專利名稱：一種雙適配子試劑盒及其在結核菌抗原檢測中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子免疫學領域。具體涉及一種能特異性結合毒性分枝桿菌H37RV菌 體表面抗原，而不結合BCG的單鏈DNA適配子試劑盒及其在結核抗原檢測中的應用。
背景技術：
結核病是由結核分枝桿菌引起的、人獸共患的慢性消耗性傳染病，給人類健康帶 來嚴重威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計資料顯示，全球目前有近三分之一的人感染結核 桿菌，活動性肺結核病人達2000萬，每年有300萬人死于結核病，每 年新發(fā)病人數(shù)800 1000萬。1993年，世界衛(wèi)生組織宣布“全球結核病處于緊急狀態(tài)”，把結核病列為重點控制 的傳染病之一。我國是結核病高負擔國家，現(xiàn)有活動性肺結核病人500萬人，傳染性肺結核病人 200萬人，每年新增病例約130萬人，因結核病死亡15萬人之多(《全國結核病防治規(guī)劃 (2001-2010年)》，國辦發(fā)[2001]75號文件)。國務院已確定結核病為我國三大重點防治傳 染病之一。我國結核病疫情的嚴重程度僅次于印度，位居世界第二。我國結核病疫情呈三 高一低，即患病率高、死亡率高、耐藥率高，年遞降率低。近年來由于HIV/AIDS流行、人口流 動、耐藥結核菌逐年增加，結核病發(fā)病率開始上升，結核病疫情更加嚴重。運用新型診斷方法對結核病進行早期診斷與治療具有十分重要的意義，目前國內(nèi) 外結核已有的診斷技術存在許多缺陷，缺乏特異、有效、快速、方便、廉價的診斷技術和產(chǎn) 品，特別是一直缺乏對結核抗原的敏感早期檢測手段。過去PPD (結核菌素純蛋白衍化物 )也常用于結核病的診斷和流行病學調(diào)查，但是其缺乏特異性，敏感性低，有一定應用局限 性；傳統(tǒng)的痰抗酸染色的靈敏度難以達到，并且不能區(qū)分不同結核分枝桿菌；傳統(tǒng)的抗體 檢測方法存在窗口期問題，不能達到檢測目的，并且不能區(qū)分是卡介苗接種還是感染結核 的問題；近些年發(fā)展的RT-PCR的診斷方法雖然特異性強，但需昂貴儀器，成本高。臨床上對 疑似感染結核的病人，由于缺乏有效的診斷方法，常常采用先抗結核治療，再以治療的效果 為依據(jù)來進行診斷，如此一來浪費了大量的人力物力，也可能造成對其他疾病的誤診或是 延誤治療。所以，探索新型診斷方法對結核病進行早期診斷研究用于結核病快速、有效、方 便、廉價的特異性檢測，特別是急需開發(fā)一種比臨床上傳統(tǒng)使用的抗酸染色方法更靈敏和 快速地用于結核菌抗原診斷的新型試劑，對于及時診斷、治療結核病人和控制結核病傳染 疫情都具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述不足，本發(fā)明提供一種能夠特異性結合毒性結核分枝桿菌H37Rv的兩種 單鏈DNA適配子試劑盒。本發(fā)明通過SELEX篩選技術，通過多輪篩選得到兩個DNA單鏈適配子，分別命名為 ZXL2和ZXL3，其核苷酸序列分別如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示。ZXL2和ZXL3對結 核分枝桿菌H37Rv具有良好的特異性。
基于此，本發(fā)明提供一種雙適配子檢測試劑盒，其包括適配子ZXL2和ZXL3。上述試劑盒，適配子ZXL2和ZXL3中的一種包被于酶標板，另一種用生物素標記。 優(yōu)選ZXL2包被于酶標板，ZXL3用生物素標記。上述試劑盒，其還可進一步包括酶標鏈霉親和素、PBST和終止液中的一種或多種。 所述酶標鏈霉親和素是辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素。所述終止液為濃硫酸，優(yōu)選終止 液為2M的H2SO4。本發(fā)明首次將此單鏈適配子與結核病的診斷結合起來，該適配子ZXL2、ZXL3體外 容易合成，且能特異性與結核分枝桿菌H37Rv結核。本發(fā)明試劑盒比傳統(tǒng)的痰抗酸染色的 診斷方法的優(yōu)點是本發(fā)明試劑盒能區(qū)分毒性結核分枝桿菌與其它分支桿菌包括BCG，并 且可以檢測低于104CFU/ml的結核菌，而傳統(tǒng)的痰抗酸染色的靈敏度難以達到；與傳統(tǒng)的抗 體檢測方法相比的優(yōu)點是能檢測抗原，且能縮短窗口期，達到早期診斷目的；與RT-PCR的 診斷方法相比的優(yōu)點是不需昂貴儀器，成本低。而且DNA單鏈適配子體外合成非常簡單， 而且價格低廉，同時我們發(fā)明的方法操作簡單，操作時間短(1 天完成)，對于結核病人痰培 養(yǎng)陽性的診斷靈敏度和精確度都很高，臨床應用前景廣闊。


圖1雙適配子夾心法適配子濃度的確定
兩種適配子分別與H37RV、BCG結合，IOOnM非生物標記的適配子ZXL2結合細菌，IOnM 生物素標記的適配子ZXL3檢測時，非特異性反應最低(0D45C1<0. 2)，確定與結核桿菌H37Rv 結合的ZXL2適配子的最佳濃度為ΙΟΟηΜ，ZXL3適配子的最佳濃度為ΙΟηΜ。圖2本發(fā)明雙適配子試劑盒的特異性鑒定
圖中l(wèi)、H37Rv ；2、BCG ；3、恥垢分枝桿菌；4、鳥分枝桿菌；5、胞內(nèi)分枝桿菌；6、藤黃微球 菌；7、綠膿桿菌；8、金黃色葡萄球；9、大腸桿菌；10、金黃色葡萄球菌耐藥株；11、白葡萄球 菌。雙適配子夾心法可以在環(huán)境為PBS，細菌濃度為IO4 CFU/mL的條件下有效的鑒別 出H37Rv與不同非分枝桿菌和分枝桿菌。圖3雙適配子夾心法檢測正常人及病人痰液
正常人痰液使用雙適配子方法檢測時，OD45tl值< 0. 1。結核病人痰液抗酸染色陽性的， 都能與IOOnM濃度的ZXL2適配子和IOnM濃度的ZXL3適配子反應，且有很高的OD值。OD450 值> 0. 2。
具體實施例方式以下實施例用于進一步說明本發(fā)明，但不應理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指 明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。下面凡是涉及到結核 桿菌的操作，均在生物安全柜中操作。本發(fā)明中非生物素標記即指未標記。實施例1試劑盒適配子濃度的確定 實驗方法
(1)把從公司合成的生物素標記的ZXL3適配子用無菌的雙蒸水分別稀釋成10nM，40nM UOOnM,400nM的濃度，_20°C冰箱中保存。
(2)把不同種的細菌結核桿菌標準毒株H37Rv，卡介苗，黃微球菌，綠膿桿菌，金 黃色葡萄球菌，腸炎桿菌，金黃色葡萄球菌耐藥株，白色葡萄球菌分別在合適的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，其中結核桿菌標準毒株H37Rv，卡介苗(BCG)在改良羅氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其他細菌在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后在使用當天，用生理鹽水調(diào)成不同的濃度。(3)雙適配子法最適濃度的鑒定，將100nM，400nM未標記的適配子ZXL2 (用 0. 05mol/L NaHC03> pH值為8. 0稀釋)包被96孔板后，在紫外光下暴露常溫過夜。棄掉孔 中的液體，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5%。)，洗6次，每孔加入不同濃度(1\1050 ^!111，1\104 CFU/ml、lX103CFU/ml、lX102 CFU/mlUXlO1 CFU/ml)的 H37RV、BCG 100 μ 1，每個濃度 設6個復孔，同時設一個不加細菌的陰性對照孔，4°C，孵育過夜。棄掉孔中的液體，每孔加 300 μ 1 PBST,洗6次，由于每種細菌的每個濃度設8個復孔，因此兩種細菌的每個濃度的2 個復孔加一個濃度的適配子，每孔100 μ 1，4°C，孵育過夜。棄掉孔中的液體，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5 %。)，洗6次，加入不同濃度的生物素標記的適配子ZXL3 (ΙΟηΜ, 40nM、IOOnM, 400nM)，4°C，孵育過夜。棄掉孔中的液體，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5%。)，洗6次，加入然 后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，37°C，孵育半個小時。棄掉孔中的液體，每孔加 300 μ 1 PBST (0. 5%0)，洗6次，然后用2Μ的H2SO4終止反應。在酶標儀上，用450nm的濾光 片讀取OD值。實驗結果結果如圖1所示，兩種適配子分別與H37Rv、BCG結合，IOOnM未標 記的適配子ZXL2結合細菌，IOnM生物素標記的適配子ZXL3檢測時，非特異性反應最低 (OD450<0. 2)，確定與結核桿菌H37Rv結合的ZXL2適配子的最佳濃度為ΙΟΟηΜ，ZXL3適配子 的最佳濃度為ΙΟηΜ。實施例2雙適配子法特異性的鑒定
將H37Rv、BCG、恥垢分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌、金黃 色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌耐藥株、大腸桿菌、白葡萄球菌稀釋至濃度為IO4 CFU/mL，備
用。 將IOOnM非生物素標記的適配子ZXL2 (用0. 05mol/L NaHC03、pH值為8. 0稀釋) 包被96孔板后，在紫外光下暴露常溫過夜。棄掉孔中的液體，每孔加300 μ 1 PBSTC0. 5%0)， 洗6次，每孔分別加入lX103CFU/ml (不同的細菌，同一個濃度)的不同細菌100μ1，每種 細菌設2個復孔，同時設一個不加細菌的陰性對照孔，4°C，孵育過夜。棄掉孔中的液體，每 孔加300 μ 1 PBST,洗6次，加IOnM入生物素標記的適配子ZXL3，4°C，孵育過夜。棄掉孔中 的液體，每孔加300 μ 1 PBSTC0. 5%。)，洗6次，加入然后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親 和素，37°C，孵育半個小時。棄掉孔中的液體，每孔加300 μ 1 PBST(0.5%。)，洗6次，然后用 2M的H2SO4終止反應。在酶標儀上，用450nm的濾光片讀取OD值。結果如圖2所示，雙適配子夾心法可以在環(huán)境為PBS，細菌濃度為IO4 CFU/mL的條 件下有效的鑒別出H37Rv與不同非分枝桿菌和分枝桿菌。實施例3雙適配子法臨床診斷與抗酸染色法的比較 材料與方法
(1).取97份正常人痰液，用3%NaHC03等比稀釋。正常人痰液收集自武漢地區(qū)五所大 學武漢大學基礎醫(yī)學院(20份)、武漢大學本部(20份)、華中師范大學(20份)、武漢理工大 學(17份)、華中農(nóng)業(yè)大學(20份)，采取自愿的形式，隨機抽取年齡在18到27歲的97份非結核感染期正常人痰液。其中男生74人，女生23人；59人來自農(nóng)村，38人來自城市；42人 確認接種過卡介苗，其余55人未接種或者不清楚是否接種過卡介苗；6人家族內(nèi)有結核患 者；4人曾被結核感染過。(2).取48份結核病人的痰液，一部分拿去做抗酸染色，另一部分用3%NaHC03等 比稀釋，進行以下本雙適配子法檢測。

(3).將 IOOnM 未標記的適配子 ZXL2 (用 0. 05mol/L NaHC03、PH 值為 8. 0 稀釋) 包被96孔板后，在紫外光下暴露常溫過夜。棄掉孔中的液體，每孔加300 μ 1 PBSTC0. 5%0)， 洗6次，每孔分別加入稀釋后的正常人和病人痰液100 μ 1，同時設一個不加痰液的陰性對 照孔，4°C，孵育過夜。棄掉孔中的液體，每孔加300 μ 1 PBST，洗6次，加IOnM入生物素標 記的適配子ZXL3，4°C，孵育過夜。棄掉孔中的液體，每孔加300 μ 1 PBST (0. 5%。)，洗6次， 加入然后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，37°C，孵育半個小時。棄掉孔中的液體， 每孔加300μ1 PBST (0.5%。)，洗6次，然后用2Μ WH2SO4終止反應。在酶標儀上，用450nm 的濾光片讀取OD值。實驗結果
__表1
I總符合率(%) I特異性
雙適配子夾心法 88. 28_87. 37
抗酸染色丨51.97丨51.87
將武漢市疾病救助中心確診的結核病人作為陽性比較，正常人作為陰性比較，計算雙
適配子夾心法和抗酸染色的總符合率、特異性。表中結果顯示雙適配子夾心法的總符合
率為88. 28%、特異性為87. 37%。與抗酸染色的符合度為0. 988 ；抗酸染色的總符合率為
51. 97%、特異性為51. 87%。根據(jù)本結果說明本方法比抗酸染色的特異性高。雙適配子夾心
法與抗酸染色檢測方法進行比較，特異性提高35個百分點，敏感度由原來的10000 CFU/mL
提高到100 CFU/mL。將傳統(tǒng)通過痰培養(yǎng)的診斷方法從過去的2_8周縮減為1天。如圖3所示，正常人痰液使用雙適配子方法檢測時，OD45tl值< 0. 1。結核病人痰液 抗酸染色陽性的，都能與IOOnM濃度的ZXL2適配子和IOnM濃度的ZXL3適配子反應，且有 很高的OD值。OD45tl值> 0.2。實施例4本發(fā)明試劑盒組成 1.包被ZXL2的酶標板；
用pH8. 0的磷酸緩沖液將非生物素標記的適配子ZXL2稀釋至濃度為100 nM。按照每 孔IOOml包被96孔ELISA板，4°C包被過夜。2.生物素標記ZXL3 (由上海賽百盛公司合成)
3.辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素；
4.底物顯色液
A 液TMB 0. 02% (w/v)
B液無水檸檬酸2. lg，無水Na2HPO4 2. 82g，0. 75%的過氧化氫0. 64ml，雙蒸水定容至 IOOml
配置方法稱取TMB 20mg(固體)，先用無水乙醇IOml溶解，充分振蕩(試劑瓶要干凈， 干燥)，加雙蒸水定容到100 ml，此為底物A.底物B，取無水檸檬酸2. lg，無水Na2HPO4 2. 82g，0. 75%的過氧化氫0. 64ml，雙蒸水定容至IOOml (無須調(diào)pH值，應在4. 5-5. 0范圍)。使用時A:B各取5ml混勻。(合成品訂購于達科為生物技術有限公司) 5.終止液2M H2SO4。注
本發(fā)明中所用的LB培養(yǎng)基的制備方法為配制IL的用量蛋白胨IOg酵母抽提物 5g NaCl IOg調(diào)pH值至7. 0-7. 2.分裝后于121攝氏度滅菌15min.
本發(fā)明中所用的改良羅氏培養(yǎng)基的制備發(fā)法為味精(谷氨酸鈉95%以上)7.2g; 磷酸二氫鉀2. 4g;硫酸鎂0. 24g;檸檬酸鎂0. 6g;甘油12mL;蒸餾水600mL;馬鈴薯淀粉 30g;全卵液1000mL;2%孔雀綠20mL.制備法各鹽類成分溶解后，加馬鈴薯淀粉，混勻， 沸水鍋內(nèi)煮沸30 40min (其間不時搖動，防凝塊)，呈糊狀，待冷后，加入經(jīng)消毒紗布過濾 的新鮮全卵液IOOOmL,混勻。加2%孔雀綠20mL，混勻，分裝試管(18mmX 180mm)。每一試 管加培養(yǎng)基7mL，培養(yǎng)基斜面高度為培養(yǎng)基占試管底部的三分之二處為宜，置血清凝固器內(nèi) 凝固。凝固器內(nèi)溫度至90°C時，放入分裝試管，以擺放兩層為宜。待凝固器內(nèi)溫度達85 90°C，計時，凝固1 1.5h后取出，放冷，無菌試驗后放4°C冰箱備用，一個月內(nèi)使用。本發(fā)明中所用包被緩沖液(pH8. 0，0. 05M碳酸鹽緩沖液)Na2CO3 1. 59克， NaHCO3 2. 93克加蒸餾水至1000ml，使用前配置。
權利要求
1.一種雙適配子夾心試劑盒，包括DNA適配子ZXL2和ZXL3，它們的核苷酸序列分別如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，ZXL2和ZXL3中的一種包被于酶標板， 另一種用生物素標記。
3.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，ZXL2包被于酶標板，ZXL3用生物素標記。
4.根據(jù)權利要求廣3任一項所述的試劑盒，其還包括酶標鏈霉親和素、PBST和終止液 中的一種或多種。
5.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標鏈霉親和素為辣根過氧化物 酶標記鏈霉親和素。
6.根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述終止液為2M的H2SO4。
7.權利要求廣6任一項所述的試劑盒在檢測結核菌抗原中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種能靈敏和快速地用于結核菌菌體抗原診斷的新型雙適配子夾心ELISA試劑盒，其包括ZXL2和ZXL3兩個適配子。本發(fā)明利用SELEX篩選得到的DNA單鏈適配子命名為ZXL2、ZXL3，首次建立該雙適配子夾心ELISA試劑盒，將其與結核病的早期診斷結合起來，與臨床上傳統(tǒng)的抗酸染色檢測方法進行比較，特異性提高35個百分點，敏感度由原來的10000CFU/ml提高到100CFU/ml。將傳統(tǒng)通過痰培養(yǎng)的診斷方法從過去的2-8周縮減為1天。本發(fā)明操作簡單快速，成本低廉，大大提高了對結核病人診斷特異性、敏感性和精確度，特別是提供了一種新型結核抗原早期診斷試劑盒，臨床應用前景廣闊。
文檔編號G01N33/569GK102128926SQ20101057442
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月6日 優(yōu)先權日2010年12月6日
發(fā)明者章曉聯(lián) 申請人:武漢大學