專利名稱：一種雙模式光學成像探針及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉 及納米材料學和生物分析化學領域，具體涉及一種雙模式光學成像探針及其制備方法，該雙模式光學成像探針集熒光和表面增強拉曼散射(SERS)信號于一體；該制備方法操作簡單、可重復性好、成本低廉并且環(huán)境友好。
背景技術：
光學成像技術能夠直觀顯示生物活體內(nèi)的基因表達和細胞活動，是分子及細胞影像技術中的強有力手段，正在被越來越廣泛地應用于醫(yī)學及生物學研究領域。與其他活體動物體內(nèi)的成像技術，如超聲(ultrasound)、計算機斷層顯像(computed tomography, CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)、正電子衍身寸成像 (positron-emissiontomography, PET)相比，光學成像具有許多獨特的優(yōu)點，如操作簡便、 結果直觀、測量快速、靈敏度高及費用低廉等。目前該技術已被廣泛應用于生命科學、醫(yī)學研究及藥物研發(fā)等領域。各種活體成像技術中，熒光成像技術發(fā)展最快，并在生物傳感、藥物研發(fā)、腫瘤診斷治療等領域中得到廣泛應用。近年來，新型熒光成像材料的出現(xiàn)，大大提高了熒光成像的靈敏度和信噪比，促進了熒光成像的應用。比如，Lakadamyal i等人在寬場顯微鏡下用pH敏感的熒光探針標記流感病毒，對病毒從細胞膜至細胞核的過程進行了跟蹤，Rieder等人對活細胞有絲分裂進行了實時觀察，在56分鐘內(nèi)記錄了一個細胞分裂的全過程，為研究活細胞生命活動復雜過程提供了清晰的圖像。盡管熒光成像技術已經(jīng)廣泛應用于生命科學領域并取得了顯著的成果，但它仍然存在光漂白、發(fā)射譜寬等問題，制約了其在某些探測領域中的進一步應用。在目前的各種光學成像技術中，新興的表面增強拉曼散射(SERS)光譜成像由于結合了傳統(tǒng)拉曼散射和等離子激元波增強的優(yōu)勢，在其誕生后的短短幾年內(nèi)就得到了飛速發(fā)展。SERS突破了傳統(tǒng)拉曼散射存在的散射截面低而帶來的瓶頸，避免了熒光光譜成像中存在的光漂白以及熒光標記的毒性等問題，是當前國際上備受矚目的研究焦點，已成功地應用于材料分析、生物分子探測、蛋白質相互作用研究等領域。SERS成像技術由于具有可以避免熒光標記中的光漂白，降低對細胞的毒性，提供豐富的光譜信息等優(yōu)勢，成為人們研究的熱點。盡管關于SERS探針的結構和制備方法已有大量報道，但能適用于生物活體的探針并不多，并且制備方法較為繁瑣，靈敏度、穩(wěn)定性和生物兼容性尚有待進一步提高。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的為了克服現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明的第一目的為提供一種雙模式光學成像探針，該雙模式光學成像探針集熒光和表面增強拉曼散射(SERS)信號于一體，靈敏度高，穩(wěn)定性和生物兼容性好；本發(fā)明的第二目的為提供一種該雙模式光學成像探針的制備方法，該制備方法操作簡單、可重復性好、成本低廉并且環(huán)境友好。技術方案為實現(xiàn)上述第一目的，本發(fā)明的雙模式光學成像探針，包括分散于水溶液中的納米粒子，每個納米粒子包括核體和包裹層，所述核體為金納米或銀納米聚集體，所述包裹層為交替吸附的多層聚二烯丙基二甲基氯化銨和聚苯乙烯磺酸鈉，包裹層最外層為吸附有熒光材料的聚二烯丙基二甲基氯化銨。所述熒光材料為有機分子熒光染料或量子點材料。該雙模式光學成像探針以金 (或銀)納米聚集體為SERS基底，且該金(或銀)納米聚集體是直接通過拉曼標記物誘導生成；該雙模式光學成像探針在激發(fā)光照射下，可以產(chǎn)生SERS和熒光信號。為實現(xiàn)上述第二目的，本發(fā)明的雙模式光學成像探針的制備方法，包括以下步驟1)制備金納米粒子溶液或銀納米粒子溶液，將拉曼標記物加入金納米粒子溶液或銀納米粒子溶液，混合10 20分鐘，形成拉曼標記物誘導的金納米聚集體或銀納米聚集體；2)在金納米聚集體或銀納米聚集體的水溶液中加入2 4mL濃度為1. 5 2. 5%的聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)水溶液，攪拌1. 5 2. 5小時后離心洗滌并重新分散在水溶液中；幻加入與步驟幻中聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)水溶等體積等濃度的聚苯乙烯磺酸鈉(PSQ水溶液，攪拌1. 5 2. 5小時后離心洗滌并重新分散在水溶液中；4)重復上述步驟2、和幻至少兩次力)將熒光材料與濃度為1. 5 2. 5%的聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)水溶液混合，攪拌后，將混合液加入到步驟4)中得到的納米粒子水溶液中，攪拌 2. 5 3. 5小時，離心洗滌后重新分散在水溶液中，即得雙模式光學成像探針。作為優(yōu)選，所述步驟1)中制備金納米粒子溶液所需的金納米粒子，是采用氧化還原法通過還原氯金酸HAuCl4制備的金納米粒子；制備銀納米粒子溶液所需的銀納米粒子是通過還原硝酸銀AgNO3制備的銀納米粒子。所述步驟1)的拉曼標記物為易于通過化學鍵插入或靜電作用吸附到金屬表面的拉曼標記物，該拉曼標記物具有較大拉曼散射截面。所述步驟幻中的熒光材料為有機分子熒光染料或量子點材料。 有益效果與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的雙模式光學成像探針及其制備方法具有如下優(yōu)點1、本發(fā)明利用金或銀納米粒子聚集體作為SERS基底，與傳統(tǒng)的以單個金或銀納米粒子為增強基底的SERS探針相比，SERS信號明顯增強；2、本發(fā)明利用拉曼標記物誘導生成的金或銀納米粒子聚集體作為SERS基底，與傳統(tǒng)的加入聚集劑(如NaCl等)形成聚集體的方法相比，這種直接誘導聚集的方法具有更好的可控性和重復性；3、本發(fā)明的制備方法操作簡單、可重復性好、成本低廉并且環(huán)境友好，金納米粒子、熒光材料和拉曼標記物也只需要極少量就可以完成探針的制備；4、本發(fā)明的雙模式光學成像探針兼具表面增強拉曼信號和熒光信號，靈敏度高， 易于實現(xiàn)光學探針的多功能，在藥物靶向運輸、生物傳感及探測等應用領域具有重要的應用價值。


圖1是拉曼標記物DTNB誘導形成的金納米聚集體的消光譜；圖2是雙模式光學成像探針的納米粒子的結構示意圖；圖3是以羅丹明6G為熒光材料并以DTNB分子為拉曼標記物的雙模式光學成像標記在溶液中的熒光光譜；圖4是以羅丹明6G為熒光材料并以DTNB分子為拉曼標記物的雙模式光學成像標記在溶液中的SERS光譜；圖5是以羅丹明6G為熒光材料并以DTNB分子為拉曼標記物的雙模式光學成像標記在Hela細胞中的熒光成像；圖6是以羅丹明6G為熒光材料并以DTNB分子為拉曼標記物的雙模式光學成像標記在Hela細胞中的SERS光譜。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作更進一步的說明。實施例1和實施例2以金納米粒子作為SERS基底，以5，5_ 二硫代雙硝基苯甲酸)DTNB作為拉曼標記物，以羅丹明6G作為熒光材料為例進行說明。實施例1制備以羅丹明6G為熒光材料并以DTNB分子為拉曼標記物的雙模式光學成像標記，該方法包括如下步驟1)實驗采用Frens報道的方法制備金膠溶液。在劇烈攪拌下，將4mL檸檬酸水溶液(濃度為)加入沸騰的IOOmL氯金酸水溶液(濃度為10_4g/mL)中，持續(xù)攪拌并維持沸騰20分鐘得到金納米粒子水溶液，粒子的平均粒徑為15nm。將0. 2mL拉曼標記物DTNB 的水溶液加入20mL金納米粒子溶液中，使其終濃度為10_5 10_6M，混合攪拌15分鐘，可以觀察到溶液的顏色由紅色變?yōu)樗{色，即通過DTNB的誘導作用形成了金納米聚集體。圖1為該金納米聚集體的消光譜，其中在650nm處出現(xiàn)的吸收峰表明金納米粒子已經(jīng)形成了聚集體。2)在步驟1)的金納米聚集體的水溶液中加入3mL濃度為2%的PDDA水溶液，攪拌2小時后離心洗滌并重新分散在水溶液中；3)加入3mL濃度為2%的PSS水溶液，攪拌2小時后離心洗滌并重新分散在水溶液中；4)重復上述步驟2~)加入PDDA和步驟幻加入PSS的步驟兩次，得到最外層為PSS 包裹的金納米聚集體；5)將熒光材料羅丹明6G的水溶液與濃度為2%的PDDA水溶液混合(羅丹明6G 的終濃度為10- ，攪拌3小時；然后，取3mL上述混合液并加入到步驟4)得到的PSS包裹的金納米聚集體的水溶液中，攪拌3小時；離心洗滌后重新分散在水溶液中，即得雙模式光學成像探針。如圖2所示，該雙模式光學成像探針，包括分散于水溶液中的納米粒子，每個納米粒子包括核體1和包裹層，核體1為金納米聚集體，包裹層為交替吸附的多層聚二烯丙基二甲基氯化銨2和聚苯乙烯磺酸鈉3，包裹層最外層為吸附有熒光材料4的聚二烯丙基二甲基氯化銨2。熒光材料4為羅丹明6G。該雙模式光學成像探針的熒光通過熒光光譜儀探測，如圖3所示，激發(fā)波長為 540nm。探測SERS光譜時，將雙模式光學成像探針滴于硅片上，并固定在共焦拉曼光譜儀上，如圖4所示。激光源為633nm的氬離子激光器，樣品上的照射功率為1. 2mW，積分時間為
530s。該標記既有熒光又有信噪比很高的SERS信號，兩種光學信號可以通過選擇不同的激發(fā)波長進行切換，適用于生物成像和靶分子探測。實施例2雙模式光學成像探針在活細胞中的熒光以及SERS特性(以羅丹明6G為熒光材料并以DTNB分子為拉曼標記物的探針為例)1)將宮頸癌細胞(HeLa)置于培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)(37°C，5% CO2)。M小時后， 將雙模式成像探針的水溶液按體積比(3 1)加入細胞培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，并且重新置于培養(yǎng)箱內(nèi)。探針通過被細胞吞噬而進入細胞內(nèi)部。1.5小時之后，吸出培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBQ清洗細胞3次以去除未被細胞吞噬而殘留在培養(yǎng)基中的雙模式成像探針，待用。2)將用緩沖液沖洗過的細胞置于共焦顯微鏡的載物臺上，以M3nm為激發(fā)波長， 以560nm 640nm為接收波長范圍，得到其細胞熒光成像圖，如圖5所示。細胞在吞噬雙模式成像探針之后仍然保持良好的形態(tài)。3)選定一個細胞區(qū)域測量細胞內(nèi)的SERS光譜，選用633nm為激發(fā)波長，積分時間為60s。測得的SERS光譜如圖6所示。可以看出，雙模式成像探針在活細胞內(nèi)仍然保持了很高的SERS靈敏度。該雙模式成像探針可以通過吞噬等方式進入活細胞內(nèi)部，具有良好的化學穩(wěn)定性和生物兼容性。在活細胞內(nèi)部仍然保持了其熒光和SERS兩種光學信號的特性，適用于生物成像領域。實施例3以銀納米聚集體作為SERS基底，制備以碲化鎘(CdTe)量子點為熒光材料并以 4-巰基苯甲酸分子(4MBA)為拉曼標記物的雙模式光學成像標記，該方法包括如下步驟1)實驗采用Lee和Meisel報道的方法制備銀膠溶液。將1. OX 10_2M硝酸銀溶液按照與欲得到的銀膠溶液體積比1 10加入去離子水中，攪拌并加熱至沸騰。將檸檬酸鈉溶液按照與欲得到的銀膠溶液體積比1 50加入到沸騰的硝酸銀溶液中，持續(xù)攪拌并加熱沸騰40分鐘得到銀膠溶液。將0. 2mL 4MBA的水溶液加入20mL銀納米粒子溶液中，使其終濃度為10_5 10_6M，混合攪拌30分鐘，可以觀察到溶液的顏色由深綠色變?yōu)闇\褐色， 即通過4MBA的誘導作用形成了銀納米聚集體。2)在步驟1)的銀納米聚集體的水溶液中加入3mL濃度為2 %的PDDA水溶液，攪拌2小時后離心洗滌并重新分散在水溶液中；3)加入3mL濃度為2%的PSS水溶液，攪拌2小時后離心洗滌并重新分散在水溶液中；4)重復上述步驟2~)加入PDDA和步驟幻加入PSS的步驟五次，得到最外層為PSS 包裹的銀納米聚集體；5)將熒光材料CdTe量子點的水溶液與濃度為2 %的PDDA水溶液混合(CdTe量子點的終濃度為10- ，攪拌2小時；然后，取3mL上述混合液并加入到步驟4)得到的PSS包裹的銀納米聚集體的水溶液中，攪拌3小時；離心洗滌后重新分散在水溶液中，即得雙模式光學成像探針。如圖2所示，該雙模式光學成像探針，包括分散于水溶液中的納米粒子，每個納米粒子包括核體1和包裹層，核體1為銀納米聚集體，包裹層為交替吸附的多層聚二烯丙基二甲基氯化銨2和聚苯乙烯磺酸鈉3，包裹層最外層為吸附有熒光材料4的聚二烯丙基二甲基氯化銨2。熒光材料4為碲化鎘(CdTe)量子點。上述方法制成的雙模式光學成像探針的熒光通過熒光光譜儀探測，激發(fā)波長為 400nm。探測SERS光譜時，將雙模式光學成像探針滴于硅片上，并固定在共焦拉曼光譜儀上。激光源為633nm的氬離子激光器，樣品上的照射功率為1. 2mW，積分時間為30s。該標記既有熒光又有信噪比很高的SERS信號，兩種光學信號可以通過選擇不同的激發(fā)波長進行切換，適用于生物成像和靶分子探測。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種雙模式光學成像探針，其特征在于包括分散于水溶液中的納米粒子，每個納米粒子包括核體(1)和包裹層，所述核體(1)為金納米或銀納米聚集體，所述包裹層為交替吸附的多層聚二烯丙基二甲基氯化銨(2)和聚苯乙烯磺酸鈉(3)，包裹層最外層為吸附有熒光材料(4)的聚二烯丙基二甲基氯化銨(2)。
2.根據(jù)權利要求2所述的雙模式光學成像探針，其特征在于所述熒光材料(4)為有機分子熒光染料或量子點材料。
3.一種制備權利要求1或2所述的雙模式光學成像探針的方法，其特征在于包括以下步驟1)制備金納米粒子溶液或銀納米粒子溶液，將拉曼標記物加入金納米粒子溶液或銀納米粒子溶液，混合10 20分鐘，形成拉曼標記物誘導的金納米聚集體或銀納米聚集體；2)在金納米聚集體或銀納米聚集體的水溶液中加入2 4mL濃度為1.5 2. 5%的聚二烯丙基二甲基氯化銨水溶液，攪拌1. 5 2. 5小時后離心洗滌并重新分散在水溶液中；3)加入與步驟2)中聚二烯丙基二甲基氯化銨水溶等體積等濃度的聚苯乙烯磺酸鈉水溶液，攪拌1. 5 2. 5小時后離心洗滌并重新分散在水溶液中；4)重復上述步驟2)和3)至少兩次；5)將熒光材料與濃度為1.5 2. 5%的聚二烯丙基二甲基氯化銨水溶液混合，攪拌后， 將混合液加入到步驟4)中得到的納米粒子水溶液中，攪拌2. 5 3. 5小時，離心洗滌后重新分散在水溶液中，即得雙模式光學成像探針。
4.根據(jù)權利要求3所述的制備雙模式光學成像探針的方法，其特征在于所述步驟1) 中制備金納米粒子溶液所需的金納米粒子，是采用氧化還原法通過還原氯金酸HAuCl4制備的金納米粒子；制備銀納米粒子溶液所需的銀納米粒子是通過還原硝酸銀AgNO3制備的銀納米粒子。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備雙模式光學成像探針的方法，其特征在于所述步驟1) 的拉曼標記物為易于通過化學鍵插入或靜電作用吸附到金屬表面的拉曼標記物。
6.根據(jù)權利要求3所述的制備雙模式光學成像探針的方法，其特征在于所述步驟5) 中的熒光材料為有機分子熒光染料或量子點材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雙模式光學成像探針及其制備方法，該探針包括分散于水溶液中的納米粒子，每個納米粒子包括核體和包裹層，核體為金納米或銀納米聚集體，包裹層為交替吸附的多層聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)和聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)，包裹層最外層為吸附有熒光材料的PDDA；其制備方法包括制備拉曼標記物誘導的金或銀納米聚集體，然后在其水溶液中加入PDDA水溶液、攪拌，再交替吸附PSS和PDDA數(shù)次，然后加入熒光材料與PDDA水溶液等步驟。本發(fā)明的雙模式光學成像探針兼具表面增強拉曼信號和熒光信號，靈敏度高，易于實現(xiàn)光學探針的多功能，在藥物靶向運輸、生物傳感及探測等領域具有重要的應用價值；其制備方法操作簡單、可重復性好、成本低廉并且環(huán)境友好。
文檔編號G01N21/65GK102175655SQ20101060308
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權日2010年12月24日
發(fā)明者宗慎飛, 崔一平, 王著元, 陳輝 申請人:東南大學