專利名稱：一種特異性多肽及其在乳腺癌早期診斷中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異性多肽，還涉及該多肽在乳腺癌早期診斷中的用途。
背景技術(shù)：
血清多肽組譜圖(簡稱多肽圖)是指通過質(zhì)譜技術(shù)快速分析獲得的血清中多肽 (蛋白質(zhì))組的精確質(zhì)量數(shù)的譜圖。在譜圖中以精確質(zhì)量數(shù)標(biāo)識(shí)的多肽(蛋白質(zhì))峰在必要時(shí)可進(jìn)一步通過生物質(zhì)譜分析獲得蛋白質(zhì)序列。血清多肽圖可在數(shù)分鐘時(shí)間內(nèi)通過微量血液的生物質(zhì)譜分析獲得，已在惡性腫瘤早期診斷中顯示出了良好前景，預(yù)兆了醫(yī)學(xué)分子診斷領(lǐng)域的一次重要突破，為腫瘤患者早期發(fā)現(xiàn)帶來了福音(Sakaki M，Oka N, Nakanishi R, et al. J Med Invest. 2008 ；55 (1-2) :127-32 ；Semmes 0J, et al. Clin Chem 2005 ；51 102-12.)。血清多肽圖作為一種全新的診斷方法，已經(jīng)取得了令人振奮的進(jìn)展。Petricoin 博士等科研人員在美國FDA/NIH的臨床蛋白質(zhì)組計(jì)劃資助下，應(yīng)用血清多肽圖技術(shù)成功地對早期卵巢癌進(jìn)行了診斷。在Lancet雜志上發(fā)表的論文中(Emanuel FP, ArdekaniAM, Hitt ΒΑ, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet 2002 ；359 :572-7.)，利用生物質(zhì)譜技術(shù)分析健康對照組和疾病組血清多肽組的組成模式， 并基于這些模式尋找差異點(diǎn)進(jìn)行臨床卵巢癌的檢測。結(jié)果顯示，50例卵巢癌患者全部正確檢出，其中18例為I期卵巢癌患者；66例婦科良性腫瘤患者中正確檢出63例。該方法檢測卵巢癌的敏感性、特異性和陽性預(yù)測值分別為100%、95%和94%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的CA125 檢測，特別是對早期卵巢癌(I期)的診斷也十分成功，提示此項(xiàng)技術(shù)還可望用于卵巢癌的早期或預(yù)警檢測。之后，國際上先后又有系列的利用血清多肽圖技術(shù)進(jìn)行重大疾病診斷的論文發(fā)表。例如，2004年美國斯坦福大學(xué)的Soltys等人在Clinical CancerResearch上發(fā)表了通過血清多肽組圖譜技術(shù)對鱗狀上皮細(xì)胞癌進(jìn)行診斷的結(jié)果(Soltys SG, Le QT, Shi G，et al. Clinical Cancer Research 2004 ； 10 :4806-4812.) ；2005 年臺(tái)灣大學(xué) Cheng AJ等在Clinical Chemistry上發(fā)表了他們利用血清多肽組圖譜技術(shù)對口腔癌進(jìn)行診斷的結(jié)果(Cheng AJ, Chen LC, Chien KY, et al. Clinical Chemistry 2005 ；51 :2236-2244.)。 此外，JCI、Mollecular & Cellular ftOteomics等雜志最近也發(fā)表了系列的通過血清多肽圖技術(shù)對疾病進(jìn)行診斷的研究結(jié)果(J Clin Invest 2006 ；116 =271-284 ；Mol Cell Proteomics 2006 ；5 1840-1852.)。以上表明，利用多肽圖技術(shù)對臨床上一些重大和疑難疾病進(jìn)行診斷已經(jīng)初露曙光，前景廣闊。但是多肽圖技術(shù)作為新生技術(shù)，還未成為腫瘤診斷的實(shí)用工具，表明它在技術(shù)上還存在一些瓶頸問題有待解決，還正在發(fā)展和成熟過程之中。 概括起來，多肽圖技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷主要存在兩方面技術(shù)障礙。第一，血清多肽組快速分離和制備技術(shù)。它需要滿足快速性、有效性、穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)化和通量化，才能真正符合未來臨床診斷的需要；第二，多肽圖中疾病特征峰的識(shí)別、鑒定和模型建立。它不同于單個(gè)疾病標(biāo)志物的應(yīng)用，而是數(shù)十甚至逾百個(gè)血清多肽的不斷組合的變化。這樣復(fù)雜的改變必須依靠生物信息學(xué)工具的應(yīng)用，才可能識(shí)別出各種復(fù)雜疾病特征性的多肽組變化模式。在此基礎(chǔ)上，才能獲得標(biāo)準(zhǔn)化的多肽圖疾病診斷模型，用于臨床診斷和鑒別診斷，以及重大疾病的臨床前預(yù)警。與其它技術(shù)比較癌癥的早期發(fā)現(xiàn)對于其治療和控制是至關(guān)重要的。盡管先進(jìn)的診斷方法如CT、核磁共振、腫瘤特異性抗原檢測等對于疾病診斷能力有了一定的提高，但在臨床上還未能達(dá)到惡性腫瘤早期發(fā)現(xiàn)所需的靈敏度。高通量的基因組技術(shù)可以快速篩查癌細(xì)胞中的基因改變，如DNA芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在全基因組水平分析檢測癌變過程中基因的異?；罨蚋淖儭５恍┡c腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的改變可能與基因水平異常無關(guān)，而與基因表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)的改變直接相關(guān)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)廣泛用于在體液中單個(gè)、 特異性已知的標(biāo)志物的檢測，但在臨床上應(yīng)用還依賴于新的標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)。血清多肽組技術(shù)使用復(fù)合的標(biāo)志物可以較單個(gè)標(biāo)志物更為可靠和有效，而且所反映的不僅僅是傳統(tǒng)概念上的腫瘤標(biāo)志物。多肽組的疾病相關(guān)改變，可能是蛋白質(zhì)過量表達(dá)和蛋白質(zhì)異常表達(dá)在血清中的反映，也可能是在疾病狀態(tài)下機(jī)體整體機(jī)能反應(yīng)的體現(xiàn)，而且隨著疾病的發(fā)生和發(fā)展被修飾或移除。通過質(zhì)譜分析獲得的多肽圖需要數(shù)字化并經(jīng)成熟的生物信息學(xué)分析工具進(jìn)行診斷，可與一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織或一個(gè)機(jī)體在“正常”條件下的參考圖譜進(jìn)行比較，從而鑒別疾病樣本的血清多肽組圖譜。腫瘤是威脅人類健康的第一大殺手，而且發(fā)病年齡越來越提前。大多數(shù)腫瘤患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)多已處于晚期，因此早期診斷顯得十分重要，對患者的愈后與生存意義重大，理論和現(xiàn)實(shí)意義明顯。血清多肽圖技術(shù)在癌癥早期診斷中已經(jīng)顯示的價(jià)值超過了傳統(tǒng)的標(biāo)志物檢測，在腫瘤早期診斷方面?zhèn)鞒隽肆钊苏駣^的信息，給相對沉寂的腫瘤診斷領(lǐng)域帶來了可以寄托的希望。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決乳腺癌早期診斷的問題，本發(fā)明公開了一種特異性多肽，其氨基酸序列如序列表中的序列1和序列2所示。本發(fā)明還公開了的上述多肽在乳腺癌早期診斷中的用途。該用途是通過以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的。首先建立特征性的血清多肽圖，通過生物信息學(xué)軟件找到腫瘤特異性的多肽組，建立診斷模型，提供一種用于乳腺癌早期診斷的方法。本發(fā)明的特異性血清多肽是通過以下方法提取并篩選的。采用本申請人的另一專利申請“一種金屬螯合納米磁珠，其制備方法及應(yīng)用” O00610002030. 1)中的方法，利用固相金屬螯合磁珠試劑提取每例患者血清中的多肽，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析獲得血清多肽圖，通過Bruker公司的 Cliprotools2. 0軟件進(jìn)行健康組與腫瘤組的比較分析、識(shí)別差異表達(dá)的多肽，建立模型，進(jìn)行診斷。差異多肽可進(jìn)一步通過傅立葉變換回旋共振質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定。本發(fā)明從多肽水平進(jìn)行乳腺癌的早期診斷研究，對于篩選潛在的腫瘤藥物靶標(biāo)分子和功能蛋白質(zhì)，研制和開發(fā)新的乳腺癌治療藥物，具有重要的意義，有巨大的市場前景和社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。


圖 1 :NanoLC-FT-ICR MS/MS 鑒定的纖維蛋白原多肽序列為 SSSYSKQFTSSTSYNRGDS TFESKSYKMADEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV，單同位素分子量為 5900. 6956Da。(i)乳腺癌血清多肽碎片的色譜峰，箭頭指的是分子量為5900. 6956Da的多肽。(ii)串聯(lián)質(zhì)譜圖y離子結(jié)果。
圖 2 =NanoLC-FT-ICR MS/MS 鑒定的抗糜蛋白酶多肽序列為 LVETRTIVRFNRPFLMII VPTDTQNIFFMSKVTNPKQA，單同位素分子量為4464. 4177Da. (i)乳腺癌血清多肽碎片的色譜峰，箭頭指的是分子量為4464. 4177Da的多肽.(ii)4464. 4177Da串聯(lián)質(zhì)譜圖y離子結(jié)果。 (iii)4464. 4177Da串聯(lián)質(zhì)譜圖b離子結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一表面螯合金屬銅的磁珠的制備一、材料FeC13 批號(hào)QD2004年3月11日，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；PEG 1500 批號(hào):25300-68-3, FLUKA 產(chǎn)品；吡咯烷酮(2-pyrrolidone) :S34844146，MERCK-Schuchardt 產(chǎn)品；環(huán)氧氯丙烷批號(hào)981219，天津化學(xué)試劑六廠；二甲基亞砜99.7 %，批號(hào) A0208798001, ACROS ORGANICS 產(chǎn)品；亞氨基二乙酸(IDA)批號(hào) F20041203 ；透射電鏡 Philips CMl20 ；Bio-Rad公司FTS-65A傅里葉變換紅外光譜儀。國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；ICP-MS 7500安捷倫科技有限公司。二、方法結(jié)果詳見中國專利申請“一種金屬螯合納米磁珠，其制備方法及應(yīng)用”(申請?zhí)?200610002030. 1)(一 )超順磁性表面包被羥基的納米!^304粒子的制備利用熱水解法一步合成表面連有羥基核心為Fe304的納米磁珠。將1.35gFeC13充分溶解在過量吡咯烷酮中，并在攪拌條件下加入聚乙二醇 PEG-15007. 5g，PEG-1500與FeC13的摩爾比為1 1，充分混勻后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流， 然后用弱極性有機(jī)溶劑比例為5 1的乙醚/丙酮沉淀!^304的納米磁性粒子，一步反應(yīng)得到表面包被羥基的納米狗304磁珠?；亓鲿r(shí)間應(yīng)為5小時(shí)，得到的超順磁性納米粒子通過投射電鏡觀察直徑在IO-IOOnm范圍，紅外光譜檢測表面成功包被聚乙二醇。得到的超順磁性納米粒子的尺寸和性能符合要求。( 二)表面螯合金屬銅的磁珠的制備(1)表面螯合金屬銅的磁珠的制備①在上述的納米!^304粒子中加入高濃度氫氧化鈉溶液活化，使氫氧化鈉濃度達(dá)到8mol/L，溶液的PH值為14，活化溫度為60度，活化充分后離心分離磁珠。②在上述堿活化后的納米磁珠中加入過量一定比例的無機(jī)堿/ 二甲基亞砜/環(huán)氧氯丙烷繼續(xù)活化磁珠使連接上環(huán)氧基團(tuán)；所說的一定比例是指高濃度無機(jī)堿/二甲基亞砜 /環(huán)氧氯丙烷按照2 4 5的比例進(jìn)行活化反應(yīng)。反應(yīng)完成后將所得的連接環(huán)氧基團(tuán)的納米磁性粒子用離心的方法從溶液中分離出來。③在上述已連接環(huán)氧基的磁珠中繼續(xù)加入絡(luò)合試劑亞氨基二乙酸(IDA) lg,并用氫氧化鈉調(diào)PH值為8進(jìn)行反應(yīng)，使磁珠表面連接上絡(luò)合試劑，反應(yīng)完成后仍用離心方法將納米磁珠分離。④分離后的納米磁珠在過量的0. 5mol/l硫酸銅溶液中反應(yīng)使表面絡(luò)合銅離子， 得到納米金屬螯合磁珠。(2)表面螯合金屬銅的磁珠的檢測
①金屬銅的含量檢測取干燥的磁珠IOOmg加入過量的硝酸、過氧化氫進(jìn)行消解， 消解完全后，用去離子水定容到50g，通過ICP-MS對銅離子進(jìn)行檢測，得到銅離子含量為 5X108ppb ；②磁珠粒徑大小的檢測取適量磁珠溶于無水乙醇溶液中，鋪于銅網(wǎng)上使其分散完全，在透射電鏡下進(jìn)行觀察，得到的納米磁珠粒徑在10-200nm范圍。實(shí)施例二金屬銅螯合納米磁珠的提取血清多肽一、材料結(jié)合緩沖溶液0. lmol/1磷酸緩沖溶液，PH為4沖洗緩沖溶液0. 1 %的甲酸水溶液洗脫液0. 1 %的甲酸和50 %乙腈水溶液乳腺癌患者血清50例健康對照血清50例二、方法結(jié)果取金屬銅螯合納米磁珠20 μ L，用結(jié)合緩沖溶液洗3次，使磁珠處于結(jié)合緩沖溶液的條件下，每次用磁場進(jìn)行分離，然后加入 ο μ L血清使充分混勻，并在室溫孵育10分鐘， 然后再通過磁場進(jìn)行分離。上述操作完成后，再加入沖洗緩沖溶液洗三次，將未結(jié)合的蛋白質(zhì)、多肽充分洗去，并同時(shí)除去體液中的鹽以適應(yīng)質(zhì)譜的分析需要。接著加入洗脫液將結(jié)合的蛋白質(zhì)、多肽洗脫下來，得到可直接用于質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)和多肽樣本。整個(gè)操作所需時(shí)間僅為1小時(shí)。 多肽樣本與α-羥基肉硅酸混合點(diǎn)靶，MALDI-TOF-MS(Aut0flex，Bruker公司)分析獲得血清多肽圖；若通過2-DE的方法來提取分離蛋白和多肽至少需要一天，并且不能直接用于質(zhì)譜分析，還需酶切等復(fù)雜步驟的處理才可用于質(zhì)譜分析，所以要得到與磁珠方法相比質(zhì)譜中同樣多的蛋白和多肽峰，則至少需要1周的時(shí)間。因此該磁珠提取蛋白的效率高，所需時(shí)間短，可通量化。實(shí)施例二乳腺癌血清多肽圖的生物信息學(xué)分析一、軟件Cliprotools 2. 0 分析軟件，bruker 公司二、方法將50例正常血清多肽圖與50例乳腺癌多肽圖分別隨機(jī)選取各30例用于建立乳腺癌診斷模型，并篩選差異多肽。獲得的診斷模型cross validation與recognition capability均在95%以上，用其余20例正常對照和乳腺癌樣本進(jìn)行驗(yàn)證，僅2例乳腺癌和 1例正常樣本驗(yàn)證錯(cuò)誤，診斷準(zhǔn)確率在92. 5%。實(shí)施例三乳腺癌特異血清多肽的序列鑒定一、材料乳腺癌患者血清10例健康對照血清10例9. 4T Q-FT-ICR-MS (Bruker 公司)。二、方法結(jié)果1、參照實(shí)施例一，用磁珠提取血清多肽，將10例乳腺癌提取得多肽混合，10例正常對照提取得多肽混合?；旌虾蟮亩嚯臉悠贩謩e在離心干燥機(jī)中濃縮除去有機(jī)相。準(zhǔn)備質(zhì)譜分析鑒定標(biāo)志多肽序列。2、將多肽樣品進(jìn)樣nano LC-9.4T Q-FT-ICR-MS，梯度洗脫，同時(shí)串聯(lián)質(zhì)譜鑒定多肽，得到的譜圖通過DataAnalysis軟件(Bruker公司)分析獲得序列。得到分子量5901. 70 位纖維蛋白原的多肽，和分子量4465. 74為α抗糜蛋白酶的多肽，序列如下
權(quán)利要求
1.一種特異性多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列1和序列2所示。
2.權(quán)利要求1所述特異性多肽在乳腺癌早期診斷中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述用途，其特征在于利用權(quán)利要求1所述特異性多肽建立腫瘤血清多肽圖數(shù)據(jù)庫，確定正常組與腫瘤之間的差異表達(dá)多肽組，建立診斷模型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述用途，其中診斷模型的診斷準(zhǔn)確率在90%以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種特異性多肽，多肽的氨基酸序列如序列表中序列1和序列2所示。還公開了上述特異性多肽在乳腺癌早期診斷中的用途。本發(fā)明的特異性多肽是利用通過血清多肽圖結(jié)合生物信息學(xué)軟件進(jìn)行比較分析、識(shí)別差異表達(dá)的多肽，進(jìn)而應(yīng)用質(zhì)譜分析鑒定的。利用本發(fā)明公開的特異性多肽，可以制備乳腺癌早期診斷試劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102558328SQ20101058144
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者何昆, 張學(xué)敏, 李愛玲, 王娜, 王杰 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心