以按需要殺滅特定的精子或其它細胞。例如，其可以 殺滅給定或不確定性別的所有精子?？商孢x地，該激光可以不直接殺滅細胞，而是可以“激 活”它們。例如，其可以激活先前已引入到精子中的某化學物質(zhì)，從而具有殺滅它們或損害 受精的總體效果。在更為一般的應用中，激活可具有大得多的活性范圍。圖IlB示出了使用通過電極944引入的致命電脈沖的殺滅或激活，其中電極944 被插入流中以便位置上接近中央流942。與激光方案一樣，電極可以根據(jù)探詢結(jié)果來被快速 脈沖接通或關斷。操縱還可以光學地實現(xiàn)，其中細胞由光學捕獲設備操縱。可替選地，激勵過程可以 是細胞的電穿孔，其可以是致命的或者對細胞產(chǎn)生其它影響。下面的技術(shù)使用擠壓流來對齊精子細胞使用蠕動泵(peristaltic pump)將三個流饋送到流片中。每個流被保持在層流 狀態(tài)(laminar regime)，以使得每個流彼此不混合。包含精子的流在為水的頂部和底部流 之間流動。當通過改變頂部和底部流的速度與精子流的速度的比率而使頂部和底部流的速 度保持相同時，我們可以看到精子流的擠壓。
權(quán)利要求
1.一種用于在物平面上對物體成像的傳感器，包括 使用K矢量成像來照射所述物體的光源；收集透鏡，其設置在距所述物平面預定距離處，該預定距離等于所述收集透鏡的有效 焦距；其中，照射所述物體產(chǎn)生光束，所述光束離開所述收集透鏡并且被準直為小束，所述小 束被分開從而形成所述物體的多個像，所述物體的所述多個像采取以相對于所述傳感器的 中心軸的不同角度離開所述物平面的光的形式；并且，其中，每個準直小束的橫向定位主要由其從所述物平面出射的角度來確定；以及 響應于來自所述物體的光的檢測器。
2.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其中所述檢測器響應于沿著所述傳感器的所述光軸引 導的光和偏離所述檢測器的所述軸而引導的光中的至少一種。
3.如權(quán)利要求2所述的傳感器，其中所述離軸檢測器包括用于檢測所述物平面上的不 同位置所對應的離軸光的、相對于所述中心軸橫向移置的至少兩個光電檢測器。
4.如權(quán)利要求3所述的傳感器，還包括用于使來自每個光束的熒光和散射光中的至少 一種濾過的濾光器。
5.如權(quán)利要求3所述的傳感器，其中所述光電檢測器包括用于檢測多個光束的多元件 光電倍增管。
6.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其中所述光源包括激光器。
7.如權(quán)利要求6所述的傳感器，還包括用于將來自每個物體的光準直成分開的光束的透鏡。
8.如權(quán)利要求7所述的傳感器，還包括用于每個光束的收集透鏡。
9.如權(quán)利要求7所述的傳感器，還包括用于將軸上光與離軸光分開的分束器。
10.如權(quán)利要求1所述的傳感器，還包括用于殺滅非期望細胞的、在所述檢測器下游的 細胞殺滅器。
11.如權(quán)利要求10所述的傳感器，其中所述細胞殺滅器包括用于將致命能量對準所述 非期望細胞的激光器和電極中的至少一種。
12.如權(quán)利要求10所述的傳感器，其中所述細胞殺滅器包括用于激活所述細胞中的致 命目標的光源。
13.如權(quán)利要求1所述的傳感器，還包括用于有效地處理或殺滅非期望細胞的細胞電 穿孔。
14.如權(quán)利要求1所述的傳感器，其中所述流裝置可在約2°C-10°C工作以延長細胞壽命。
全文摘要
用于對精子細胞進行分選和定向的設備，包括形成具有入口、下游出口和中間檢測器區(qū)(338)的流室(312)的相面對的一對壁(314，316)。該入口接納輸入流體的第一和第二間隔開的流以及包含待被分選的細胞(330)的樣品流體(328)的第三流。第一和第二流具有相應的相對于第三流的流速率，使得第三流被縮窄，從而形成相對窄的樣品流，以使得細胞(330)平行于壁(314，316)而被定向。檢測器(340)檢測期望細胞(330)，且在檢測器(340)下游的分選儀(356)從該流中分選期望細胞(330)。
文檔編號G01N15/14GK102128778SQ201010568740
公開日2011年7月20日 申請日期2006年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月1日
發(fā)明者丹尼爾·米特, 克里斯托弗·R·克努特松, 約瑟夫·普萊瓦, 艾米·L·安德森 申請人:阿爾利克斯公司