專利名稱：一種牛奶中新霉素殘留的一步elisa檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種針對(duì)牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法，屬于免疫分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
新霉素(neOmyCin，NE0)是由鏈霉素菌屬弗氏鏈霉菌產(chǎn)生的多組分抗生素，含新霉 素B和C兩種同分異構(gòu)體(結(jié)構(gòu)式如下所示)，但只有新霉素B具有抗菌活性。新霉素為水溶 性的堿性抗生素，市場(chǎng)上常用制劑為白色或類白色粉末狀的硫酸新霉素，具有較強(qiáng)的吸濕 性，長(zhǎng)期暴露在空氣中會(huì)因?yàn)槲账侄苯?。而新霉素本身具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，對(duì)與酸， 堿，熱等環(huán)境因素的耐受性明顯強(qiáng)于其它抗生素。新霉素極易溶于水，但幾乎不溶于乙醇、 乙醚、丙酮或氯仿等有機(jī)溶劑中，具有旋光活性。
權(quán)利要求
1.一種牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法，其特征在于包括新霉素抗原的合成 與鑒定，新霉素抗血清效價(jià)的測(cè)定和新霉素抗血清特異性的檢測(cè)；(1)新霉素抗原的合成利用戊二醛法合成新霉素免疫原和包被原；(2)新霉素免疫原的鑒定利用步驟(1)得到的新霉素免疫原，通過(guò)紅外光譜法和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺 凝膠電泳法SDS-PAGE對(duì)抗原進(jìn)行鑒定；(3)制備新霉素抗血清利用步驟(1)得到的新霉素免疫原，通過(guò)免疫制備抗新霉素抗血清，即新霉素抗體；(4)新霉素抗體效價(jià)的測(cè)定利用步驟(3)得到的新霉素抗體，利用新霉素包被原包被酶標(biāo)板，通過(guò)間接ELISA法測(cè) 定新霉素抗體的效價(jià)；(5)新霉素抗體特異性的測(cè)定利用步驟(3)得到的新霉素抗體，根據(jù)步驟(4)所得新霉素抗體的效價(jià)和最適工作濃 度，利用一步ELISA法檢測(cè)新霉素抗體的特異性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法，其特征在于新霉 素抗原免疫原和包被原的合成①稱取80mg新霉素NE0，40mg牛血清白蛋白BSA或卵清蛋白OVA溶于10 mL、0. 01 mol/L的磷酸鹽緩沖液中；②充分溶解后逐滴加入1.5mL質(zhì)量濃度1%戊二醛溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30 min ；③加入112mg NaBH4,4°C冰箱中靜置Ih ；④反應(yīng)液用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液透析3天，間隔他換液；所得NEO-BSA偶聯(lián)物為免疫原，所得NEO-OVA偶聯(lián)物為包被原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法，其特征在于利用 紅外光譜法進(jìn)行新霉素免疫原的鑒定①分別稱取NEO標(biāo)準(zhǔn)品，BSA和NEO-BSA樣品各2mg ；②分別加入干燥的溴化鉀KBr200 mg，混合物置于瑪瑙研缽中，在紅外燈照射下混勻、 充分研磨；③裝入壓片模具，在10噸壓力下壓片10min，制得厚度1 mm的透明KBr藥品壓片；④分別制取相應(yīng)的KBr-NEO，KBr-BSA,及KBr-NEO-BSA3塊樣品壓片，隨后上紅外光 譜儀測(cè)試鑒定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法，其特征在于利用 SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行新霉素免疫原的鑒定①分離膠10%，濃縮膠5%，電壓100V，電流20mA，電泳時(shí)間1.5h ；②固定液為12.5%的三氯乙酸溶液，固定30min ；③含0.1%考馬斯亮藍(lán)G250的固定液染色I(xiàn)h ；④超低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量分別為兔肌球蛋白200000、鈣調(diào)蛋白130000、兔磷酸 化酶B 97400、牛血清白蛋白66200、兔肌動(dòng)蛋白43000 ；將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線；⑤當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)在SDS-PAGE電泳中的遷移率和它的分子 量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式log(Mw)=k-bXRf，式中Mw為蛋白質(zhì)分子量，&為遷移率， k、b均為常數(shù)，將未知分子量的待測(cè)蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)它的電 泳遷移率在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其分子量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法，其特征在于制備 新霉素抗血清，并進(jìn)行新霉素抗體效價(jià)的測(cè)定①包被將新霉素包被原NEO-OVA用包被緩沖液作系列梯度稀釋后加入96孔酶標(biāo)板 中包被，100 yL/孔，于4 °C冰箱過(guò)夜，次日取出酶標(biāo)板回至室溫，甩干，每孔注入200 μ L 0. 01mol/L PBST溶液作為洗滌液，水平搖床上振蕩3min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍 干，重復(fù)洗滌3次，以下洗滌方法相同；②封閉充分洗滌后，加入0.OlM的PBST封閉液封閉酶標(biāo)板，200 1117孔，于371烘箱 內(nèi)溫育池后，重復(fù)洗滌3次，放入烘箱中IOmin烘干后取出待用；③競(jìng)爭(zhēng)將抗新霉素陽(yáng)性抗血清稀釋系列梯度，對(duì)應(yīng)加入到酶標(biāo)板7行，第8行加入陰 性血清，100 μ L/孔，37 °C孵育30min后洗滌、拍干；④加二抗每孔加入100111^，1:3000稀釋的酶標(biāo)二抗!11^-186，37 °C烘箱中孵育30 min后洗滌、拍干；⑤顯色每孔加入100μ L顯色液，TMB與底物緩沖液體積配比為1:5，37 ！烘箱暗處 反應(yīng)15 min ；⑥終止取出后每孔加入100μ L終止液，即2 mol/L的硫酸，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處 的吸光值A(chǔ)45tl;選擇陽(yáng)性血清的A45tl值在1. 5-1. 9，同時(shí)與陰性血清的A45tl值差距最大的包被原稀釋濃 度、抗體稀釋濃度為最佳工作濃度；陽(yáng)性血清的A45tl彡陰性對(duì)照孔的2. 1倍，并且A45tl大于0. 1，此時(shí)血清的稀釋倍數(shù)即為 血清的效價(jià)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法，其特征在于利用 一步ELISA法進(jìn)行新霉素抗體特異性的測(cè)定①包被取兩條8孔的酶標(biāo)板，以工作點(diǎn)檢測(cè)所選擇出來(lái)的最佳包被濃度對(duì)包被原進(jìn) 行系列梯度稀釋并進(jìn)行包被，100 μ L/孔，設(shè)置兩個(gè)對(duì)照，置于4°C冰箱保存過(guò)夜，PBST洗 液洗滌三次，每次3 min，拍干；②封閉以0.OlM的PBST封閉液封閉，200 μ L/孔，置于4°C冰箱保存過(guò)夜，PBST洗 液洗滌三次，每次3 min，拍干；③競(jìng)爭(zhēng)第一排加抗體稀釋液，第二排起分別加7個(gè)濃度的新霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，50μ L/ 孔，以工作點(diǎn)檢測(cè)所選擇最佳稀釋濃度稀釋抗體，50 μ L/孔添加，同時(shí)各孔均加入1:3000 稀釋的酶標(biāo)二抗，100 μ L/孔，于振蕩器上充分振蕩，37°C放置30 min，PBST洗液洗滌五次， 每次3 min，拍干；④顯色加入顯色液，底物緩沖液與TMB體積比5:1,100μ L/孔，37°C反應(yīng)15 min ；⑤終止加終止液，2mol/L濃硫酸，100 μ L/孔，酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔吸光度；⑥求出各濃度的B/B0:B/B0=B征值/B0校正值；B校正值=Ab實(shí)測(cè)均值—Ab空白均值Β?！鼎苔蔀樾旅顾貥?biāo)準(zhǔn)品溶液添加濃度為0 ng/mL時(shí)的吸光值，即陰性對(duì)照孔的校正值； IC50為達(dá)到吸光值為最大吸光值A(chǔ)max —半時(shí)所添加的的新霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度，以Bz^l為 縱坐標(biāo)，以新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液添加的系列梯度濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)在EXCEL上作圖，即 得新霉素的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
全文摘要
一種牛奶中新霉素殘留的一步ELISA檢測(cè)方法，屬于免疫分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用戊二醛法將新霉素(NEO)與牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)合成新霉素抗原(免疫原NEO-BSA或包被原NEO-OVA)，利用紅外光譜法和SDS-PAGE凝膠電泳法對(duì)NEO-BSA進(jìn)行鑒定，通過(guò)免疫獲得新霉素抗血清，并用間接ELISA法檢測(cè)其效價(jià)，通過(guò)一步ELISA法對(duì)新霉素抗血清的特異性進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明相對(duì)于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，由于極大地縮短了新霉素抗體特異性的檢測(cè)時(shí)間，并且具有很高的靈敏度，達(dá)到了簡(jiǎn)單、快速、靈敏的檢測(cè)牛奶中的新霉素殘留，可廣泛的用于快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N27/447GK102128923SQ201010604438
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者匡華, 屈昌龍, 徐麗廣, 徐乃豐, 王利兵, 胥傳來(lái), 馬偉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)