專利名稱：三聚氰胺快速現(xiàn)場檢測試劑及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品及飼料安全監(jiān)測中三聚氰胺的快速定性檢測技術(shù)，特別涉及一種 乳粉、蛋白粉、動物飼料和液體乳制品中三聚氰胺快速現(xiàn)場檢測試劑及檢測方法。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(Mel)是一種用途廣泛的具有氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)的有機化工原料，因其結(jié)構(gòu)中 不僅有氮雜環(huán)且含有多個氨基氮，使其含氮量高達66%以上，因此Mel被一些不法商販添 加到商品中以虛高商品蛋白含量。2007年美國發(fā)生的貓狗寵物非正常死亡事件以及2008 年國內(nèi)的奶粉事件都由此造成。目前，檢測Mel的主要方法是高壓液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用和氣質(zhì)聯(lián)用等，不僅對儀 器、操作人員素質(zhì)及實驗室要求都很高，檢測費時且運行費用高，也難以滿足現(xiàn)代食品安全 現(xiàn)場監(jiān)測對檢測方法簡單、快速、便攜的要求。自從2008年國家征集Mel快速監(jiān)測方法以來，有數(shù)十個Mel檢測專利技術(shù)問世， 其中大部分是采用免疫學(xué)原理而研發(fā)的ELISA試劑盒，檢測特異性強，敏感度相對高，但試 劑盒制備中涉及Mel完全抗原的制備、動物免疫、Mel與酶的交聯(lián)等復(fù)雜程序，試劑成本價 格高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種對奶粉、蛋白粉、飼料以及酸奶、鮮乳等樣品中 Mel進行簡單、快速的定性檢測、價格低廉、適宜于非專業(yè)人員操作的便攜式三聚氰胺快速 現(xiàn)場檢測試劑。本發(fā)明的第二個目的在于提供一種采用該檢測試劑進行三聚氰胺快速現(xiàn)場檢測 的方法。為達到上述目的，本發(fā)明三聚氰胺快速現(xiàn)場檢測試劑包括三聚氰胺提取劑和三聚 氰胺指示劑，所述提取劑由20-25g/100mL的三氯乙酸水溶液與A1C13、ZnCl2或MgCl2混合 而成，三聚氰胺提取劑中Al、Si或Mg的離子濃度為10-30mmol/L，所述三聚氰胺指示劑為 CuCl2的飽和水溶液。本發(fā)明的檢測方法包括如下步驟1)提取劑制備向20-25g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入A1C13、ZnCl2或MgCl2 得提取劑，提取劑中Al、Si或Mg的離子濃度為10-30mmol/L ；2)指示劑制備配制CuCl2的飽和水溶液作為指示劑；3)提取將液態(tài)試樣與提取劑按3-4 1的體積比充分混合得提取液，去除提取 液中的沉淀得待檢測液；4)檢測和結(jié)果判讀將指示劑與待檢測液按1 20的體積比混勻，若混勻后的溶 液為天藍色渾濁液，則說明試樣中含有三聚氰胺，濁度越高則含量越大，含量低于30mg/kg 的待檢測液則為清澈透亮的天藍色溶液。
所述液態(tài)試樣包括液態(tài)樣品以及35_50g/100mL的固態(tài)樣品水溶液。所述提取液中沉淀的去除方法為將提取液超聲處理2分鐘，然后于4000g離心力 下離心3-5分鐘；或者用經(jīng)過4-5倍稀釋的提取劑潤濕濾紙，然后用潤濕的濾紙過濾提取液。本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在1)與國標檢測方法相比，本發(fā)明的檢測原理不同于色普分析，對設(shè)備要求低耗資 少，而且大大提高檢測效率，節(jié)省勞動量。國標法(高壓液相色譜法等)除過需要昂貴的設(shè) 備和專業(yè)的操作人員外，過程步驟復(fù)雜，一個樣品檢測需數(shù)小時才能完成；本檢測方法無需 設(shè)備，檢測試劑廉價、簡單，而且檢測時間縮短到10-20分鐘，滿足科技部對快速檢測方法 的時間(30分鐘)要求。2)本檢測方法可組裝成試劑盒，檢測方便快捷。由于檢測試劑簡單、檢測組件體積 小巧，依此組裝的試劑盒小巧便攜；檢測方法簡單；沉淀反應(yīng)快速，適合于現(xiàn)場快速報告； 結(jié)果鮮明便于目測辨別，使用極其方便簡單，大大簡化了檢測程序。滿足當前食品安全檢測 對檢測方法“簡單、快速、便攜”的要求，適合于現(xiàn)場篩查和監(jiān)督。3)本檢測方法靈敏度不高于:3mg/100mL或30mg/kg。，滿足一般檢測要求，可以作 為國標檢測的輔助手段。凡使用此法檢測結(jié)果為陽性者，均可肯定三聚氰胺摻假，無需再用 高精儀器檢測。這樣便可大大減輕工作量，減少耗資并縮短檢測時間，提高檢測效率。4)檢測對象的范圍廣，市場范圍寬，可以提供給食品安全監(jiān)管相關(guān)部門用于劣質(zhì) 產(chǎn)品篩查。


圖1為不同金屬水溶液與三聚氰胺的定性反應(yīng)；圖2為三聚氰胺分子式；圖3為Cu(II)與三聚氰胺分子間的配合體平面結(jié)構(gòu)；圖4為不同含量MEL摻假鮮乳的檢測結(jié)果；圖5為不同含量MEL摻假玉米面的檢測結(jié)果；圖6為MEL摻假酸牛乳的檢測結(jié)果；圖7為不同含量MEL摻假蛋白粉的檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。一、三聚氰胺快速現(xiàn)場檢測試劑包括三聚氰胺提取劑和三聚氰胺指示劑三聚氰胺提取劑的制備向20_25g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入A1C13、ZnCl2 或MgCl2得三聚氰胺提取劑，三聚氰胺提取劑中Al、&!或Mg的離子濃度為10-30mmol/L ；本 發(fā)明采用低濃度金屬離子破壞蛋白膠體水化膜協(xié)助三氯乙酸徹底沉淀蛋白質(zhì)，提取劑是能 沉淀蛋白質(zhì)但可溶解三聚氰胺的溶液。乳品蛋白質(zhì)完全沉淀需要采用終濃度為12g/100mL 的三氯乙酸(IS08968)；但實驗證明，此濃度不適宜于三聚氰胺檢測，因為10g/100mL以上 濃度的三氯乙酸將會導(dǎo)致三氯乙酸共沉，因而可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。本發(fā)明在多次實驗基 礎(chǔ)上，采用低濃度金屬離子的聯(lián)合作用，降低了蛋白質(zhì)完全沉淀對三氯乙酸的濃度要求，協(xié)助三氯乙酸在較低濃度下快速徹底沉淀蛋白，此方案未見報道。經(jīng)實驗證實該提取劑對蛋 白質(zhì)的沉淀效果十分理想，也不會使三聚氰胺產(chǎn)生沉淀。三聚氰胺指示劑的制備三聚氰胺指示劑為氯化銅的飽和溶液，參考質(zhì)量體積濃 度為75g/100mL。指示劑是可以與三聚氰胺發(fā)生特異性沉淀反應(yīng)、表現(xiàn)出肉眼可見渾濁現(xiàn)象 的溶液。二、具體的檢測操作方法1)提取劑制備向20-25g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入A1C13、ZnCl2或MgCl2 得提取劑，提取劑中Al、Si或Mg的離子濃度為10-30mmol/L ；2)指示劑制備配制CuCl2的飽和水溶液作為指示劑；3)樣品中Mel的提取此步驟目的是將樣品中的Mel抽提至提取劑中，并使樣品 中的蛋白質(zhì)和對后續(xù)檢測有干擾的物質(zhì)被沉淀除去。操作過程為，如果待檢樣為粉末狀固 體(蛋白粉、奶粉、飼料等)，首先要將其配制成35-50g/100mL的液態(tài)試樣待用。若為液體 樣品(鮮乳，發(fā)酵乳等)則直接作為液態(tài)試樣；將液態(tài)試樣與提取劑按3-4 1的大體積比 充分混合得提取液，將提取液超聲處理2分鐘，然后于4000g離心力下離心3-5分鐘，去除 沉淀并取上清液做為待檢測液，或者用經(jīng)過4-5倍稀釋的提取劑潤濕濾紙，然后用潤濕的 濾紙過濾提取液去除沉淀，取濾液作為待檢測液。4)檢測與結(jié)果判讀將指示劑與待檢測液按1 20的體積比混勻，若混勻后的溶 液為藍色渾濁液，則說明試樣為含Mel且濃度超過30mg/kg的問題乳，濁度越高，含量越大； 含量低于30mg/kg的待檢測液則為清澈透亮的天藍色溶液。所使用技術(shù)原理及產(chǎn)品工作原理本檢測過程實質(zhì)上是順序偶聯(lián)的2個選擇性沉淀反應(yīng)。首先采用提取劑從樣品中 提取溶解Mel，同時沉淀去除蛋白質(zhì)等懸浮態(tài)大分子雜質(zhì)，方便下步反應(yīng)現(xiàn)象觀察；第二步 則是用Mel特異的沉淀反應(yīng)指示提取液中究竟有沒有Mel存在。以下分別介紹待檢樣品中 雜質(zhì)和Mel的性質(zhì)及其檢測原理。1、待檢樣品的理化性質(zhì)和其中蛋白質(zhì)的沉淀原理人為添加Mel的目的都是為了虛高產(chǎn)品的蛋白含量以欺騙消費者，因此被加入 Mel的產(chǎn)品常常是對蛋白含量有要求的商品。比如動物飼料、乳制品、蛋白粉等。因此本發(fā) 明方法的檢測對象主要為蛋白質(zhì)相關(guān)食品和動物飼料。乳制品和蛋白粉中，影響Mel沉淀現(xiàn)象觀察的主要成分為蛋白質(zhì)，飼料中還包括 一些固體顆粒。按照Mel提取劑的功能要求，既不能含有導(dǎo)致Mel沉淀的任何組分，又要能 去除可溶性沉淀蛋白質(zhì)。飼料中的固體小顆?？梢酝ㄟ^離心或者過濾方便去除，而懸浮在 水溶液中的蛋白質(zhì)膠體顆粒理論上可以采用傳統(tǒng)的三氯乙酸沉淀而去除。傳統(tǒng)蛋白沉淀的三氯乙酸濃度為12% [國際標準ISO 8968-4]，但當體系中三 氯乙酸濃度超過10%時，將會和濃的Mel作用使其沉淀析出，但在7%以下時只沉淀蛋白 不沉淀Mel。本發(fā)明通過在三氯乙酸溶液中加入少量不與Mel發(fā)生作用的硬酸金屬離子， Al(III), Zn(II)和Mg(II)可以降低蛋白質(zhì)特異沉淀對三氯乙酸濃度的要求，也可加快三 氯乙酸沉淀蛋白的速度，達到低濃度三氯乙酸快速完全沉淀蛋白質(zhì)的目的。其原理是，硬酸金屬鹽不和Mel發(fā)生沉淀反應(yīng)，但硬酸金屬離子的加入促進蛋白 質(zhì)膠體的水化膜破壞，使蛋白質(zhì)分子與三氯乙酸便于直接接觸而沉淀，金屬鹽相當于催化劑的作用。三氯乙酸是蛋白質(zhì)變性劑[郭立安，閻哲，張曉楠，三氯乙酸對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 性的影響.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001. 22Q2) :p. 2113]，在水溶液中以三氯乙酸根負離子形 式存在，在酸性條件下蛋白質(zhì)帶正電荷，-NH3+基團則與三氯乙酸根負離子結(jié)合形成不溶性 三氯乙酸蛋白鹽而沉淀。2、Mel檢測用特異性沉淀原理實驗采用不同鹽離子進行了 Mel的沉淀實驗，結(jié)果如圖1所示。其中a為AICl3、b 為MgCl2、c為aiCl2、d為CuCl2和三聚氰胺的定性反應(yīng)，各組左側(cè)為純水替代三聚氰胺溶液 的空白對照。a、b、c右10mmol/L金屬鹽溶液和0. 2g/100mL三聚氰胺等體積混合液；d右， 0. lg/100mL三聚氰胺溶液中加入一滴飽和CuCl2溶液，可見Al (III)、Mg (II)、Zn (II)不能 沉淀Mel，因此可以選用其作為三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)的催化劑；而Cu(II)可導(dǎo)致Mel沉淀， 因此Cu(II)可作為提取液中Mel的檢測指示劑。Mel的結(jié)構(gòu)如圖2所示，從結(jié)構(gòu)化學(xué)基本理論可知，其6元雜環(huán)上的三個氨基 (-NH2)中的N是Sp3雜化的四面體結(jié)構(gòu)，N在四面體中心，2個H和六元環(huán)各占一個頂點，另 一個頂點是N原子上的一對孤對電子。這孤對電子具有給出電子的能力，因此可以和具有 空軌道的過渡金屬形成配合物。而六元雜環(huán)中的三個N原子，雜化方式為sp2，雜化后剩余 的一個單電子與碳的單電子形成六中心六電子的大η鍵，六個原子在一個平面上，因此環(huán) 內(nèi)N的配位能力非常弱而難以與金屬離子發(fā)生作用。雖然雜環(huán)ρ-π共軛體具有拉環(huán)外氨基N電子的作用，但鑒于環(huán)外具有足夠數(shù)量(3 個)的SP3雜化的氨基，使氨基N電子云向環(huán)內(nèi)偏向的程度不會太大，因此推測雜環(huán)外氨基 的軟硬程度與屬于交界堿的苯胺(C6H5NH2)是相當?shù)模瑢儆诮唤鐗A的范疇。根據(jù)軟硬酸堿理 論，交界酸與交界堿反應(yīng)速度快、且可形成穩(wěn)定的配合物，Cu (II)離子屬于偏軟的交界酸之 一，因此易和雜環(huán)外氨基形成配合物。Mel屬于三齒配體，從結(jié)構(gòu)化學(xué)看屬于C3點群對稱性分子，但因雜環(huán)平面的剛性結(jié) 構(gòu)，使分子內(nèi)氨基之間難以接近，環(huán)外氨基與Cu(II)金屬離子間的配合物更可能在分子間 形成，因此屬于非螯合多嚙配位體。從配位化學(xué)原理可知，非螯合多嚙配位體所形成的多核 配位化合物往往是不溶性沉淀，常作沉淀劑使用。因此可以推知，Cu(II)等交界酸金屬離 子可以將溶液中的Mel分子彼此交聯(lián)在一起，當交聯(lián)物足夠大的時候，就會形成沉淀而析 出。理論上，體系中存在的所有Mel分子都可能被交聯(lián)成超大分子結(jié)構(gòu)而沉降，因此呈現(xiàn)出 了高敏感性的特點。Cu(II)離子與N之間的配位數(shù)是4，且屬于D4h點群平面結(jié)構(gòu)，因此可推測， Cu(II)與Mel之間形成的分子間配位化學(xué)物結(jié)構(gòu)的如圖3所示。實施例1 鮮牛乳中系列濃度三聚氰胺的檢測模擬摻假乳制備分別取0. 5,2. 5、5、7· 5、10和12. 5mL的2mg/mL的三聚氰胺母 液，用鮮牛乳補足到IOOmL則形成10、50、100、150、200、250mg/L的梯度濃度的三聚氰胺模 擬摻假乳液，同時取未加三聚氰胺的鮮牛乳為陰性對照；提取劑配制向20g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入SiCl2得提取劑，提取劑中Si 離子的濃度為20mmol/L ；指示劑制備用純水配制CuCl2的飽和水溶液作為指示劑；提取分別將Mel摻假乳與提取劑按3 1的體積比充分混合得提取液，發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀，用經(jīng)過4倍稀釋的提取劑潤濕濾紙，然后用潤濕的濾紙將沉淀過濾，收集濾液；檢測將指示劑與濾液按1 20的體積比將指示劑加入濾液中混勻(分別取濾液 3mL并加入指示劑3滴(1滴相當于50uL))，當Mel含量低于30mg/kg時，溶液清澈透明，跟 陰性對照相當；當Mel含量高于30mg/kg時，溶液產(chǎn)生Mel與氯化銅反應(yīng)生成的天藍色渾 濁，渾濁度與摻假乳中Mel的含量成正相關(guān)，結(jié)果清晰可辨，結(jié)果如圖4所示。實施例2 玉米面飼料中三聚氰胺的檢測模擬摻假飼料制備稱取3份玉米面各50g，分別加入0、1和2. 5mL的2mg/mL的 三聚氰胺母液，相應(yīng)的三聚氰胺含量則為0、40和100mg/kg。充分拌勻則成為摻假玉米面。 分別加純水至總體積為IOOmL,混勻成糊狀待檢；配制提取劑向25g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入MgCl2得提取劑，提取劑中Mg 離子的濃度為30mmol/L ；指示劑制備用純水配制CuCl2的飽和水溶液作為指示劑；提取分別將糊狀待檢物與提取劑按4 1的體積比充分混合得提取液，超聲處理 2分鐘，然后在4000g離心力下離心3分鐘，收集上清液，棄去沉淀；檢測將指示劑與上清液按1 20的體積比將指示劑加入上清液中混勻(分別取 SmL上清液并加入指示劑8滴(一滴相當于50uL)混勻)，結(jié)果如圖5所示，混有Mel的兩 個待檢中出現(xiàn)天藍色渾濁，而陰性對照則清澈透明無渾濁，清晰可辨。實施例3 酸奶中三聚氰胺的檢測模擬摻假酸奶制備取IOOmL的酸奶2份，其中一份加入4mL的^iig/mL的三聚氰 胺母液，相應(yīng)的三聚氰胺含量則為80mg/mL ；另一份作為陰性對照；配制提取劑向22g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入AlCl3得提取劑，提取劑中Al 離子的濃度為lOmmol/L ；指示劑制備用純水配制CuCl2的飽和水溶液作為指示劑；三聚氰胺的提取將摻假酸奶以及陰性對照與提取劑按3. 5 1的體積比充分混 合得提取液，超聲處理2分鐘，然后在4000g離心力下離心5分鐘，分別收集上清液，棄去沉 淀；三聚氰胺的檢測將指示劑與上清液按1 20的體積比將指示劑加入上清液中混 勻(分別取5mL上清液并加入指示劑5滴(一滴相當于50uL)混勻)，結(jié)果如圖6所示，混 有Mel的兩個待檢中出現(xiàn)天藍色渾濁，而陰性對照則清澈透明無渾濁，清晰可辨。實施例4蛋白粉中三聚氰胺的檢測模擬摻假蛋白粉的制備從市場上購買蛋白粉商品，稱取6份，每份35g，給其中分 別加入0,0. 35,0. 7,1. 05、1. 4和1. 75mL的0. 2g/100mL的三聚氰胺母液，相應(yīng)蛋白粉中的 三聚氰胺含量則分別對應(yīng)為0、20、40、60、80和100mg/kg.充分拌勻則成為摻假蛋白粉。分 別加水至總體積為IOOmL,混勻成蛋白溶液待檢；配制提取劑；向25g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入AlCl3得提取劑，提取劑中Al 離子的濃度為30mmol/L ；指示劑制備用純水配制CuCl2的飽和水溶液作為指示劑；提取分別取6種糊狀待檢物與提取劑按3 1的體積比充分混合得提取液，旋震 蕩充分混勻，發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀，用經(jīng)過5倍稀釋的提取劑潤濕濾紙，然后用潤濕的濾紙將沉淀過濾，收集濾液；將指示劑與6分濾液分別按1 20的體積比將指示劑加入濾液中混勻(分別取 4mL濾液并加入指示劑4滴(一滴相當于50uL)混勻)，對比觀察，結(jié)果如圖7所示，可見， 當Mel含量低于30mg/kg時，溶液清澈透明，跟陰性對照相當；當Mel含量高于30mg/kg時， 溶液產(chǎn)生Mel與氯化銅反應(yīng)生成的天藍色渾濁，渾濁度與摻假乳中Mel的含量成正相關(guān)， Mel含量為20mg/kg的蛋白粉試樣結(jié)果介于陰陽性之間，說明該濃度接近檢測下限，陰性對 照則清澈透明無渾濁，結(jié)果清晰可辨。以上實施例說明該發(fā)明方法是可行的。
權(quán)利要求
1.三聚氰胺快速現(xiàn)場檢測試劑，其特征在于包括三聚氰胺提取劑和三聚氰胺指示 劑，所述提取劑由20-25g/100mL的三氯乙酸水溶液與AlCl3、ZnCl2或MgCl2混合而成，三聚 氰胺提取劑中Al、Si或Mg的離子濃度為10-30mmol/L，所述三聚氰胺指示劑為CuCl2的飽 和水溶液。
2.三聚氰胺快速現(xiàn)場檢測方法，其特征在于包括如下步驟1)提取劑制備向20-25g/100mL的三氯乙酸水溶液中加入AlCl3、ZnCl2或MgCl2得提 取劑，提取劑中Al、Si或Mg的離子濃度為10-30mmol/L ；2)指示劑制備配制CuCl2的飽和水溶液作為指示劑；3)提取將液態(tài)試樣與提取劑按3-4 1的體積比充分混合得提取液，去除提取液中 的沉淀得待檢測液；4)檢測和結(jié)果判讀將指示劑與待檢測液按1 20的體積比混勻，若混勻后的溶液為 天藍色渾濁液，則說明試樣中含有三聚氰胺，濁度越高則含量越大，含量低于30mg/kg的待 檢測液則為清澈透亮的天藍色溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述三聚氰胺快速現(xiàn)場檢測方法，其特征在于所述液態(tài)試樣包括 液態(tài)樣品以及35-50g/100mL的固態(tài)樣品水溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述三聚氰胺快速現(xiàn)場檢測方法，其特征在于所述提取液中沉淀 的去除方法為將提取液超聲處理2分鐘，然后于4000g離心力下離心3-5分鐘；或者用經(jīng) 過4-5倍稀釋的提取劑潤濕濾紙，然后用潤濕的濾紙過濾提取液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種三聚氰胺快速現(xiàn)場檢測試劑及檢測方法，向20-25％的三氯乙酸水溶液中加入AlCl3、ZnCl2或MgCl2得提取劑，使其離子濃度為10-30mmol/L；配制CuCl2的飽和水溶液作為指示劑；按體積份數(shù)將4-5份液態(tài)試樣與1份提取劑充分混合得提取液，去除提取液中的沉淀得待檢測液；按體積份數(shù)將1份指示劑加入20份待檢測液中混勻，并觀察沉淀生成情況。與國標上已有的檢測方法相比，本發(fā)明的檢測原理不同于色譜分析檢測方便快捷，檢測時間縮短到10-20分鐘，本檢測方法下限不大于30mg/kg，滿足一般檢測要求，可以作為國標檢測的輔助手段，檢測對象的范圍廣。
文檔編號G01N1/34GK102141520SQ20101061614
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者張孝宗, 房磊, 楊水云, 段安虎 申請人:西安交通大學(xué)