專利名稱：羅丹明b的免疫親和柱-高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
羅丹明B的免疫親和柱-高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，具體涉及到免疫層析柱 的的制備及實際樣品檢測，屬于免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來蘇丹紅，孔雀石綠事件給我國食品出口貿(mào)易帶來很大問題，造成我方的很 大被動。像蘇丹紅本為工業(yè)染料，而非食品添加色素。但一些不法商人為了牟取高額利潤不 顧消費者的健康問題，在食品中非法添加這些成本低、色彩鮮艷的工業(yè)染料。2008年衛(wèi)生部 發(fā)布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》，明確 規(guī)定蘇丹紅、堿性橙、酸性橙、羅丹明B類工業(yè)染料禁止在食品中添加。所以食品中違禁色 素一直是食品安全檢測的重點。目前對違禁色素的檢測主要側(cè)重在儀器分析，對免疫分析 涉及很少。免疫分析基于抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性較于儀器分析其特異性強、靈敏度高， 不僅可以大大簡化甚至可以省去樣品前處理的復(fù)雜過程，而且避免了因大量使用溶劑而對 環(huán)境的污染，再而免疫分析一般不需貴重儀器，具便攜性，不需要專門的技術(shù)人員，便于推 廣。因此對違禁色素的免疫分析研究是必不可少的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有檢測技術(shù)的缺陷，建立一種方便快速的樣品處理方 法，并在此基礎(chǔ)上建立羅丹明B的檢測方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種羅丹明B的免疫親和柱-高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法， 以抗羅丹明B的抗體與四甲氧基硅烷TMOS偶聯(lián)包埋于層析柱中，通過吸附、洗脫達到樣品 凈化的效果，最后通過高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測；
1、羅丹明B免疫親和柱的制備，步驟為
(1)取0.2mL的0. 04mol/L HCl溶液，0. 75mL的去離子水，3. 4mL的TMOS (四甲氧基硅 烷)混勻。4°C保存2-aiiin ；取出，超聲粉碎30min ；
(2)取一質(zhì)量已知的燒杯，吸取20μ L羅丹明B抗體溶液，用PBS (0. Olmol/L、pH7. 4) 稀釋至lmL，得羅丹明B抗體溶液，4°C保存。(3)取步驟(1)超聲完全后的混合液，吸取其中ImL試樣，加入羅丹明B抗體溶液 中，混勻，使之凝膠。(4)待凝膠結(jié)束后，燒杯稱重，置于37°C恒溫烘箱凝膠老化，待凝膠失去初重的 50%時，老化過程結(jié)束，將老化后的凝膠(約Ig)研磨粉碎，裝柱。(5)待柱中凝膠沉積穩(wěn)定后，用5mL pH7. 4、0. Olmol/L的PBS預(yù)淋洗，洗去未包埋 的羅丹明B抗體和其他干擾雜質(zhì)，最后用5mL pH7. 4、0. Olmol/L的PBS平衡，即制得羅丹明 B的免疫親和柱。2、羅丹明B免疫親和柱的吸附、洗脫 平衡=IOmL ρΗ7· 4、0· Olmol/L 的 PBS ；
3上樣待測的樣品溶液；
洗滌用5mL pH7. 4、0. 01mol/L的PBS洗滌，再用5mL超純水洗滌； 洗脫5mL甲醇洗脫，收集洗脫液待測。3、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測，步驟為
(1)以一定水平的羅丹明B加入辣椒粉樣品中，在室溫下至少靜置15min ；
(2)取上述添加羅丹明B的辣椒粉樣品lg，加入IOmL含體積百分20%丙酮的正己烷， 震搖10 min，靜置、過濾使分離出上層清液，殘渣加入IOmL含體積百分20%丙酮的正己烷重 復(fù)提取一次，合并2次提取液，混勻；
(3)移取提取液于氮吹儀上吹干，用0.OlM PBS重溶，吹干后的樣品用0. OlM PBS以質(zhì) 量計稀釋10倍；
(4)用IOmL0. OlM PBS平衡免疫親和柱；
(5)加樣，用5mL0. OlM PBS洗滌，再用5mL超純水洗滌，洗去未吸附樣品；
(6)5mL甲醇溶液洗脫柱上樣品，收集洗脫液；
(7)洗脫液經(jīng)0.22 μ 孔徑的聚四氟乙烯膜過濾后進行高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明方法可以簡化羅丹明B殘留檢測的樣品處理過程，同 時可達到凈化濃縮的效果，成本低廉，快速，便攜。


圖1羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。 具體實施方案1、羅丹明B免疫親和柱的制備
(1)取0.2mL的0. 04mol/LHCl溶液，0. 75mL的去離子水，3. 4mL的TMOS (四甲氧基硅 烷)混勻。4° C保存2-;3min ；取出，超聲粉碎30min ；
(2)取一質(zhì)量已知的燒杯，吸取20μ L羅丹明B抗體溶液，用PBS (0. Olmol/L、pH7. 4) 稀釋至lmL，得羅丹明B抗體溶液，4° C保存。(3)取步驟(1)超聲完全后的混合液，吸取其中ImL試樣，加入羅丹明B抗體溶液 中，混勻，使之凝膠。(4)待凝膠結(jié)束后，燒杯稱重，置于37° C恒溫烘箱凝膠老化，待凝膠失去初重的 50%時，老化過程結(jié)束，將老化后的凝膠(約Ig)研磨粉碎，裝柱。(5)待柱中凝膠沉積穩(wěn)定后，用5mL pH7. 4、0. Olmol/L的PBS預(yù)淋洗，洗去未包埋 的羅丹明B抗體和其他干擾雜質(zhì)，最后用5mL pH7. 4、0. Olmol/L的PBS平衡，即制得羅丹明 B的免疫親和柱。2、羅丹明B免疫親和柱的吸附、洗脫 平衡=IOmL ρΗ7· 4、0· Olmol/L 的 PBS ； 上樣待測的樣品溶液；
洗滌用5mL pH7. 4、0. Olmol/L的PBS洗滌，再用5mL超純水洗滌； 洗脫5ml甲醇洗脫，收集洗脫液待測。3、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測，步驟為取辣椒粉Ig于50mL離心管中，加一定濃度的羅丹明標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩混勻。加入IOmL含 20%丙酮的正己烷，震搖lOmin，靜置或過濾使分離出上層清液，殘渣加入IOmL含20%丙酮 的正己烷重復(fù)提取一次，合并2次提取液，混勻。于氮吹儀上吹干，用0. OlM PBS重溶，樣品 用0. OlM PBS稀釋10倍，得樣品提取液。用IOmL PBS平衡免疫親和柱柱后，加樣，用5mL PBS洗滌，再用5mL超純水洗滌，洗去未吸附樣品。5mL甲醇溶液洗脫柱上樣品，收集洗脫液， 洗脫液經(jīng)0. 22 μ 孔徑的聚四氟乙烯膜過濾后進行高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測。4、試驗結(jié)果如下 (1)免疫親和柱偶聯(lián)率
羅丹明B多克隆抗體與四甲氧基硅烷偶聯(lián)后，用PBS多次淋洗，洗去未偶聯(lián)上的羅丹明 B抗體，收集洗滌液，通過紫外測定計算偶聯(lián)率如表1。表1抗體偶聯(lián)率
權(quán)利要求
1. 一種羅丹明B的免疫親和柱-高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，其特征在于以抗羅丹 明B的抗體與四甲氧基硅烷TMOS偶聯(lián)包埋于層析柱中，通過吸附、洗脫達到樣品凈化的效 果，最后通過高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測；A、羅丹明B的免疫親和柱的制備，步驟為(1)取0.2mL的0. 04mol/L HCl溶液，0. 75mL的去離子水，3. 4mL的四甲氧基硅烷TMOS 混勻，4°C保存2-aiiin ；取出，超聲粉碎30min ；(2)取一質(zhì)量已知的燒杯，吸取20μ L羅丹明B抗體，用pH7. 4,0. 01mol/L PBS稀釋至 lmL，得羅丹明B抗體溶液，4°C保存；(3)取步驟(1)超聲完全后的混合液，吸取其中ImL試樣，加入羅丹明B抗體溶液中，混 勻，使之凝膠；(4)待凝膠結(jié)束后，燒杯稱重，置于37°C恒溫烘箱凝膠老化，待凝膠失去初重的50%時， 老化過程結(jié)束，將Ig老化后的凝膠研磨粉碎，裝柱；(5)待柱中凝膠沉積穩(wěn)定后，用5mLpH7. 4、0. 01mol/L的PBS預(yù)淋洗，洗去未包埋的羅 丹明B抗體和其他干擾雜質(zhì)，最后用5mL pH7. 4、0. 01mol/L的PBS平衡，即制得羅丹明B的 免疫親和柱；B、羅丹明B的免疫親和柱的吸附、洗脫平衡=IOmL ρΗ7· 4、0· 01mol/L 的 PBS ；上樣待測的樣品溶液；洗滌用5mL pH7. 4、0. 01mol/L的PBS洗滌，再用5mL超純水洗滌；洗脫5mL甲醇洗脫，收集洗脫液待測；C、高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測，步驟為(1)以一定水平的羅丹明B加入辣椒粉樣品中，在室溫下至少靜置15min ；(2)取上述添加羅丹明B的辣椒粉樣品lg，加入IOmL含體積百分20%丙酮的正己烷， 震搖10 min，靜置、過濾使分離出上層清液，殘渣加入IOmL含體積百分20%丙酮的正己烷重 復(fù)提取一次，合并2次提取液，混勻；(3)移取提取液于氮吹儀上吹干，用0.OlM PBS重溶，吹干后的樣品用0. OlM PBS以質(zhì) 量計稀釋10倍；(4)用IOmL0. OlM PBS平衡免疫親和柱；(5)加樣，用5mL0. OlM PBS洗滌，再用5mL超純水洗滌，洗去未吸附樣品；(6)5mL甲醇溶液洗脫柱上樣品，收集洗脫液；(7)洗脫液經(jīng)0.22 μ 孔徑的聚四氟乙烯膜過濾后進行高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測。
全文摘要
羅丹明B的免疫親和柱-高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，屬于免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以抗羅丹明B的抗體與四甲氧基硅烷(TMOS)偶聯(lián)包埋于層析柱中，通過吸附、洗脫達到樣品凈化的效果，再進行高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測。本發(fā)明方法可以簡化羅丹明B殘留檢測的樣品處理過程，同時可達到凈化濃縮的效果，成本低廉，快速，便攜。
文檔編號G01N30/14GK102087278SQ20101060099
公開日2011年6月8日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者劉微波, 宋珊珊, 林菲, 王利兵, 胥傳來, 趙書閣, 趙媛 申請人:江南大學(xué)