專利名稱：一種快速檢測(cè)血液中百草枯濃度的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種快速檢測(cè)血液中百草枯濃度的試劑盒。
背景技術(shù)：
百草枯(paraquat，PQ)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的除草劑，其使用簡(jiǎn)便，除草效 果好，價(jià)格便宜，深受廣大農(nóng)民喜愛。但如果使用不當(dāng)就會(huì)造成百草枯中毒(paraquat poisoning)。百草枯中毒發(fā)病率高，對(duì)人體毒性強(qiáng)，損傷廣泛，到目前為止無特效解毒藥物， 因此病人的預(yù)后差，死亡率高。目前，關(guān)于百草枯中毒的研究大多集中在致病機(jī)制和臨床治療方面。而作為判定 中毒程度、觀察療效和進(jìn)行預(yù)后分析最客觀、最關(guān)鍵的指標(biāo)——血漿或血清中百草枯濃度 的研究較少，更缺乏用于臨床血液樣本檢測(cè)的實(shí)用方法和相關(guān)試劑盒。實(shí)時(shí)檢測(cè)中毒患者 血液百草枯濃度可以為百草枯中毒患者的臨床診斷、治療、病情檢測(cè)和預(yù)后分析提供最直 接和客觀的依據(jù)，對(duì)于保證患者的生命財(cái)產(chǎn)安全、提高醫(yī)療質(zhì)量具有十分重要的意義。目前，百草枯濃度的檢測(cè)主要應(yīng)用于環(huán)境衛(wèi)生、公共衛(wèi)生和司法鑒定等方面，所用 的方法大都是高度靈敏的分析化學(xué)方法，如高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、免 疫測(cè)定法、毛細(xì)管電泳法等。這些方法不僅儀器昂貴，操作復(fù)雜，而且檢測(cè)成本高，測(cè)定時(shí)間 長(zhǎng)。但百草枯中毒病人起病急，進(jìn)展快，幾乎全部來自于農(nóng)村，絕大多數(shù)在縣級(jí)或地市級(jí)醫(yī) 院就診，上述方法在中小醫(yī)院檢驗(yàn)科不便開展，也不適用于中毒急診病人，由于儀器、條件 等多方面原因這些方法的應(yīng)用范圍明顯受限。絕大多數(shù)醫(yī)療單位也沒有開展，甚至關(guān)于這 方面的研究也非常少。而且，目前還沒有用于檢測(cè)百草枯濃度的試劑盒。其次，百草枯濃度的檢測(cè)與血液樣品的特殊性有關(guān)。用上述方法檢測(cè)的樣品大多 為環(huán)境樣品如水、土壤等，對(duì)生物樣品中百草枯的檢驗(yàn)研究較少。血漿或血清中百草枯濃度 很低，在μ g/ml水平，普通生化檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑的靈敏度難以達(dá)到檢測(cè)限。再者，血 液樣本基質(zhì)成分復(fù)雜，影響因素多，測(cè)定時(shí)干擾因素多，結(jié)果準(zhǔn)確性難以把握。雖然國(guó)內(nèi)有 學(xué)者試圖建立簡(jiǎn)便的紫外測(cè)定法，但由于以上因素影響，具體實(shí)驗(yàn)條件沒能細(xì)化，結(jié)果可靠 性和穩(wěn)定性較差，沒能在臨床上推廣使用。此外，百草枯中毒組織損傷廣泛，臨床表現(xiàn)多樣， 個(gè)體差異性大，難以確定毒物濃度與臨床表現(xiàn)和治療效應(yīng)的確切關(guān)系。而且，如果檢測(cè)步驟 多、試劑差異大，條件穩(wěn)定性差，檢測(cè)結(jié)果的性能就難以保證。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明人經(jīng)過多年的研究與探索，開發(fā)出穩(wěn)定、可靠、廉 價(jià)、方便的百草枯濃度檢測(cè)試劑盒，并對(duì)所研發(fā)的試劑盒進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)性能評(píng)價(jià)和臨床 診斷性能評(píng)價(jià)；同時(shí)規(guī)范測(cè)定方法步驟，穩(wěn)定檢測(cè)條件，便于室內(nèi)質(zhì)量控制和室間質(zhì)量評(píng) 價(jià)，使該試劑盒及其檢測(cè)方法便于在基層醫(yī)院開展和有效推廣，為提高百草枯中毒的診療 工作質(zhì)量，保護(hù)患者的生命財(cái)產(chǎn)安全做出貢獻(xiàn)。本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)血液中百草枯濃度的試劑盒，該試劑盒主要由除蛋白的試劑I、除核酸和防干擾的試劑II以及試劑盒溶劑組成；試劑I為凍干固體粉末，含有如下重量份的組分三氯醋酸1. 8-2. 2份、無水醋酸 鈉0. 23-0. 27份、氯化鈉0. 11-0. 13份；其中，三氯醋酸1. 8-2. 2份可以用磷鎢酸0. 89-1.21 份替代；氯化鈉0. 11-0. 13份可以用氯化鎂0. 09-0. 11份替代；試劑II含有如下組分9-11 %聚乙二醇(PEG)、19-2lmmol/L氯化鎂、 0. 22-0. 26mol/L Tris緩沖液，pH為9. 5-10. 0 ；可以用NaOH溶液或KOH溶液調(diào)節(jié)pH，優(yōu)選 NaOH溶液；其中9-11% PEG可以用異丙醇或無水乙醇或95%乙醇替代，19-21mmol/L氯化 鎂可以用45-55mmol/L氯化鋰替代；試劑盒溶劑為雙蒸水，PH 5. 4-5. 8。本發(fā)明的試劑盒還可以包括百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為10-20 μ g/ml,以健康人混 合血清為基質(zhì)配制；本發(fā)明的試劑盒還可以包括百草枯血清校準(zhǔn)品，濃度為2_4μ g/ml，以健康人混合 血清為基質(zhì)配制；當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)或檢測(cè)試劑發(fā)生改變時(shí)，用百草枯血清校準(zhǔn)品來校準(zhǔn)儀器，修 訂實(shí)驗(yàn)參數(shù)。本發(fā)明還提供所述試劑盒的應(yīng)用方法，包括如下步驟1)向試劑I中加入3-10倍量的試劑盒溶劑，充分震蕩，溶解；2)取血清或血漿95-105 μ L，先加入試劑盒溶劑213-253 μ L，輕輕混勻后，加入步 驟1)溶解的試劑I 147-187 μ L，震蕩l_2min，混勻，再加入試劑II 480-520 μ L ；3)渦旋震蕩 l-3min, 11000_13000g 離心 8_12min ；4)取上清液，以蒸餾水調(diào)零，在258nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算，得血清或 血漿中百草枯濃度(μ g/ml)百草枯(μg/ml) = (Α測(cè)-A基)X 15. 15-0. 12，其中，A3m為血清或血漿的吸光度，As為健康人混合血清基質(zhì)的吸光度。本發(fā)明的試劑盒的應(yīng)用方法中，優(yōu)選地，步驟1)試劑I溶解后，三氯醋酸的濃度為 18-22% (w/v)或磷鎢酸的濃度為8. 9-12. 1% (w/v)、無水醋酸鈉的濃度為2. 3-2. 7% (w/ ν)、氯化鈉的濃度為1. 1-1. 3% (w/v)或氯化鎂的濃度為0. 9-1. 1% (w/v)。優(yōu)選地，步驟2)為取血清或血漿100 μ L，先加入溶劑233 μ L，輕輕混勻后，加入步 驟1)溶解的試劑I 167 μ L，震蕩Imin,混勻，再加入試劑II 500 μ L。優(yōu)選地，步驟3)為渦旋震蕩2min，12000g離心lOmin。步驟4)還可以用百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)管，與血清或血漿測(cè)定管同時(shí)在258nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算血清或血漿中百草枯濃度百草枯(μ g/ml)百草枯(μg/ml) = (Α測(cè)-A基)/(A標(biāo)-A基)XC標(biāo)，其中，A3m為血清或血漿的吸光度，As為健康人混合血清基質(zhì)的吸光度，Afe為百草 枯血清標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，Cfe為百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。本發(fā)明還可以先用百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品制作工作曲線，得到回歸方程，根據(jù)測(cè)定的 血清或血漿樣品的吸光度，求得血清或血漿中百草枯的濃度。本發(fā)明中所述的血漿能以檸檬酸鹽、EDTA、肝素或草酸鹽作為抗凝劑。本發(fā)明中所述的血清或血漿在2-8°C能夠穩(wěn)定M小時(shí)，4°C能夠保存1周，-20?！鉉 能夠穩(wěn)定3-6個(gè)月。
本發(fā)明人主要通過以下研究，優(yōu)選得到本發(fā)明的試劑盒及其應(yīng)用方法，這些研究 包括試劑的種類和配方、試劑盒的系統(tǒng)檢測(cè)性能評(píng)價(jià)和臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)三部分(一)試劑的種類和配方1.百草枯吸光度曲線的分析根據(jù)百草枯的結(jié)構(gòu)特征，選用紫外分光光度法檢 測(cè)。配制2yg/ml的百草枯標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，用紫外分光光度計(jì)在200-400nm處掃描，尋找最 大吸收波長(zhǎng)。2.百草枯水溶液濃度與吸光度的關(guān)系以蒸餾水為基質(zhì)，繪制百草枯濃度為 0. 2-10μ g/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線，觀察其線性關(guān)系。3.百草枯血清溶液濃度與吸光度的關(guān)系健康人混合血清為基質(zhì)，繪制百草枯濃 度為0. 2-10 μ g/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線，觀察其線性關(guān)系。4.選擇與優(yōu)化按照選定的實(shí)驗(yàn)條件和步驟(詳見實(shí)施例)，利用已經(jīng)獲得的健康 人血清基質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別觀察不同濃度牛血清白蛋白、血紅蛋白、質(zhì)粒DNA、葡萄糖、膽 紅素、三油酰甘油酯、肌酐、維生素C、地塞米松、血必凈、ATP等對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，探索消 除以上干擾的方法和因素，在相關(guān)指標(biāo)的評(píng)價(jià)可接受的基礎(chǔ)上，確定試劑的種類和配方。( 二)試劑盒的系統(tǒng)檢測(cè)性能評(píng)價(jià)1.對(duì)試劑盒進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)性能評(píng)價(jià)，根據(jù)應(yīng)用試劑盒得到的紫外檢測(cè)結(jié)果，建 立評(píng)價(jià)試驗(yàn)，包括重復(fù)試驗(yàn)、回收試驗(yàn)、線性試驗(yàn)、特異性和干擾試驗(yàn)、方法比較試驗(yàn)等，確 定檢測(cè)方法的精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、特異性和穩(wěn)定性等，最后確定實(shí)驗(yàn)的總誤差，從而 評(píng)價(jià)試劑盒的檢測(cè)性能。2.分別用本發(fā)明的試劑盒(紫外檢測(cè)法)和高效液相色譜法對(duì)1 例百草枯中毒 患者的血清樣本進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，作相關(guān)性分析。(三)試劑盒的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)1.醫(yī)學(xué)決定水平的確定結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、臨床診斷、治療效果和轉(zhuǎn)歸等資 料，按照試劑盒的檢測(cè)結(jié)果將中毒患者分為染毒、輕度、中度、重度和危重五個(gè)級(jí)別，分析各 個(gè)級(jí)別的血清百草枯濃度范圍，確定各自的醫(yī)學(xué)決定水平值。2.臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)以病人的臨床癥狀和CT檢查結(jié)果為百草枯中毒肺纖維化診斷 的金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒對(duì)血清或血漿樣本的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)血清百草枯濃度用于診 斷肺纖維化的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，分別計(jì)算其臨床靈敏度、特異度、預(yù)告值和似然比，最后繪制 ROC 曲線(接受者操作特性曲線，receiver operating characteristic curve,簡(jiǎn)稱ROC 曲 線；也稱為感受性曲線，sensitivity curve)，根據(jù)以上結(jié)果評(píng)價(jià)本發(fā)明試劑盒的臨床應(yīng)用 效果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明在綜合分析現(xiàn)有檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，選擇紫外分光光度法為合適的候選方 法，深入探討了多種干擾因素及其消除的方法，逐步進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)條件選擇和方法的優(yōu)化，最 終確定了快速檢測(cè)血液中百草枯濃度的試劑盒的試劑種類和配方，明確了試劑處理和保存 條件，確定了應(yīng)用方法和說明書。經(jīng)過系統(tǒng)的檢測(cè)性能和臨床診斷性能評(píng)價(jià)，證明該試劑盒 能夠快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠、穩(wěn)定、有效、廉價(jià)地檢測(cè)血液中百草枯的濃度，可行性強(qiáng)、應(yīng)用 范圍廣，所需的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、普及范圍廣，能夠?yàn)榘俨菘葜卸净颊叩呐R床診斷、治療、病情 檢測(cè)和預(yù)后分析提供最直接和客觀的依據(jù)。

圖1為百草枯的紫外吸光譜圖；圖2為蒸餾水為基質(zhì)時(shí)百草枯的吸收曲線；圖3為健康人混合血清為基質(zhì)時(shí)百草枯的吸收曲線；圖4為健康人空白血清HPLC色譜圖；圖5為百草枯和內(nèi)標(biāo)的HPLC色譜圖；圖6為健康人血清中加入百草枯和內(nèi)標(biāo)的HPLC色譜圖；圖7為紫外檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性；圖8為試劑盒診斷性能評(píng)價(jià)的ROC曲線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)驗(yàn)例1試劑盒及其 應(yīng)用方法試劑盒的說明書適用范圍及臨床意義本試劑盒用于人血清、肝素/EDTA抗凝血漿中百草枯含量 的體外定量分析。百草枯是常用的除草劑，百草枯中毒在臨床上十分常見。血清(漿)百 草枯濃度檢測(cè)能夠?yàn)橹卸净颊叩呐R床診斷、治療、病情檢測(cè)和預(yù)后分析提供最直接和客觀 的依據(jù)。測(cè)定原理百草枯分子中含有共軛雙鍵，對(duì)258nm的紫外線有穩(wěn)定的吸收特性。 在樣本除蛋白、除核酸、對(duì)抗還原性物質(zhì)影響的基礎(chǔ)上，用258nm進(jìn)行檢測(cè)，其吸光度大小 與百草枯含量成正比。測(cè)定結(jié)果與溶于正常健康人混合血清的百草枯純品相比較，即可得 出待測(cè)樣本的濃度。試劑組成本發(fā)明的試劑盒主要包括試劑I、試劑II和試劑盒溶劑三個(gè)部分，每盒試劑按60 人份試劑量配制。還可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，按比例適當(dāng)增加或減少各組分的重量份，以適用于 不同的需求。試劑I為凍干固體粉末，含有三氯醋酸2. 0g、無水醋酸鈉0. 25g、氯化鈉0. 12g ；試劑II含有如下組分10% PEG,20mmol/L氯化鎂，0. 24mol/LTris緩沖液，用氫 氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為9. 5 ；試劑II為50ml ；試劑盒溶劑雙蒸水50ml ；此外還有百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品和百草枯血清校準(zhǔn)品用健康人混合血清為基質(zhì)，分 別配制成終濃度為15 μ g/ml和3 μ g/ml的應(yīng)用液。樣本收集樣本應(yīng)為血清或血漿，血漿能以檸檬酸鹽、EDTA、肝素、草酸鹽作為抗凝劑。血 清應(yīng)盡快分離。分離后的血清或加入抗凝劑的血漿在2-8°C可穩(wěn)定M小時(shí)，4°C可保存1 周，-20°C可穩(wěn)定3-6個(gè)月。應(yīng)用方法1.試劑I溶解向試劑I中加入試劑盒溶劑10ml，充分震蕩，溶解。6
2.取血清或血漿樣本100 μ L，先加入雙蒸水233 μ L，輕輕混勻后，加入試劑I 167 μ L，震蕩混勻Imin,再加入試劑II 500 μ L。3.渦旋振蕩器震蕩2min，12000g離心lOmin。4.取上清液，用蒸餾水調(diào)零，比色杯體積0. 1ml，光徑1cm，在波長(zhǎng)258nm測(cè)定吸光度。結(jié)果計(jì)算百草枯(μg/ml) = (Α測(cè)-A基)X 15. 15-0. 12。其中，A3m為血清或血漿的吸光度，As為健康人混合血清基質(zhì)的吸光度。步驟4)還可以用百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)管，與血清或血漿測(cè)定管同時(shí)在258nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算血清或血漿中百草枯濃度百草枯(μ g/ml)百草枯(μg/ml) = (Α測(cè)-A基)/(A標(biāo)-A基)XC標(biāo)，其中，A3m為血清或血漿的吸光度，As為健康人混合血清基質(zhì)的吸光度，Afe為百草 枯血清標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，Cfe為百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。步驟4)還可以先用百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品制作工作曲線，得到回歸方程，根據(jù)測(cè)定的 血清或血漿樣品的吸光度，求得血清或血漿中百草枯的濃度。當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)或檢測(cè)試劑發(fā)生改變時(shí)，用百草枯血清校準(zhǔn)品來校準(zhǔn)儀器，修訂實(shí)驗(yàn) 參數(shù)。注意事項(xiàng)1.樣品的處理是試驗(yàn)的關(guān)鍵，應(yīng)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。2.健康人混合血清基質(zhì)的百草枯濃度正常人血清百草枯濃度應(yīng)為O μ g/ml。不 同地區(qū)，不同人群有差異，由于基質(zhì)差異的影響，百草枯濃度的測(cè)定值小于0. 1 μ g/ml也視 為陰性。3.影響因素血清葡萄糖濃度(3. 89-61. lmmol/L)、總膽紅素濃度 (3. 4-171 μ mol/L)、尿素(0. 2-4. 3mmol/L)、肌酐(0. 06-1. 15mmol/L)在參考區(qū)間上限 10 倍 范圍內(nèi)無明顯干擾，常用藥物地塞米松、B族維生素、青霉素在常規(guī)治療濃度無明顯干擾，溶 血、脂血、黃疸樣本均對(duì)測(cè)定結(jié)果干擾影響較小。實(shí)施例試劑組成本發(fā)明的試劑盒主要包括試劑I、試劑II和試劑盒溶劑三個(gè)部分，每盒試劑按60 人份試劑量配制。還可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，按比例適當(dāng)增加或減少各組分的重量份，以滿足不 同的需求。試劑I為凍干固體粉末，含有三氯醋酸1. Sg、無水醋酸鈉0. 23g、氯化鈉0. Ilg ；試劑II含有如下組分9% PEG, 19mmol/L氯化鎂，0. 22mol/L Tris緩沖液，用氫 氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為9. 8 ；試劑II為45ml ；試劑盒溶劑雙蒸水45ml ；此外還有百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品和百草枯血清校準(zhǔn)品用健康人混合血清為基質(zhì)，分 別配制成終濃度為10 μ g/ml和2 μ g/ml的應(yīng)用液。應(yīng)用方法1.試劑I溶解向試劑I中加入試劑盒溶劑10ml，充分震蕩，溶解。
2.取血清或血漿樣本95 μ L，先加入雙蒸水213 μ L，輕輕混勻后，加入試劑I 187 μ L，震蕩混勻lmin,再加入試劑II 505 μ L。3.渦旋振蕩器震蕩lmin，IlOOOg離心12min。4.取上清液，用蒸餾水調(diào)零，比色杯體積0. 1ml，光徑1cm，在波長(zhǎng)258nm測(cè)定吸光
度。
其他事項(xiàng)同實(shí)施例1的試劑盒說明書。實(shí)施例試劑組成本發(fā)明的試劑盒主要包括試劑I、試劑II和試劑盒溶劑三個(gè)部分，每盒試劑按60 人份試劑量配制。還可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，按比例適當(dāng)增加或減少各組分的重量份，以滿足不 同的需求。試劑I為凍干固體粉末，含三氯醋酸2. 2g、無水醋酸鈉0. 27g、氯化鈉0. 13g ；試劑II含有如下組分11% PEG, 2lmmol/L氯化鎂，0. 26mol/LTris緩沖液，pH為 10. 0 ；試劑盒溶劑雙蒸水55ml ；此外還有百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品和百草枯血清校準(zhǔn)品用健康人混合血清為基質(zhì)，分 別配制成終濃度為20 μ g/ml和4 μ g/ml的應(yīng)用液。應(yīng)用方法1.試劑I溶解向試劑I中加入試劑盒溶劑10ml，充分震蕩，溶解。2.取血清或血漿樣本105 μ L，先加入雙蒸水253 μ L，輕輕混勻后，加入試劑I 147 μ L，震蕩混勻2min,再加入試劑II 495 μ L。3.渦旋振蕩器震蕩3min，13000g離心8min。4.取上清液，用蒸餾水調(diào)零，比色杯體積0. 1ml，光徑1cm，在波長(zhǎng)258nm測(cè)定吸光度。其他事項(xiàng)同實(shí)施例1的試劑盒說明書。實(shí)施例試劑組成本發(fā)明的試劑盒主要包括試劑I、試劑II和試劑盒溶劑三個(gè)部分，每盒試劑按60 人份試劑量配制。還可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，按比例適當(dāng)增加或減少各組分的重量份，以滿足不 同的需求。試劑I為凍干固體粉末，含有磷鎢酸1. 0g、無水醋酸鈉0. 25g、氯化鎂0. IOg ；試劑II含有如下組分95%乙醇，50mmol/L氯化鋰，0. 24mol/LTris緩沖液，pH為 9. 5 ；試劑 II 為 50ml ；試劑盒溶劑雙蒸水50ml ；此外還有百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品和百草枯血清校準(zhǔn)品用健康人混合血清為基質(zhì)，分 別配制成終濃度為15 μ g/ml和3 μ g/ml的應(yīng)用液。其他事項(xiàng)同實(shí)施例1的試劑盒說明書。實(shí)施例試劑組成
本發(fā)明的試劑盒包括試劑I、試劑II和試劑盒溶劑三個(gè)部分，每盒試劑按60人份 試劑量配制。還可以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用，按比例適當(dāng)增加或減少各組分的重量份，以滿足不同的需求。試劑I為凍干固體粉末，含有磷鎢酸1. 2g、無水醋酸鈉0. ^g、氯化鎂0. 09g ；試劑II含有如下組分異丙醇，50mmol/L氯化鋰，0. 24mol/L Tris緩沖液，pH為 9. 5 ；試劑 II 為 50ml ；試劑盒溶劑雙蒸水50ml。其他事項(xiàng)同實(shí)施例1的試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)例1試劑種類和配方的篩選1.溶液的配制(1)百草枯標(biāo)準(zhǔn)品水溶液準(zhǔn)確稱取IOmg百草枯標(biāo)準(zhǔn)品(sigma公司產(chǎn)品)，用雙 蒸水(ddH20)配制成100μ g/ml的儲(chǔ)備液，4°C冰箱避光保存。使用時(shí)，用ddH20稀釋。(2)百草枯標(biāo)準(zhǔn)品血清溶液以60例不同年齡段健康人的混合血清為基質(zhì)，配制 濃度為20μ g/ml的百草枯標(biāo)準(zhǔn)品血清溶液，使用時(shí)，用ddH20稀釋。(3)百草枯校準(zhǔn)品血清溶液以60例不同年齡段健康人的混合血清為基質(zhì)，配制 濃度為10μ g/ml的百草枯校準(zhǔn)品血清溶液，使用時(shí)，用ddH20稀釋。(4)百草枯對(duì)照品水溶液以乙基紫精二溴化物(1，1' - 二乙基_4，4'-聯(lián)吡啶 鐺二溴化物Khyl Viologen Dibromide)為內(nèi)標(biāo)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與百草枯(1，1 ‘ -二甲基-4， 4'-聯(lián)吡啶陽離子鹽)極為相似，但波譜不同。取對(duì)照品乙基紫精二溴化物ang，用雙蒸水 (ddH20)配制成100μ g/ml的儲(chǔ)備液，4°C冰箱避光保存。使用時(shí)，用ddH20稀釋。2.百草枯吸光度曲線和最佳檢測(cè)波長(zhǎng)取2 μ g/ml百草枯標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，在200 400nm之間掃描，當(dāng)波長(zhǎng)為258nm時(shí)， 其吸光度值最高，而且穩(wěn)定性最好，不同波長(zhǎng)的紫外吸光譜圖見圖1。3.用蒸餾水為基質(zhì)，測(cè)定百草枯標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0. 2-10 μ g/ml時(shí)的吸光度，見表1， 數(shù)據(jù)采用SPSS12. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行直線回歸分析，直線回歸方程為Y = 0. 067X-0. 002，R = 1 (P < 0. 05)，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。4.用健康人混合血清為基質(zhì)，測(cè)定百草枯標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.2_10μ g/ml時(shí)的 吸光度，見表1，數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行直線回歸分析，直線回歸方程為Y = 0. 066X+0. 008，R = O. 9999 (P < 0. 05)，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖 3。表1百草枯濃度范圍在0. 2 μ g/ml-10 μ g/ml的吸光度值百草枯血清溶液吸光度
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)血液中百草枯濃度的試劑盒，其特征在于，主要由除蛋白的試劑I、除 核酸和防干擾的試劑II以及試劑盒溶劑組成；所述試劑I為凍干固體粉末，含有如下重量份的組分三氯醋酸1. 8-2. 2份或磷鎢酸 0. 89-1. 21份、無水醋酸鈉0. 23-0. 27份、氯化鈉0. 11-0. 13份或氯化鎂0. 09-0. 11份;所述試劑II含有如下組分9-11%聚乙二醇或異丙醇或無水乙醇或95%乙醇、 19-21mmol/L 氯化鎂或 45_55mmol/L 氯化鋰、0. 22-0. 26mol/L Tris 緩沖液，pH 為 9. 5-10. 0 ；所述試劑盒溶劑為雙蒸水，PH 5.4-5.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為 10-20 μ g/ml,以健康人混合血清為基質(zhì)配制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，還包括百草枯血清校準(zhǔn)品，濃度為 2-4 μ g/ml,以健康人混合血清為基質(zhì)配制；當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)或檢測(cè)試劑發(fā)生改變時(shí)，用百草枯 血清校準(zhǔn)品來校準(zhǔn)儀器。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于，包括如下步驟1)向所述試劑I中加入3-10倍量的試劑盒溶劑，充分震蕩，溶解；2)取血清或血漿95-105μ L，先加入試劑盒溶劑213-253 μ L，輕輕混勻后，加入步驟1) 溶解的試劑I 147-187 μ L，震蕩l_2min，混勻，再加入試劑II 450-550 μ L ；3)渦旋震蕩l-3min, 11000_13000g 離心 8_12min ；4)取上清液，以蒸餾水調(diào)零，在258nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算，得血清或血漿 中百草枯濃度百草枯(μ g/ml)百草枯(μ g/ml) = (As-Ai) X 15. 15-0. 12，其中，A3m為血清或血漿的吸光度，As為健康人混合血清基質(zhì)的吸光度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟1)試劑I溶解后，三氯醋酸的濃度為 18-22% (w/v)或磷鎢酸的濃度為8. 9-12. 1% (w/v)、無水醋酸鈉的濃度為2. 3-2. 7% (w/ ν)、氯化鈉的濃度為1. 1-1. 3% (w/v)或氯化鎂的濃度為0. 9-1. 1% (w/v)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟幻為取血清或血漿100μ L，先加入 溶劑233 μ L，輕輕混勻，加入試劑I 167 μ L，震蕩lmin，混勻，加入試劑II 500 μ L0
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟3)為渦旋震蕩aiiin，12000g離心 IOmin0
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的方法，步驟4)用百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)管，與 血清或血漿測(cè)定管同時(shí)在258nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算血清或血漿中百草枯濃度 (μ g/ml)百草枯(μ g/ml) = (Α測(cè)-A基)/(A標(biāo)-A基)XC標(biāo)，其中，A3m為血清或血漿的吸光度，As為健康人混合血清基質(zhì)的吸光度，Afe為百草枯血 清標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，Cfe為百草枯血清標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述血漿能以檸檬酸鹽、EDTA、 肝素或草酸鹽作為抗凝劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述血清或血漿在2-8°C能夠 穩(wěn)定M小時(shí)，4°C能夠保存1周，_20°C能夠穩(wěn)定3-6個(gè)月。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)血液中百草枯濃度的試劑盒，主要由除蛋白的試劑I、除核酸和防干擾的試劑II、試劑盒溶劑、百草枯標(biāo)準(zhǔn)品和百草枯校準(zhǔn)品組成。本發(fā)明還涉及所述試劑盒的應(yīng)用方法。本發(fā)明的試劑盒能夠快速檢測(cè)患者血液中百草枯的濃度，為百草枯中毒的臨床診斷和治療提供快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠、有效的依據(jù)。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102053069SQ20101057182
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者劉俊扇, 張婧婧, 李平法, 李生瑩, 梁棟梁, 王全志, 王輝, 田少華, 詹合琴, 賀志安 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院