專利名稱：一種促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫診斷應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明提供了一種利用時(shí)間分辨熒光免疫法，采用Eu標(biāo)記的抗體與固相載體上的抗體結(jié)合抗原上不同位點(diǎn)的“雙抗體夾心”技術(shù)，定量檢測(cè)采集在903#濾紙上的新生兒全血樣品中促甲狀腺素(TSH)的濃度，主要用于新生兒甲狀腺功能低下的篩查。
背景技術(shù)：
“時(shí)間分辨熒光免疫分析”理論是芬蘭的Soini和Hemmila于1979年在首次提出， 1984車，Hemmila確定了時(shí)間分辨免疫分析技術(shù)方案。目前國(guó)內(nèi)用于檢測(cè)新生兒血中促甲狀腺素濃度最廣泛的實(shí)驗(yàn)方法是酶法和熒光法。雖然酶是一種理想的標(biāo)記物，但對(duì)于測(cè)量酶反應(yīng)生色產(chǎn)物OD值的酶法其靈敏度難以對(duì)高濃度待測(cè)物直接準(zhǔn)確定量。常規(guī)熒光分子為標(biāo)記物的傳統(tǒng)熒光法由于受到散射光，不同來(lái)源的背景熒光以及熒光淬滅等因素的影響分析靈敏度一般為10_8 lO—nmol/L，只限于測(cè)定一些對(duì)靈敏度要求不高的待測(cè)物以及某些小分子。時(shí)間分辨熒光免疫法集酶標(biāo)記技術(shù)和同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身，其反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性高，具有高度可檢測(cè)性，高分析靈敏度一般為10_18mOl/L，寬的測(cè)量范圍，優(yōu)良的分析精密性，試劑壽命更長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)便是目前最具優(yōu)勢(shì)的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種采用時(shí)間分辨熒光免疫法，定量檢測(cè)促甲狀腺激素濃度的試劑盒。本發(fā)明采用時(shí)間分辨熒光免疫法，所制備的促甲狀腺激素定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)范圍寬。本發(fā)明進(jìn)一步目的是提供更適用于新生兒甲狀腺功能低下癥的篩查方法。本發(fā)明提供的采用時(shí)間分辨熒光免疫法，其包含下述步驟(1)將TSH單克隆抗體包被到96孔板上；(2)將稀土離子Eu標(biāo)記到TSH單克隆抗體上；(3)通過(guò)特定色譜柱分離純化Eu-Anti-TSH結(jié)合物與游離Eu3+ ；(4)增強(qiáng)液的制備；(5)在分析緩沖體系中加入疊氮鈉替代品ft~OClin300。本發(fā)明提供一種促甲狀腺激素定量檢測(cè)試劑盒，適用于新生兒甲狀腺素低下的臨床篩查。具體檢測(cè)方法來(lái)源于時(shí)間分辨熒光免疫(TRFIA)技術(shù)。本發(fā)明也提供一種標(biāo)記抗體的方法。將帶有稀土離子的雙功能螯合物標(biāo)記到TSH 抗體上，在中性或接近中性的條件下，抗體結(jié)合物具有足夠高的絡(luò)合穩(wěn)定性。本發(fā)明也提供一種抗體分離純化的方法。為了獲得高活性和高純度的抗體，本發(fā)
3明通過(guò)kphadex G-50色譜柱分離抗體結(jié)合物與游離稀土離子。根據(jù)本發(fā)明，上述用于制備時(shí)間分辨熒光免疫試劑中所需抗體結(jié)合物的提純方法，都可以應(yīng)用kphadex G-50色譜柱分離抗體結(jié)合物與游離稀土離子。本發(fā)明以公知的方法研制用于TSH時(shí)間分辨熒光免疫法的試劑，通過(guò)雙功能螯合物標(biāo)記上稀土離子，再運(yùn)用色譜柱分離抗體結(jié)合物與游離稀土離子。制備出抗體結(jié)合物。將標(biāo)記分離抗體的方法應(yīng)用于TSH試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)中試劑的制備，也包括任何可用于雙抗夾心法原理的檢測(cè)項(xiàng)目。例如HCG (促性腺絨毛膜激素)，AFP (甲胎蛋白)，可根據(jù)需要提純標(biāo)記抗體。增強(qiáng)液的制備方法?？捎糜诟鞣N時(shí)間分辨熒光免疫法檢測(cè)項(xiàng)目中的增強(qiáng)液效能的提高，例如HCG，AFP。根據(jù)本發(fā)明，以公知的方法研發(fā)TSH檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)中的試齊U。例如，將帶有稀土離子的雙功能螯合物標(biāo)記到抗體上，再運(yùn)用色譜柱分離抗體結(jié)合物與游離稀土離子，制備出Eu-抗體。增強(qiáng)液的制備?？贵w包被培養(yǎng)板。用TSH單克隆抗體包被96孔培養(yǎng)板，從而制備出時(shí)間分辨熒光免疫法定量檢測(cè)試劑盒中的TSH包被板。為了提高增強(qiáng)液的效果，在增強(qiáng)液中加入β -ΝΤΑ，通過(guò)調(diào)整其濃度使得最終試劑的熒光強(qiáng)度得到極大的提高，同時(shí)也提高了試劑的反應(yīng)靈敏度。從而制備出時(shí)間分辨熒光免疫法定量檢測(cè)試劑盒中的增強(qiáng)液試劑。促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)中的Eu-抗體制備方案，可用于生產(chǎn)促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)，也可用來(lái)開(kāi)發(fā)新的時(shí)間分辨熒光免疫法定量檢測(cè)試劑盒。促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)中的增強(qiáng)液制備方案，可用于生產(chǎn)促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)，也可應(yīng)用于其它的時(shí)間分辨熒光免疫法定量檢測(cè)試劑盒。促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)中的分析緩沖體系中加入疊氮鈉替代品ft~OClin300，可用于生產(chǎn)促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)，也可應(yīng)用于其它檢測(cè)項(xiàng)目的時(shí)間分辨熒光免疫法定量檢測(cè)試劑盒。


圖1 標(biāo)記免疫技術(shù)的理論檢測(cè)靈敏度圖示。圖2 抗體標(biāo)記技術(shù)。圖3 雙抗夾心法示意圖。圖4 TRFIA 配基標(biāo)記物 β -NTA。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的內(nèi)容更為明確，以下為促甲狀腺激素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)中試劑的重點(diǎn)制備操作過(guò)程。 1、Eu-Anti-TSH標(biāo)記并分離抗體的流程
(1)用雙蒸水溶解Eu3+螯合物；
(2)待溶解后，取Img Eu3+螯合物溶液加入到Img TSH單克隆抗體溶液中，室溫反應(yīng) 48h ；(3)通過(guò)kphadex G-50色譜柱分離Eu-Anti-TSH結(jié)合物與游離Eu3+ ；(4)收集熒光計(jì)數(shù)大于100萬(wàn)的洗脫液，即為Eu-Anti-TSH結(jié)合物。2、制備增強(qiáng)液主要原料名稱冰乙酸，Triton X-100 (曲拉通X-100，聚乙二醇辛基苯基醚)，0. IM 鄰苯二甲酸氫鉀(KHP)，β-ΝΤΑ(β-萘甲酰三氟丙酮)，Τ0Ρ0(三辛基氧化磷)，ft~OClin300， 配置方法見(jiàn)下表。增強(qiáng)液配方
權(quán)利要求
1.促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒“時(shí)間分辨熒光免疫法”，其特征在于包括下述步驟(1)通過(guò)色譜柱分離抗體結(jié)合物與游離稀土離子；(2)標(biāo)記時(shí)采用雙功能螯合劑，其一端螯合稀土離子，另一段可與蛋白質(zhì)的-NH2連接， 在中性或接近中性PH條件下，雙功能螯合劑對(duì)稀土離子具有足夠高的絡(luò)合穩(wěn)定性；(3)在增強(qiáng)液中加入β-NTA，通過(guò)調(diào)整其濃度使得最終試劑的熒光強(qiáng)度得到提高；(4)在分析緩沖體系中替換傳統(tǒng)生產(chǎn)中常規(guī)使用的疊氮鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的標(biāo)記有稀土離子的雙功能螯合物有氯磺化鄰三聯(lián)苯(BTBCT)，二乙三胺五乙酸(DTPA)，異硫氰酸苯基二乙胺四乙酸(EDTA)，優(yōu)選異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸(DTTA)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的稀土離子有Eu3+，Tb3+，Dy3+，Sm3+，優(yōu)選Eu3+。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的增強(qiáng)液中加入β-ΝΤΑ，通過(guò)調(diào)整其濃度使得最終試劑的熒光強(qiáng)度得到極大提高，同時(shí)也提高了試劑的反應(yīng)靈敏度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟(1)的分離方法是通過(guò)色譜柱分離優(yōu)選的是kphadex G-50色譜柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟(4)的疊氮鈉替代物為ftOclin300，在分析緩沖液體系中加入了 PrOClin300，防止了疊氮鈉在生產(chǎn)配置和試驗(yàn)廢棄物排放時(shí)對(duì)環(huán)境造成的危害。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述WkphadexG_50色譜柱可用來(lái)生產(chǎn)促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)，也可用來(lái)制備其它稀土離子標(biāo)記的抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的增強(qiáng)液β-NTA可用來(lái)生產(chǎn)促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)中的增強(qiáng)液，也可用來(lái)制備其它時(shí)間分辨熒光免疫法試劑盒中的增強(qiáng)液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的疊氮鈉的替代品ft~OClin300，可用來(lái)生產(chǎn)促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)中的緩沖液體系，也可用來(lái)制備其它時(shí)間分辨熒光免疫法試劑盒中的緩沖液體系。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述制備標(biāo)記抗體的方法，可用來(lái)生產(chǎn)促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)中的EU-TSH抗體，也可用來(lái)研發(fā)新的時(shí)間分辨熒光免疫法定量檢測(cè)試劑盒中的Eu-抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種促甲狀腺激素定量檢測(cè)試劑盒(時(shí)間分辨熒光免疫法)，適用于新生兒甲狀腺素低下的臨床篩查。其特征在于包括下述步驟(1)通過(guò)特定色譜柱分離抗體結(jié)合物(Eu-Anti-TSH)與游離稀土離子(Eu3+)；(2)標(biāo)記時(shí)采用雙功能螯合劑(DTTA)，其一端螯合稀土離子(Eu)，另一段可與蛋白質(zhì)的-NH2連接；(3)在增強(qiáng)液中加入β-NTA，通過(guò)調(diào)整其濃度使得最終試劑的熒光強(qiáng)度得到提高；(4)在分析緩沖體系中加入疊氮鈉替代品Proclin300。根據(jù)本發(fā)明上述步驟中的各項(xiàng)特征，可用來(lái)生產(chǎn)促甲狀腺素定量檢測(cè)試劑盒“時(shí)間分辨熒光免疫法”，也可用于開(kāi)發(fā)其它項(xiàng)目的體外診斷檢測(cè)試劑。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102539761SQ20101057815
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者王曉華 申請(qǐng)人:北京協(xié)和洛克生物技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心