專利名稱：一種檢測氫化可的松的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測氫化可的松的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。
背景技術(shù)：
氫化可的松是一種腎上腺糖皮質(zhì)激素類藥物，主要作為人畜抗炎癥、抗過敏、抗休克藥，在飼料中使用能起到治療治病、促動(dòng)物生長作用，對(duì)動(dòng)物的增重效果明顯，但其殘留可引起類腎上腺皮質(zhì)亢進(jìn)綜合癥、心血管、消化系統(tǒng)并發(fā)癥及骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮等，嚴(yán)重威脅人們的身體健康。歐盟、美國、日本均規(guī)定了牛奶中最大殘留限量為lOyg/kg。目前國內(nèi)外檢測氫化可的松類藥物的檢測方法主要有熒光光度法、反光光度法、 高效液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法等這幾種方法，由于儀器設(shè)備的復(fù)雜和操作過程繁瑣，對(duì)人員要求較高，不適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測氫化可的松的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測氫化可的松的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括氫化可的松特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為氫化可的松半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)氫化可的松半抗原；當(dāng)所述包被原為氫化可的松半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)氫化可的松半抗原；所述氫化可的松特異性抗體為氫化可的松的單克隆抗體或氫化可的松的多克隆抗體。為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還可包括氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色液、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液。所述濃縮洗滌液為pH值為7. 0-7. 4，含有1.5-2. 5% (質(zhì)量百分含量)吐溫_20 和0.01-0. 03%。(質(zhì)量百分含量)硫柳汞防腐劑，0. 02-0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為PH值為7. 2-7. 6，含有2-4% (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白、0. 02-0. 04mol/ L的磷酸鹽緩沖液；所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液可以為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液可以為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液可以為1 2mol/ L硫酸或鹽酸溶液。所述濃縮洗滌液具體可以為pH值為7. 2，含有1.8% (質(zhì)量百分含量)吐溫_20 和0. 02%。(質(zhì)量百分含量)硫柳汞防腐劑，0. 04mol/L磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液具體可以為PH值為7. 4，含有4% (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白、0. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液； 所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液具體可以為過氧化脲，顯色液B液具體可以為四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液具體可以為2mol/L鹽酸溶液。在洗滌液中加入一定量吐溫-20和疊氮化鈉的作用在于緩沖液中吐溫-20會(huì)減少抗體的非特異性吸附，還能對(duì)蛋白起到一定的保護(hù)作用，加入疊氮化鈉后，則硫柳汞在溶液中抑制細(xì)菌的生長，對(duì)溶液的穩(wěn)定性其到一個(gè)保護(hù)作用。
所述包被緩沖液具體可以為PH值為9. 0-9. 6的0. 1-0. 2mol/L的碳酸鹽沖液；所述封閉液是含有0.5-1.0% (質(zhì)量百分含量)卵清蛋白、0. 1-0.2% (質(zhì)量百分含量)吐溫-20和2-3%奶粉的pH值為7. 4-7. 8的0. 02-0. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述氫化可的松半抗原可以按照如下方法得到氫化可的松和琥珀酸酐混合后， 加入無水吡啶溶解，加熱回流Mh，旋蒸，除去吡啶，冷卻，加入乙酸乙酯，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH 值，有機(jī)相用稀鹽酸萃取，棄去水相，將有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾，除去干燥劑，旋蒸濃縮至lml，用乙酸乙酯石油醚=2 1做展開劑，過柱分離，得到氫化可的松半抗原。所述氫化可的松特異性抗體是用所述氫化可的松半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白為甲狀腺蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、血藍(lán)蛋白、纖維蛋白原或卵清蛋白。氫化可的松是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。本發(fā)明采用混合酸酐法將氫化可的松與載體蛋白偶聯(lián)，突出了氫化可的松的特征結(jié)構(gòu)，同時(shí)也增加了氫化可的松半抗原的免疫源性和特異性。其中，氫化可的松半抗原與載體蛋白的結(jié)合比例過低或過高都對(duì)免疫不利，半抗原與載體蛋白(如卵清蛋白)的結(jié)合摩爾比為(12-16) 1。所述氫化可的松多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體。所述氫化可的松單克隆抗體為由保藏號(hào)為CGMCC No. 4412的對(duì)氫化可的松單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-1-2分泌的抗體。所述酶標(biāo)抗抗體是采用過碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的； 所述過碘酸鈉方法中，所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2 1;所述標(biāo)記酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶。該改良的過碘酸鈉法省略了封閉酶上氨基的步驟，節(jié)省了時(shí)間，又降低了辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節(jié)省了原材料。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測氫化可的松的方法。本發(fā)明所提供的檢測氫化可的松的方法，包括以下步驟1)樣品前處理每2. Og動(dòng)物組織勻漿物中，加入6-10ml乙腈，混勻，3000g以上室溫離心lOmin，
收集上清液；將每2ml所述上清液吹干，加入權(quán)利要求7所述試劑盒中的濃縮復(fù)溶液 1-細(xì)1，混勻，取樣進(jìn)行分析；所述乙腈的體積優(yōu)選為8ml ；所述濃縮復(fù)溶液的體積優(yōu)選為 2ml。樣品的前處理主要是為了從樣品中獲得氫化可的松溶液，從而用于后續(xù)的檢測。2)用上述任一種酶聯(lián)免疫試劑盒檢測1)中所述樣品。3)分析檢測結(jié)果。由保藏號(hào)為CGMCC No. 4412的對(duì)氫化可的松單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D_l_2分泌的氫化可的松單克隆抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。保藏號(hào)為CGMCC No. 4412的對(duì)氫化可的松單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D_l_2也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明檢測氫化可的松的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測樣品中氫化可的松的殘留量；本試劑盒對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時(shí)快速檢測大批量樣品；本試劑盒采用高特異性的氫化可的松單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便，能夠進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的定性和定量篩查，將在氫化可的松的檢測中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明簡化了傳統(tǒng)檢測方法的步驟，縮短了檢測的時(shí)間，具有可觀的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1為以氫化可的松半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、以氫化可的松半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原的試劑盒及其檢測方法一、以氫化可的松半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原的試劑盒的檢測原理如下當(dāng)在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被氫化可的松偶聯(lián)抗原時(shí)，加入樣本溶液或標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，加入氫化可的松特異性抗體溶液，樣本中的氫化可的松藥物與酶標(biāo)板上包被的氫化可的松偶聯(lián)抗原競爭氫化可的松特異性抗體，加入酶標(biāo)記物抗抗體進(jìn)行放大作，用顯色液顯色，樣本吸光度值與氫化可的松藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中氫化可的松的含量，同時(shí)根據(jù)酶標(biāo)板上顏色的深淺，與系列濃度的氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)品溶液顏色比較可粗略判斷樣品中氫化可的松含量的濃度范圍。二、以氫化可的松半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒一般可以包括如下組成1、包被有包被原(包被原為氫化可的松半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物)的酶標(biāo)板包被原的濃度可以為0. 10-0. 20 μ g/ml ；2、酶標(biāo)抗抗體工作液用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體；酶標(biāo)二抗的稀釋液為PH值為7. 2-7. 8，含有0.8-1. 2% (質(zhì)量百分含量)酪蛋白、 0. 01-0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液，酶標(biāo)抗抗體工作液稀釋度為1 300。3、氫化可的松特異性抗體工作液可以為氫化可的松多克隆抗體或氫化可的松單克隆抗體工作液；稀釋液為PH值為7. 2-7. 6，含有2-4% (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白、 0. 02-0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液。4、氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)品(購于sigma，CAS 50-23-7)溶液6瓶，濃度分別為Oyg/ L、0. 05 μ g/L、0. 1 μ g/L、0. 3 μ g/L、0. 6 μ g/L、1· 8 μ g/L ；稀釋溶液為 pH 值為 7. 2-7. 6，含有 1.0-2.0% (質(zhì)量百分含量)卵清蛋白、0.01-0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液。5、底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲或過氧化氫，7ml/ 瓶，1瓶；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺或鄰苯二胺，7ml/瓶，1瓶。6、終止液l-2mol/L鹽酸或硫酸。7、濃縮洗滌液pH值為7. 0-7. 4，含有1.5-2.5% (質(zhì)量百分含量)吐溫-20和 0. 01-0. 03%。(質(zhì)量百分含量)硫柳汞防腐劑，0. 02-0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；40ml/瓶，1瓶。8、濃縮復(fù)溶液pH值為7. 2-7. 6，含有2_4 % (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白、 0. 02-0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；50ml/瓶，1瓶。三、本實(shí)驗(yàn)中以氫化可的松半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為包被原的酶聯(lián)免疫試劑盒具體包括1、包被有包被原(包被原為氫化可的松半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物)的酶標(biāo)板。2、酶標(biāo)抗抗體工作液用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體。酶標(biāo)二抗的稀釋液為PH值為7. 6，含有1.0% (質(zhì)量百分含量)酪蛋白、0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，酶標(biāo)抗抗體工作液稀釋度為1 300。3、氫化可的松單克隆抗體工作液是按照以下方法制備的用稀釋液將氫化可的松單克隆抗體稀釋5000倍，得到單抗工作液，所述稀釋液為PH值為7. 4，含有4% (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白、0. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液。4、氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)品(購于sigma，CAS 50-23-7)溶液6瓶，濃度分別為0 μ g/L， 0. 05 μ g/L, 0. 1 μ g/L, 0. 3 μ g/L, 0.6 μ g/L, 1· 8 μ g/L,稀釋溶液為 pH 值為 7. 4，含有 1.0% (質(zhì)量百分含量)卵清蛋白、0. 01mol/L的磷酸鹽緩沖液。5、底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲；底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺。6、終止液2mol/L鹽酸7、濃縮洗滌液pH值為7. 2，含有1. 8% (質(zhì)量百分含量)吐溫_20和0. 02%。(質(zhì)量百分含量)硫柳汞防腐劑，0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液。8、濃縮復(fù)溶液pH值為7. 4，含有4% (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白、0. 03mol/L 的磷酸鹽緩沖液。其中，包被有氫化可的松半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板、氫化可的松單克隆抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體工作液的制備方法如下所用的包被緩沖液和封閉液可為包被緩沖液pH值為9. 0-9. 6的0. 1-0. 2mol/L的碳酸鹽沖液。封閉液含有0.5-1.0% (質(zhì)量百分含量)卵清蛋白、0. 1-0.2% (質(zhì)量百分含量) 吐溫-20和2-3%奶粉的pH值為7. 4-7. 8的0. 02-0. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液。1、包被有氫化可的松半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板的制備(1)氫化可的松半抗原的制備稱取362mg氫化可的松(購于sigma，CAS 50-23-7)和0. 15g琥珀酸酐同時(shí)加入 IOOml的圓底燒瓶中，加入30ml無水吡啶做溶劑，攪拌溶解，加熱回流反應(yīng)Mh。旋蒸，除去吡啶，冷卻，加入乙酸乙酯25ml，滴加0. lmol/L的稀鹽酸，除去酸水層，有機(jī)相再用0. Imol/ L的鹽酸萃取，棄去水相，將有機(jī)相用無水硫酸鎂干燥，過濾，除去干燥劑，旋蒸濃縮至1ml， 用乙酸乙酯石油醚=2 1做展開劑，過柱分離，得氫化可的松半抗原。(2)包被原的制備將氫化可的松半抗原和牛血清白蛋白采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到包被抗原，具體步驟如下取氫化可的松半抗原30mg，充分溶解于ImlDMF中，得到I液；稱取BSA50mg，充分溶解在2ml, ρΗ7· 2的PBS緩沖液中，得到II液；將I液逐滴緩慢滴加到II液中，得到III 液；稱取12. 5mgEDC用Iml去離子水溶解后緩慢于室溫下加入III液中，攪拌反應(yīng)Mi ；用 0. Olmol/LPBS透析3天，每天換2次透析液；12000rpm離心30min，收集上清，分裝，于_20°C 保存?zhèn)溆谩?3)包被有包被原的酶標(biāo)板的制備用包被緩沖液將氫化可的松半抗原與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物稀釋成 0. 10-0. 20μ g/ml，每孔加入IOOy 1，37°C溫育2h或4°C過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2 次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200 μ 1封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。2、氫化可的松單克隆抗體的制備(1)免疫原的制備氫化可的松是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性，這樣突出了氫化可的松分子結(jié)構(gòu)中的特征基團(tuán)，使制備的氫化可的松抗體對(duì)氫化可的松的特異性很高。將氫化可的松半抗原和卵清蛋白，采用混合酸酐法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原，具體步驟如下稱取20mg氫化可的松半抗原用1. OmlDMF溶解，冷卻至10°C，加入氯甲酸異丁酯15 μ 1，10°C攪拌反應(yīng)30min，得到I液；稱取0VA36mg，使之充分溶解在2. 6ml,50mmol/ L碳酸鈉溶液中，得到II液；將I液緩慢滴加到II液中，10°C反應(yīng)4h，4°C過夜；用0. Olmol/ L PBS透析3天，每天換2次透析液；12000rpm離心30min，收集上清，得到免疫原，分裝， 于-20°C保存?zhèn)溆谩?2)制備單抗a.動(dòng)物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為100 μ g/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體。b.細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按9 1(數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合， 篩選得到穩(wěn)定分泌氫化可的松單克隆抗體的對(duì)氫化可的松藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，將此細(xì)胞株命名為D-1-2，該細(xì)胞株已于2010年12月03日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號(hào)為 CGMCC No. 4412。c.細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX IO9個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37°C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。d.單克隆抗體的制備與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0. 9ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5 X IO9 個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，純化后的腹水放入-20°C環(huán)境保存。3、氫化可的松多克隆抗體的制備采用新西蘭大白兔作為免疫動(dòng)物，以氫化可的松與卵清蛋白偶聯(lián)物為免疫原，免疫劑量為1. 5mg/kg體重，首免時(shí)將免疫原與等量的弗氏完全佐混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔3 4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強(qiáng)免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐劑。最后一次免疫10天后采血，測定血清抗體效價(jià)，心臟采血，用硫酸銨分級(jí)沉淀得到純化的多克隆抗體。4、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備(1)抗抗體的制備羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對(duì)無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。羊抗兔抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以兔源抗體為免疫原對(duì)無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗兔抗抗體。(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗抗體的制備將抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)采用改良后的過碘酸鈉法進(jìn)行偶聯(lián)。傳統(tǒng)的過碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4 1;由于辣根過氧化物酶在強(qiáng)氧化的作用下產(chǎn)生許多與抗抗體結(jié)合的位點(diǎn)，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當(dāng)了連接各分子的橋梁，降低了酶標(biāo)記物的酶活性，使制備的偶聯(lián)物中混有許多聚合體。本發(fā)明采用改良的過碘酸鈉法進(jìn)行抗抗體的標(biāo)記，其操作省去了氨基的封閉過程，因?yàn)槟墚a(chǎn)生自身氨基連接的氨基實(shí)際很少。降低了辣根過氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2 1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡便，對(duì)酶的活性的損失減少。四、用步驟三所述試劑盒檢測樣品中氫化可的松1、樣品前處理飼料樣品稱取1.0士0.05g粉碎的飼料，置于50ml離心管中，加入細(xì)1 2%氯化鈉溶液， 4000rpm離心5min，取100 μ 1上清液，加入900 μ 1復(fù)溶工作液，取50 μ 1用于分析。牛奶樣品取100 μ 1新鮮牛奶試樣，加入900 μ 1復(fù)溶工作液稀釋，取50 μ 1用于分析。2、檢測向包被有氫化可的松半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板微孔中加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50 μ 1，再加入單克隆抗體工作液50 μ 1，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入稀釋后的洗滌液，IOs后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。再加入酶標(biāo)二抗工作液100 μ 1，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min。倒出孔中液體，每孔加入稀釋后的洗滌液，IOs后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液A 液過氧化脲50μ 1，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 50 μ 1，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜封板，25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。每孔加入終止液50 μ 1，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處，測定每孔吸光度值(0D值)。3、檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液 (0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。
權(quán)利要求
1.一種檢測氫化可的松的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括氫化可的松特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述包被原為氫化可的松半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物或抗抗體；所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體或酶標(biāo)氫化可的松半抗原；當(dāng)所述包被原為氫化可的松半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)抗抗體；當(dāng)所述包被原為抗抗體時(shí)，所述酶標(biāo)記物為酶標(biāo)氫化可的松半抗原；所述特異性抗體為氫化可的松的單克隆抗體或氫化可的松的多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)溶液、顯色液、濃縮洗滌液、終止液、濃縮復(fù)溶液；所述PH值為7. 0-7. 4，含有 1.5-2.5% (質(zhì)量百分含量)吐溫-20和0.01-0. 03%。(質(zhì)量百分含量)硫柳汞防腐劑， 0. 02-0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為pH值為7. 2-7. 6，含有2_4% (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白、0. 02-0. 04mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為1 2mol/L硫酸或鹽酸溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為pH值為 7. 2，含有1.8% (質(zhì)量百分含量)吐溫-20和0.02%。(質(zhì)量百分含量)硫柳汞防腐劑， . ^! 丨/！的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮復(fù)溶液為？??！值為？乂，含有*1^ (質(zhì)量百分含量)牛血清白蛋白、0. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液；所述顯色液由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化脲，顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺；所述終止液為2mol/L鹽酸溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述氫化可的松半抗原是按照如下方法得到的將氫化可的松與琥珀酸酐通過縮合反應(yīng)得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述氫化可的松特異性抗體是用所述氫化可的松半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物作為免疫原得到的；所述載體蛋白為牛血清蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、血藍(lán)蛋白、纖維蛋白原或卵清蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述氫化可的松單克隆抗體為由保藏號(hào)為CGMCC No. 4412的對(duì)氫化可的松單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-1-2分泌的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)抗抗體是采用過碘酸鈉法將所述標(biāo)記酶與所述抗抗體進(jìn)行偶聯(lián)得到的；所述過碘酸鈉方法中，所述標(biāo)記酶與所述抗抗體的摩爾濃度比為2 1 ；所述標(biāo)記酶為堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶，優(yōu)選為辣根過氧化物酶。
8.—種檢測氫化可的松的方法，包括以下步驟1)樣品前處理稱取1.0士0.05g粉碎的飼料，置于50ml離心管中，加入細(xì)1 2%氯化鈉溶液，4000rpm 離心5min，取100 μ 1上清液，加入900 μ 1復(fù)溶工作液，取50 μ 1用于分析；取100 μ 1新鮮牛奶試樣，加入900 μ 1復(fù)溶工作液稀釋，取50 μ 1用于分析；2)利用權(quán)利要求1-7中任一所述的酶聯(lián)免疫試劑盒檢測1)中所述樣品。
9.由保藏號(hào)為CGMCCNo. 4412的對(duì)氫化可的松單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-1-2分泌的紅霉素單克隆抗體。
10.保藏號(hào)為CGMCCNo. 4412的對(duì)氫化可的松單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株D-1-2。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測氫化可的松的方法及其專用酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括氫化可的松特異性抗體及包被原和酶標(biāo)記物；所述特異性抗體為氫化可的松的單克隆抗體或氫化可的松的多克隆抗體。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價(jià)格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準(zhǔn)確、簡便，能夠進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)控且適合大量樣本的定性和定量篩查，將在氫化可的松的檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102565399SQ201010588129
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月7日
發(fā)明者何麗霞, 馮月君, 馮靜, 劉福林, 楊昌松, 胡德專, 蒲小蓉 申請(qǐng)人:北京望爾生物技術(shù)有限公司