專利名稱：氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)/食品檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及氨(氨離子)診斷/測定方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應(yīng)用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。擴散法是標(biāo)本堿化后，釋放出NH3,用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應(yīng)形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準(zhǔn)確性和精密度受到影響，目前已很少應(yīng)用；離子交換法比擴散法更準(zhǔn)確，CV為8% 13% ’離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表面，引起電極的pH發(fā)生變化進行測定，該方法的CV為 3. 5% 4. 8%，回收率高。結(jié)合具體實際，應(yīng)以酶法測定為實用。檢索中國專利，僅查出87105593. 7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
[要解決的技術(shù)問題]本發(fā)明的目的是提供一種氨(氨離子)的測定方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。[技術(shù)方案]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明的方法是一種采用酶循環(huán)擴增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)的聯(lián)用技術(shù)，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處的吸光度變化測定氨(氨離子) 的方法。本發(fā)明氨(氨離子)測定方法的的技術(shù)原理是根據(jù)下述氨激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺腺苷二磷酸+谷氨酰胺+磷酸根谷氨酰胺合成酶氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酸+水+輔酶谷氨酸脫氫酶氨+2-酮戊二酸+還原型輔酶本發(fā)明的方法利用氨激酶(ammonia kinase ；EC 2. 7. 3. 8)酶(偶)聯(lián)谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase ；EC 6. 3. 1. 2)、谷氨酸脫氧酶(GlutamateDehydrogenase ；EC 1. 4. 1. 2 ；EC 1. 4. 1. 3 ；EC 1. 4. 1. 4)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。氨激酶作為作用酶，功能為將氨酶解產(chǎn)生腺苷二磷酸。谷氨酰胺合成酶及谷氨酸脫氫酶作為循環(huán)酶谷氨酰胺合成酶再將谷氨酰胺再次變回氨，谷氨酸脫氫酶將谷氨酸再次變回氨，使氨不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。谷氨酸脫氫酶作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，這樣可以通過測量 340nm處吸光度上升的速度，可以測算氨(氨離子)的濃度大小。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種氨(氨離子)的測定方法。該氨(氨離子)測定方法的步驟如下A、樣品準(zhǔn)備A.1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將氨濃度調(diào)整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品；A. 2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預(yù)處理；將一定量的待測固體樣品像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中；A. 3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升；B、試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷三磷酸、谷氨酰胺與單價磷酸鹽，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. l_2mmol/L、1000-80000U/L、 1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設(shè)副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數(shù)據(jù)處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到
氨的含量
權(quán)利要求
1.一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨(氨離子)濃度測定方法，其測定的技術(shù)原理是根據(jù)下述氨激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺腺苷二磷酸+谷氨酰胺+磷酸根谷氨酰胺合成酶氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酸+水+輔酶谷氨酸脫氫酶氨+2-酮戊二酸+還原型輔酶
2.一種氨(氨離子)的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準(zhǔn)備2. 1. 1標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將其濃度調(diào)整到100微摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預(yù)處理；將一定量的待測固體樣品像制備標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、 腺苷三磷酸、谷氨酰胺與單價磷酸鹽，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. l_2mmol/L、1000-80000U/L、 1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應(yīng)5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設(shè)副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；2.6數(shù)據(jù)處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到氨的含量
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動生化分析儀測定時，待測樣品、所述標(biāo)準(zhǔn)樣品與所述空白樣品由該分析儀在設(shè)定條件下自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為速率法，溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應(yīng)方向為正反應(yīng)，延遲時間1 分鐘，檢測時間4分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩(wěn)定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的輔酶是一種或多種選自NADP+、NAD+或thio-NAD+的輔酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于 5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、單價磷酸鹽、氨激酶、谷氨酰胺合成酶與谷氨酸脫氫酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、谷氨酰胺與單價磷酸鹽組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氨激酶、谷氨酰胺合成酶與谷氨酸脫氫酶組成的；其中輔酶、氨激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、單價磷酸鹽在試劑1或試劑2中的位置是不限定的；5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷三磷酸、谷氨酰胺與單價磷酸鹽組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酰胺合成酶與谷氨酸脫氫酶組成的； 試劑3，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與氨激酶組成的；其中輔酶、氨激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、腺苷三磷酸、谷氨酰胺、單價磷酸鹽在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們?nèi)芙獾玫骄哂邢率鰸舛确秶目芍苯邮褂玫囊后w試劑緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L輔酶0. l-2mmol/L氨激酶1000-80000U/L谷氨酰胺合成酶 1000-80000U/L 谷氨酸脫氫酶 1000-80000U/L 腺苷三磷酸 I-IOOmmo 1/L 谷氨酰胺I-IOOmmo 1/L單價磷酸鹽 I-IOOmmo 1/L ；6. 2根據(jù)權(quán)利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L輔酶0. l-2mmol/L腺苷三磷酸 I-IOOmmo 1/L 谷氨酰胺I-IOOmmo 1/L單價磷酸鹽 I-IOOmmo 1/L ； 組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L氨激酶1000-80000U/L谷氨酰胺合成酶 1000-80000U/L 谷氨酸脫氫酶 1000-80000U/L ； 6. 3根據(jù)權(quán)利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于它有組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L輔酶0. l-2mmol/L腺苷三磷酸 I-IOOmmo 1/L谷氨酰胺I-IOOmmo 1/L單價磷酸鹽 I-IOOmmo 1/L ；組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L谷氨酰胺合成酶 1000-80000U/L谷氨酸脫氫酶 1000-80000U/L ；組成如下的試劑3 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L氨激酶1000-80000U/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨(氨離子)含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術(shù)原理是依據(jù)氨激酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶的系列催化反應(yīng)完成，本發(fā)明還涉及一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。本發(fā)明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發(fā)明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)/食品檢驗。
文檔編號G01N21/31GK102539709SQ20101058421
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司